云南省紅河州和德宏州吸毒人群中HIV-1/HCV共感染者HIV-1耐藥性分析

王 雨，陳 鑫，葉 梅，熊思東，鄭永唐

自1989年首次在云南省靜脈吸毒人群中暴發(fā)HIV-1后，云南省成為了中國HIV-1感染最嚴重的省份之一[1]。至2016年底，云南省累計抗HIV-1治療的患者超過8.5萬例，其中90%接受治療的感染者體內(nèi)病毒得到了抑制。然而，隨著抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物的使用，耐藥株流行比例逐漸增加[2]。最近有研究顯示云南省紅河州和德宏州未治療人群耐藥發(fā)生率分別為8.3%、12.0%[3-4]，而這2個地區(qū)治療失敗者耐藥發(fā)生率高達40%[5-6]。由于HIV-1/HCV共感染可能會影響HIV-1的治療效果，而HIV-1 pol基因是抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物作用的主要靶位，因此，我們基于pol序列對云南省紅河州和德宏州吸毒人群中HIV-1/HCV共感染者HIV-1耐藥情況進行分析，希望為該人群的抗病毒治療提供一定的科學依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2009—2010年間在中國云南省紅河州社區(qū)、戒毒所、美沙酮治療點和德宏州戒毒所、美沙酮治療點吸毒人群中篩選獲得的305例HIV-1/HCV共感染者。納入標準：HIV-1/HCV共感染，有吸毒史，年齡＞16歲，無其他基礎性疾病。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 對參與者進行訪談式問卷調(diào)查。問卷調(diào)查的內(nèi)容包括人口統(tǒng)計學基本信息（年齡、性別、民族、職業(yè)、文化程度及婚姻狀況）、高危行為（吸毒時間、共用針具情況、性伴侶數(shù)及性病感染狀況）和治療相關信息（是否用藥、開始治療時間及用藥方案）。

1.2.2 HIV-1 RNA提取 HIV-1 RNA使用羅氏公司的High Pure Viral RNA Kit試劑盒進行提取，所有操作均按說明書進行。

1.2.3 巢式PCR擴增pol基因區(qū) 使用北京寶日醫(yī)生物技術有限公司的PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA。使用北京全式金生物技術有限公司的TransTaq DNA Polymerase High Fidelity試劑盒進行巢式PCR。第1輪PCR擴增反應總體系25 μl，引物為MAW26和RT21[7]。第2輪PCR擴增反應總體系50 μl，引物為PRO-1和RT20[8]。擴增產(chǎn)物長度為1294 bp，包含蛋白酶全長[PR（1-99）密碼子]區(qū)和部分反轉(zhuǎn)錄[RT（1-300密碼子）]區(qū)。所有PCR均設置陰性對照，同時將本研究的序列與實驗室以前獲得的序列進行比對分析，以排除樣品之間的交叉污染。

1.2.4 PCR擴增產(chǎn)物電泳鑒定和測序 使用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，陽性樣本送至北京擎科新業(yè)生物技術有限公司進行序列測定。測序采用正向引物PRO-1和反向引物RT20測通。

1.2.5 序列分析 使用BidEdit、Lasergene軟件包中的SeqMan以及MEGA對序列進行整理、拼接與比對。所有序列使用HIV Databases中的Quality Control工具進行分析，對照測序峰圖修正終止密碼子和移碼突變，以確保序列讀碼框的正確性，隨后再使用美國耐藥數(shù)據(jù)庫（https://hivdb.stanford.edu/）在線分析病毒突變位點和耐藥水平（敏感、潛在耐藥、低度耐藥、中度耐藥、高度耐藥），將低度及以上耐藥記為耐藥。

1.2.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料呈正態(tài)分布，用±s表示，組間比較采用t檢驗（組間方差齊）。計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 調(diào)查對象的人口統(tǒng)計學特征 在305例HIV-1/HCV共感染吸毒者中，有202例成功獲得pol基因。其中，男性180例，女性22例，平均年齡（36.1±7.1）歲。漢族，未婚，無業(yè)，初中及以下文化者分別各占總吸毒人員的50%左右。接受藥物治療的有32例，未接受治療的有81例，其余治療信息未知的有89例。治療組的平均年齡為（38.2±6.7）歲顯著大于未治療組的（35.3±6.2）歲（t=2.262，P=0.026）。

2.2 耐藥發(fā)生率 在202例患者中，整體耐藥發(fā)生率為15.3%（31/202），其中治療組的耐藥發(fā)生率為40.6%（13/32），未治療組的耐藥發(fā)生率為8.6%（7/81），治療信息未知的耐藥發(fā)生率為12.4%（11/89）。治療組的耐藥率顯著高于未治療組（χ2=16.108，P=0.000）。對治療組與未治療組的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，小學文化水平的吸毒者的耐藥發(fā)生率顯著高于其他文化水平的吸毒者（χ2=8.847，P=0.031），而耐藥發(fā)生率在不同居住地、性別、年齡、民族、婚姻狀況、職業(yè)等方面差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 云南省紅河州和德宏州HIV-1/HCV共感染吸毒人群HIV-1耐藥性特征Table 1 HIV-1 drug resistance characteristics among HIV-1/HCV co-infected drug users in Honghe and Dehong Prefectures of Yunnan Province

2.3 耐藥位點 治療組有13例出現(xiàn)耐藥相關的突變位點，其中有4例出現(xiàn)多重耐藥突變位點；未治療組有7例出現(xiàn)耐藥相關的突變位點，其中1例出現(xiàn)多重耐藥突變位點。與核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑 制 劑（nucleoside reverse transcriptase inhibitor,NRTIs）相關的耐藥突變位點有K65R、T69D、M184V等。與非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor, NNRTIs）相關的突變位點有K103N、E138A、V179D/E、Y181C、G190A、K283N。與蛋白酶抑制劑（protease inhibitor, PIs）相關的突變位點有G48V等。與未治療組相比，治療組中出現(xiàn)的與PIs、NRTIs和NNRTIs相關的耐藥突變位點差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表2。

表2 云南省紅河州和德宏州HIV-1/HCV共感染吸毒者HIV-1耐藥突變位點匯總Table 2 Drug-resistance mutations among HIV-1/HCV co-infected drug users in Honghe and Dehong Prefectures of Yunnan Province

2.4 抗病毒藥物耐藥情況 治療組對NRTIs的耐藥例數(shù)為6例，耐藥發(fā)生率為18.8%（6/32）。其中僅對NRTIs的耐藥例數(shù)為3例，耐藥率為9.4%（3/32）；有3例同時對NRTIs和NNRTIs產(chǎn)生耐藥。治療組對NNRTIs的耐藥例數(shù)為10例，耐藥率為31.3%（10/32）。其中僅對NNRTIs的耐藥例數(shù)為7例，耐藥率為21.9%（7/32）；有3例同時對NRTIs和NNRTIs產(chǎn)生耐藥，耐藥率為9.4%（3/32）。治療組未對PIs產(chǎn)生耐藥。未治療組對NRTIs的耐藥例數(shù)為1例，耐藥率為1.2%（1/81）；對NNRTIs的耐藥例數(shù)為4例，耐藥率為4.9%（4/81）。未治療組有2例對PIs產(chǎn)生耐藥。治療組主要對奈韋拉平、依非韋倫、拉米夫定、司他夫定和恩曲他濱高度耐藥，而未治療組僅個別對沙奎那韋、依曲韋林和利匹韋林高度耐藥。見表3。

表3 云南省紅河州和德宏州HIV-1/HCV共感染吸毒者抗病毒藥物耐藥程度Table 3 The level of drug resistance among HIV-1/HCV co-infected drug users in Honghe and Dehong Prefectures of Yunnan Province

3 討 論

云南省東南部的紅河州和西部的德宏州是AIDS高流行地區(qū)，吸毒是該地區(qū)HIV-1的主要傳播途徑，且吸毒人群存在較多HIV-1/HCV共感染者，了解其HIV-1耐藥情況有助于制定AIDS治療策略。本研究對吸毒人群中HIV-1/HCV共感染者中HIV-1耐藥性進行比較分析，發(fā)現(xiàn)整體耐藥率為15.3%，其中未治療組的耐藥率為8.6%，治療組的耐藥率為40.6%。未治療組的耐藥發(fā)生率高于Chen等[9]報道的4.3%，但與其文中靜脈吸毒人群的耐藥率10.6%相近，原因可能是靜脈吸毒人群的共用針具等高危行為更容易促使耐藥株擴散至未治療人群[8]。治療組的耐藥率與Li等[10]報道的治療失敗人群耐藥率相接近。吳新華等[11]研究發(fā)現(xiàn)吸毒人群更容易發(fā)生不規(guī)范服藥，而不規(guī)范服藥是導致耐藥的主要因素。此外，由于治療組的治療時間超過1年，此時仍能從血漿中擴增病毒序列，表明治療組的病毒載量較高。因此，本研究治療組的耐藥率接近治療失敗人群的耐藥率。提示本研究的結果可能反映了紅河州和德宏州吸毒人群的耐藥情況。即HIV-1/HCV共感染者HIV-1耐藥率處于較高水平。李重熙和Rocheleau等[12-13]比較HIV-1/HCV共感染者和HIV-1單感染者耐藥發(fā)生率，均發(fā)現(xiàn)2者之間差異并無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），故納入本研究的均為HIV-1/HCV共感染的吸毒人群。

云南省主要HIV-1流行株的耐藥突變位點有D30N、L33F、D67N、K103N、Y181C、M184V、G190A、M46I/V[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)的耐藥突變位點有G48V/R、K65R、T69D、K103N、E138A、V179D/E、Y181C、M184V、G190A、K283N，與云南省的耐藥突變位點大體一致。值得注意的是，本研究在未治療組發(fā)現(xiàn)有1例特殊的突變位點G48V，它導致目前臨床應用的多種PIs（阿扎那韋、奈非那韋、沙奎那韋）的敏感性下降30～60倍[17]，該耐藥突變位點為云南省首次報道。

目前，中國AIDS抗病毒一線治療方案是2種NRTIs和1種NNRTIs的共同使用：替諾福韋/齊多夫定+拉米夫定+依非韋倫/奈韋拉平。本研究結果表明，未治療組僅對依非韋倫和奈韋拉平低度耐藥，對一線治療方案中的其他藥物均不耐藥；而治療組由于較長時間使用反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（包含NRTIs和NNRTIs），所以對一線用藥均出現(xiàn)耐藥，但未對二線用藥中的蛋白酶抑制劑克力芝（洛匹那韋+利托那韋）耐藥。因此，在該地區(qū)對吸毒人群中HIV-1/HCV共感染者進行現(xiàn)行治療方案應該仍是有效的。

研究發(fā)現(xiàn)治療組有10例（76.9%）對NNRTIs產(chǎn)生耐藥，其中50%以上對依非韋倫、奈韋拉平高度耐藥。同時還出現(xiàn)了對NRTIs和NNRTIs合并耐藥的情況。如果該人群繼續(xù)使用一線用藥，會由于耐藥而導致藥物的病毒學治療失敗。因此，對于一線抗病毒治療失敗者應迅速進入二線治療，以獲得更好的治療效果。

由于本研究的參與者均招募于戒毒所、社區(qū)或者美沙酮治療點等，故易導致用藥方案的缺失，無法對具體藥物與耐藥情況進行關聯(lián)分析。同時，由于并發(fā)癥、不良反應、病情嚴重程度等臨床數(shù)據(jù)的缺失，也無法對耐藥與臨床表現(xiàn)之間的關系進行更深入的分析，存在一定的局限性。另外，本研究進行的是橫斷面調(diào)查，不能對研究對象治療前與治療后的耐藥情況進行比較分析，無法區(qū)

分治療組部分人群的耐藥是由于原發(fā)耐藥導致的，還是由于藥物治療篩選出來的。盡管如此，本研究還是能相對客觀地展現(xiàn)出云南省紅河州和德宏州吸毒人群中HIV-1/HCV共感染者HIV-1耐藥水平，為該人群的抗病毒治療提供一定的理論指導。