兔血清對(duì)氧磷酶1對(duì)敵敵畏中毒大鼠大腦組織的保護(hù)作用

郭鎮(zhèn)豪，吳澤揚(yáng)，李琦，王曉鳳，陶維晨，王聰，趙敏

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院急診科，沈陽 110004）

有機(jī)磷 （organic phosphorus，OP） 化合物屬于極毒性化學(xué)物質(zhì)，目前治療方式主要是解毒劑給藥（阿托品和肟類） ，輔助以洗胃、導(dǎo)瀉、清洗皮膚及血液凈化等。對(duì)氧磷酶1 （paraoxonase 1，PON1） 具有解救OP中毒的作用，可能與抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。本研究通過建立敵敵畏 （dichlorvos，DDVP） 中毒大鼠腦組織損傷模型，探究PON1對(duì)解救DDVP中毒腦組織損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠 （250～350 g） 30只，購自北京華阜康生物科學(xué)技術(shù)有限責(zé)任公司［合格證號(hào)：SCXK （京） 2014-0004］，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院本溪實(shí)驗(yàn)基地動(dòng)物部飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑：77.5%DDVP乳油 （山東大成農(nóng)化有限公司）；膽堿酯酶 （cholinesterase，ChE） 檢測試劑盒 （南京建成生物工程研究所）；過氧化氫酶 （catalase，CAT） 測試盒 （南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶1 （superoxide dismutase 1，Sod1）抗體 （美國BioVision科技公司）；PTEN誘導(dǎo)激酶1（PTEN-inducible kinase 1，Pink1） 抗體 （美國Novus科技公司）；過氧化物還原酶6 （peroxidase reductase 6，Prdx6） 抗體 （美國Cell Signaling科技公司）；PON1（中國醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室使用層析分離純化兔血清） 。

1.1.3 主要儀器：BioTek全光譜酶標(biāo)儀；Amersham成像儀600；普通光學(xué)顯微鏡CX-41 （日本OLYMPUS公司） ，生物光學(xué)顯微鏡E800型 （日本Nikon公司） 。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備：30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組 （6只/組） ?？瞻讓?duì)照組 （A組） 予大鼠腹腔注射1 mL/kg生理鹽水；染毒組 （B組） 予大鼠15 mg/kg DDVP腹腔注射；PON1干預(yù)組 （C組） 于大鼠造模前30 min尾靜脈注射兔血清PON1 9 600 U/kg，30 min后予15 mg/kg DDVP腹腔注射；傳統(tǒng)治療組 （D組） 予大鼠15 mg/kg DDVP腹腔注射，后立即予阿托品10 mg/kg+碘解磷定45 mg/kg腹腔注射；聯(lián)合治療組 （E組）于大鼠造模前30 min尾靜脈注射兔血清PON1 9 600 U/kg，30 min后予15 mg/kg DDVP腹腔注射，之后立即予阿托品10 mg/kg+碘解磷定45 mg/kg腹腔注射。造模后立即觀察大鼠一般狀態(tài)及癥狀并記錄。

1.2.2 取材：各組大鼠造模后8 h處死，室溫靜置4 h，心臟抽取血液5 mL，3 500 r/min離心10 min后，取上清液 （血清） ，-80 ℃冰箱保存待測。之后每只大鼠以300 mL生理鹽水注射心臟灌洗，取腦組織，于冰上冠狀面中間處切去3 mm厚度大腦組織，放入標(biāo)記后于4%多聚甲醛中固定，剩余部分于冰上分離皮層大腦組織及海馬區(qū)大腦組織，分別放入EP管中，標(biāo)記后存入-80 ℃冰箱。

1.2.3 生化指標(biāo)檢測：從-80 ℃冰箱中取出各組血清，嚴(yán)格按照ChE測試盒說明書配制工作液，以雙蒸水為對(duì)照，混勻，37 ℃孵育30 s，405 nm波長連續(xù)監(jiān)測40 s，計(jì)算△A/min，根據(jù)說明書公式計(jì)算ChE活力，記錄并計(jì)算各組活力值。嚴(yán)格按照CAT試劑盒說明書配制4種試劑，在37 ℃溫度下按照說明書加樣順序操作，混勻，以雙蒸水對(duì)比，于波長405 nm，光徑0.5 cm，雙蒸水調(diào)零，測定各管吸光度，按照說明書計(jì)算公式計(jì)算各組CAT活力。

1.2.4 Western blotting檢測Sod1、Pink1及Prdx6在大腦皮層和大腦海馬區(qū)中的表達(dá)：大腦皮層和大腦海馬區(qū)分別經(jīng)過冰上充分研磨、裂解后4℃ 12 000 r/min 離心30 min，取上清液測蛋白濃度，變性后電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉3 h，洗膜后孵一抗 （Sod1、Pink1、Prdx6、β-actin） ，4℃冷房搖床上孵育過夜，洗膜，加二抗孵育，再洗膜，發(fā)光。

1.3 光鏡檢查

取出各組4%多聚甲醛固定3 d后的大腦組織，過缸脫水、透明、包埋后切片、晾片、烘片后進(jìn)行HE染色，樹脂封片，光鏡下分別觀察各組大腦皮層和海馬區(qū)形態(tài)并照相。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，比較各組大鼠血清ChE、CAT，大腦皮層及大腦海馬區(qū)Sod1、Pink1、Prdx6表達(dá)水平，計(jì)量資料以表示，每組數(shù)據(jù)先行方差齊性檢驗(yàn)，后進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠臨床表現(xiàn)

A組大鼠生命體征平穩(wěn)，未出現(xiàn)任何中毒癥狀；B組大鼠立即出現(xiàn)流涎、流淚、大小便失禁、咀嚼肌震顫、四肢肌肉震顫、呼吸急促和躁動(dòng)等中毒癥狀；C組大鼠立即出現(xiàn)輕微咀嚼肌震顫、呼吸略急促伴有輕微躁動(dòng)中毒癥狀；D組大鼠立即出現(xiàn)輕微流涎、咀嚼肌震顫、四肢肌肉震顫、呼吸急促伴有輕微躁動(dòng)中毒癥狀；E組大鼠僅出現(xiàn)輕微咀嚼肌震顫，無其他中毒癥狀。

2.2 各組大鼠血清ChE和CAT

以A組為對(duì)照，B組ChE和CAT數(shù)值下降明顯，C組下降程度較B組小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） ，D組下降程度較B組小、較C組大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） ，E組下降程度較A組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞ 0.05） 。見表1。

2.3 Western blotting結(jié)果

表1 大鼠各組血清ChE和CAT的變化Tab.1 Changes in serum ChE and CAT

1） P ＜ 0.05 vs group D；2） P ＜ 0.05 vs group B.

應(yīng)用“Quantity One”軟件分析結(jié)果顯示，以A組為空白對(duì)照組，B組表達(dá)量較A組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05）；C組表達(dá)量較A組少、較B組多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05）；D組表達(dá)量較A組、C組少，較B組多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.05）；D組較A組表達(dá)略少，多于其余3組。大腦皮層和海馬區(qū)同組之間差距較少，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞0.05） 。見圖1～3。

圖1 各組大腦皮層和海馬區(qū)Sod1、Pink1、Prdx6表達(dá)量Western blotting結(jié)果Fig.1 Western blotting of Sod1，Pink1，and Prdx6 proteins in the cerebral cortex and hippocampus

圖2 各組大腦皮層Pink1、Prdx6、Sod1表達(dá)柱狀圖Fig.2 Histogram of Pink1，Prdx6，and Sod1 expression in the cerebral cortex for each treatment group

圖3 各組海馬區(qū)Pink1、Prdx6、Sod1表達(dá)柱狀圖Fig.3 Histogram of Pink1，Prdx6，and Sod1 expression in the hippocampus in each treatment group

2.4 病理變化

以A組為對(duì)照，其余4組均出現(xiàn)不同程度損傷；B組出現(xiàn)嚴(yán)重結(jié)構(gòu)疏松，鏡下細(xì)胞嚴(yán)重水腫，出現(xiàn)較為嚴(yán)重的核固縮、空泡和脂肪變性，微血管周圍空隙增寬，神經(jīng)細(xì)胞也出現(xiàn)較嚴(yán)重水腫；C組出現(xiàn)中度結(jié)構(gòu)疏松，鏡下細(xì)胞中度水腫，少量細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、空泡和脂肪變性，神經(jīng)細(xì)胞也出現(xiàn)中度水腫，損傷較B組減輕；D組出現(xiàn)輕度結(jié)構(gòu)疏松，鏡下出現(xiàn)少量細(xì)胞水腫，偶可見核固縮、空泡和脂肪變性，神經(jīng)細(xì)胞也有輕度水腫，損傷程度輕于C組；E組出現(xiàn)極輕度細(xì)胞水腫，未見細(xì)胞核改變，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)極輕度水腫，損傷程度最輕。同組的大腦皮層和海馬區(qū)的損傷程度相似。見圖4、5。

圖4 各組大鼠大腦皮層形態(tài)學(xué)變化 ×400Fig.4 Morphological changes of the cerebral cortex in each treatment group ×400

圖5 各組大鼠海馬區(qū)形態(tài)學(xué)變化 ×400Fig.5 Morphological changes in the hippocampus of rats in each treatment group ×400

3 討論

PON在人類基因里包含PON1、PON2、PON3 3種，兔血清PON1與人類PON1高度相似［1］。DDVP按照半數(shù)致死量屬于高毒類。PON1具有抗氧化及解救OP中毒性質(zhì)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)缺乏PON1的動(dòng)物與野生型動(dòng)物相比更易OP中毒，并且已經(jīng)證明注射兔純化PON1的各動(dòng)物模型不易OP中毒［2-3］。

各組大鼠染毒后出現(xiàn)的一般狀態(tài)，可以判斷大鼠中毒嚴(yán)重程度的大小，PON1干預(yù)組中毒嚴(yán)重程度較低，優(yōu)于傳統(tǒng)治療組，但次于聯(lián)合治療組。

臨床上ChE是評(píng)判OP中毒嚴(yán)重程度的一個(gè)較為成熟的檢測指標(biāo)，具有出結(jié)果快，結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)勢。CAT是一種十分重要的抗氧化解毒酶，它將過氧化氫分解成水和分子氧。CAT基因具有持家基因的所有特征，與在物種之間高度保守的核心啟動(dòng)子相關(guān)［4-5］。本研究通過測定血清里ChE和CAT活力水平反映大鼠的中毒嚴(yán)重程度，說明PON1干預(yù)組損傷輕于傳統(tǒng)治療組。

OP中毒的神經(jīng)毒性是主要死亡原因之一，其機(jī)理尚未明確闡明。有機(jī)磷酸酯能抑制乙酰膽堿酯酶，神經(jīng)毒性主要是大腦不同區(qū)域中乙酰膽堿過度活化的結(jié)果，也是由于腦中乙酰膽堿酯酶抑制誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激所引起的。在紋狀體中觀察到高乙酰膽堿酯酶活性，隨后是海馬，小腦和皮質(zhì)。中毒造成的延遲周圍神經(jīng)病變、錐體外系癥狀和神經(jīng)精神癥狀在8 h后較明顯，因此本研究選取大腦皮層和海馬區(qū)于造模后8 h后比較其損傷程度［6-7］。

Sod1是經(jīng)典的抗氧化酶之一，在活性氧清除中發(fā)揮重要作用［8-9］。Pink1是一種抗氧化蛋白，Pink1丟失與線粒體Ca2+處理不當(dāng)、線粒體功能障礙以及神經(jīng)元的易損性增加有關(guān)［10-11］。Pink1蛋白的下調(diào)涉及線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激［12］。Prdx6是一種獨(dú)特的抗氧化酶，具有過氧化物酶和磷脂酶活性［13-14］雙重性質(zhì)。通過Western blotting方法檢測各實(shí)驗(yàn)組大腦皮層與海馬區(qū)一種傳統(tǒng)抗氧化指標(biāo)Sod1和2種新型抗氧化指標(biāo)Pink1和Prdx6的表達(dá)量，根據(jù)5組之間的對(duì)比，說明PON1干預(yù)組優(yōu)于傳統(tǒng)治療組，聯(lián)合治療組優(yōu)于傳統(tǒng)治療和PON1組，大腦皮層和海馬區(qū)的表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明PON1對(duì)于OP中毒大鼠大腦皮層和海馬區(qū)的損傷均具有保護(hù)作用。

光鏡下HE染色病理觀察顯示，細(xì)胞發(fā)生水腫，出現(xiàn)核固縮、空泡及脂肪變性，也印證了上述結(jié)論，染毒組組織損傷程度最嚴(yán)重，PON1干預(yù)組損傷程度輕于傳統(tǒng)治療組、重于聯(lián)合治療組，其病理結(jié)果與之前生化結(jié)果相一致。

綜上所述，PON1對(duì)于OP中毒大鼠大腦皮層和海馬區(qū)均具有保護(hù)作用。進(jìn)而得出兔血清PON1對(duì)DDVP中毒大鼠大腦組織具有保護(hù)作用。