參葵通脈顆粒對慢性心衰心肌重塑及TGF-β1、p-Smad3表達影響的實驗研究

潘海敏 嚴士海 周仲瑛 李七一

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京210029）

慢性心衰（chronic heart failure，CHF）是多種心臟疾病導(dǎo)致的心臟結(jié)構(gòu)或功能異常，使心室充盈或泵血障礙，以乏力、呼吸困難和液體潴留為主要臨床表現(xiàn)的復(fù)雜綜合征。CHF發(fā)病率高、預(yù)后差，當前全世界CHF患者數(shù)量高達2250萬，并且正以每年200萬左右的速度快速增長[1-2]。中醫(yī)藥在穩(wěn)定CHF患者病情、降低住院率、提高生活質(zhì)量等方面表現(xiàn)出越來越多的優(yōu)勢。參葵通脈顆粒是項目組傳承國醫(yī)大師周仲瑛教授治療CHF的臨床經(jīng)驗而創(chuàng)制的醫(yī)院制劑，前期臨床研究結(jié)果顯示參葵通脈顆粒治療CHF安全、有效，能改善心功能，抗氧化應(yīng)激[3]。本研究建立慢性心衰動物模型，觀察參葵通脈顆粒對CHF模型大鼠心肌重塑的影響，探索其可能的作用機制，為其進一步開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 12周齡SPF級雄性SD大鼠100只，體重（220±20）g，揚州大學(xué)實驗動物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境：江蘇省藥理實驗室SPF動物飼養(yǎng)室，室溫（22±2）℃，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，12h/12h光照/黑夜，室溫22～24℃，相對濕度40%～50%。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 藥物與試劑 參葵通脈顆粒，藥物組成：炙黃芪20g，靈芝20g，仙靈脾10g，桂枝10g，丹參10g，黃蜀葵10g，茯苓10g，陳皮6g。先取桂枝、陳皮置減壓濃縮罐中，加6倍量水，蒸餾提取，收集揮發(fā)液，備用。濾取多余煎液，另存?zhèn)溆谩Ｓ嘞铝端?，與上兩味藥渣合并，置多功能提取罐中，加水煎煮2次。第1次加10倍量水，浸泡0.5h，煎煮1h；第2次加8倍量水，煎煮1h。合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.20～1.22（70～75℃熱測）的清膏，備用。揮發(fā)液二次蒸餾，收集揮發(fā)油。揮發(fā)油以乙醇溶解后，加入至β-環(huán)糊精的飽和水溶液中，攪拌3h，0～4℃冷藏過夜，抽濾，收集濾餅，40℃干燥，即得包合物。另取糊精適量加入包合物，與清膏采用流化床制粒，70℃干燥，制成顆粒，即得，批號：20171012。陽性藥：鹽酸貝那普利（洛汀新），北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，批號：X2632。全蛋白抽提試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，GP250），Braford蛋白含量檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，KGA801），SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，KGP113），二抗（羊抗兔IgG，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，KGAA35）。

1.3 主要儀器 成都泰盟HX-300S動物呼吸機；CS-SP5激光掃描共聚焦顯微鏡（德國LEI-CA）；164-5051 Western電 泳 儀（美 國Bio-Rad）；UV-2540分光光度計（SHIMAZDH）；66485NC（PALL），XBT-1醫(yī)用X射線膠片（美國柯達），SH03014型低溫離心機（美國科俊儀器公司）。

2 實驗方法

2.1 造模、分組與給藥 參考課題組前期實驗方法[4]，采用腹主動脈縮窄法建立大鼠慢性心衰模型，使大鼠腹主動脈直徑減少40%～60%。另取同源SD大鼠作為假手術(shù)組，該組僅游離腹主動脈但不縮窄，其他操作與造模組相同。各組大鼠手術(shù)后每日腹腔注射青霉素8×104U/只，1次/d，連續(xù)3d，預(yù)防感染。造模成功的大鼠隨機分為模型組、陽性藥（鹽酸貝那普利）組和參葵通脈顆粒低、中、高劑量組。造模8周后，根據(jù)分組，每日給予相應(yīng)藥物灌胃，10mL/kg體重，給藥周期4周。假手術(shù)組與模型組灌胃蒸餾水；參葵通脈顆粒低、中、高劑量組分別予參葵通脈顆 粒4.32g生藥/kg、8.64g生藥/kg和17.28g生藥/kg，劑量分別為人臨床等效劑量的1/2、1和2倍；陽性藥組灌胃鹽酸貝那普利0.9mg/kg，劑量為人臨床等效劑量。

2.2 指標檢測

2.2.1 大鼠行為體征和死亡情況 每日定時觀察大鼠的生存狀態(tài)，如進食、進水、體重、呼吸、活動、精神、大小便和皮毛等。

2.2.2 心功能檢測 禁食不禁水過夜，末次灌胃后2h，稱重，1.0%戊巴比妥液（40mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥且四肢固定于手術(shù)臺，常規(guī)備皮、消毒。切開頸正中皮膚，分離氣管并插管，連接成都泰盟HX-300S動物呼吸機。鈍性分離右頸動脈，插入充滿肝素生理鹽水的PE-50聚乙烯導(dǎo)管，緩緩插入至心室腔，另一端接壓力換能器輸入生理多道儀系統(tǒng)，記錄大鼠左心室舒張期末壓（LVEDP），左心室內(nèi)壓最大上升及下降速率（±dp/dt max）。

2.2.3 左室質(zhì)量指數(shù)、心肌膠原容積分數(shù) 測完血流動力學(xué)后，迅速開胸取出心臟，冰生理鹽水洗凈，濾紙吸干，沿房室溝剪掉兩心房，剪掉主、肺動脈，緊貼室間隔右側(cè)剪下右心室游離壁，剩余部分即為左心室。稱取左心室質(zhì)量（mg），計算左心室質(zhì)量/體質(zhì)量，即左室質(zhì)量指數(shù)（LVMI）。于左心室中部沿橫軸切取0.5cm厚的心肌組織置于4%多聚甲醛中以備包埋，切片厚度4μm，用于染色。其余左心室組織切成小塊包于無菌錫紙并立即放入液氮速凍24h后置-80℃貯藏，用于Western blot檢測。標本應(yīng)用改良的Masson三色套染法，觀察心肌纖維化情況。隨機選取5個不含血管視野，IPP 6.0圖像分析系統(tǒng)計算每個視野中膠原組織所占面積百分比，取均數(shù)代表膠原面積，計算心肌膠原容積分數(shù)。

2.2.4 western blot檢測心肌轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、p-Smad3表達 嚴格按試劑盒提示提取心臟總蛋白，采用BCA法定量蛋白。取40mg蛋白，加入緩沖液變性，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，染色觀察條帶，TBST洗膜，5%脫脂牛奶TBST封閉1.0h，分別加兔抗大鼠TGF-β1、p-Smad3單克隆抗體室溫孵育2h，TBST洗膜，加二抗反應(yīng)1h，TBST洗膜，ECL發(fā)光試劑發(fā)光。采用凝膠圖像分析軟件進行吸光度掃描，將TGF-β1、p-Smad3蛋白條帶的吸光度與β-actin比值作為信號強弱比較。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 將所有數(shù)據(jù)輸入SPSS 17.0分析軟件包中，計量資料采用（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 t 檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 動物大體狀態(tài) 模型組大鼠一般情況差，表現(xiàn)為皮毛不潔，活動度差，呼吸急促，怕冷，擠作一團，足趾部皮膚顏色發(fā)紫，肢體頭面部水腫。各用藥組大鼠癥狀相對模型組減輕。

3.2 各組大鼠血流動力學(xué)參數(shù)比較 結(jié)果見表1。

3.3 各組大鼠LVMI、膠原容積指數(shù)比較 結(jié)果見表2。在對LVMI的改善方面，各給藥組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在對膠原容積指數(shù)的改善方面，陽性藥物和參葵通脈顆粒中、高劑量明顯優(yōu)于參葵通脈顆粒低劑量（P＜0.05）。

3.4 各組大鼠心肌形態(tài)比較 結(jié)果見圖1。假手術(shù)組大鼠心肌細胞排列整齊，形態(tài)正常，膠原容積指數(shù)低。模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，大量條狀、束狀膠原纖維增生，膠原容積指數(shù)顯著增加（P＜0.05）。各給藥組大鼠心肌細胞輕度肥大，肌細胞排列較整齊，有少量膠原纖維增生。

3.5 各組大鼠心肌組織TGF-β1、p-Smad3蛋白表 達比較 見表3、圖2。

4 討論

參葵通脈顆粒方中炙黃芪與靈芝共為君藥，補心氣，安心神。炙黃芪益氣養(yǎng)元、扶正祛邪、養(yǎng)心通脈、健脾利濕，為心衰之時補氣之要藥[5]。靈芝補氣安神、止咳平喘、延年益壽，用于心神不寧，失眠心悸，肺虛咳喘，虛勞短氣，不思飲食[6]。淫羊藿與桂枝共為臣藥。《本草綱目》記載“淫羊藿味甘氣香，性溫不寒，能益精氣……真陽不足者宜之”，正合心衰時心腎陽虛，失于溫運的病機[7]。桂枝既可溫扶脾陽以助運水，又可溫腎陽、逐寒邪以助膀胱氣化，而祛水濕痰飲之邪[8]。丹參、黃蜀葵花、茯苓養(yǎng)血活血利水為佐。心衰之時，心腎陽氣虧虛，不能推動血液運行，血脈不利，水飲內(nèi)停。丹參活血祛瘀、安神寧心，黃蜀葵花利尿通淋、活血、止血、消腫解毒；茯苓通過健運脾肺功能達到滲濕利水、寧心安神的功效。諸藥合用有行瘀血而新血不傷，養(yǎng)新血而瘀血不滯之功效。陳皮功在理氣健脾、燥濕化痰，用于心衰之時水濕困脾之脘腹脹滿，改善胃腸蠕動，促進諸藥吸收，為佐助藥?？v觀全方補氣溫陽，藥力強勁，扶助正氣，配合活血利水，因勢利導(dǎo)，祛邪養(yǎng)正。諸藥合用，攻補兼施，扶正不留邪，祛邪不傷正，為促進心衰之時泵功能恢復(fù)的重要藥物。

表1 各組大鼠血流動力學(xué)參數(shù)比較（）

表1 各組大鼠血流動力學(xué)參數(shù)比較（）

注： 與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與陽性藥組比較，△P＜0.05；與參葵通脈顆粒中劑量組比較，▲P＜0.05；與參葵通脈顆粒大劑量組比較，□P＜0.05。

組別 動物數(shù)（只） LVEDP（mmHg） +dP/dt Max（mmHg/s） -dP/dt Min（mmHg/s）假手術(shù)組 8 3.06±0.64 4065.96±187.31 3328.88±165.85模型組 8 17.14±1.65* 2094.12±242.53* 1566.19±178.49*陽性藥組 8 7.95±0.49# 2795.30±210.49# 2749.80±200.10#參葵通脈顆粒低劑量組 8 14.67±2.49#△▲□ 2559.93±212.76#△▲□ 1995.88±152.63#△▲□參葵通脈顆粒中劑量組 8 7.34±1.01# 3062.74±297.72# 2890.43±221.48#參葵通脈顆粒高劑量組 8 6.48±1.14#△ 3286.44±112.90#△ 2992.60±163.48#△

表2 各組大鼠LVMI、膠原容積指數(shù)比較（）

表2 各組大鼠LVMI、膠原容積指數(shù)比較（）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù)（只） LVMI（mg/g） 膠原容積指數(shù)（%）假手術(shù)組 8 1.93±0.15 1.65±0.73模型組 8 2.52±0.24* 16.49±3.37*陽性藥組 8 2.01±0.10# 4.31±1.12#參葵通脈顆粒低劑量組 8 2.09±0.14# 6.10±0.68#參葵通脈顆粒中劑量組 8 2.01±0.18# 4.83±1.20#參葵通脈顆粒高劑量組 8 1.97±0.15# 3.92±0.52#

圖1 各組大鼠心肌細胞形態(tài)（masson染色，×200）

表3 各組大鼠心肌組織TGF-β1、p-Smad3表達比較（）

表3 各組大鼠心肌組織TGF-β1、p-Smad3表達比較（）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù)（只） TGF-β1/β-actin p-Smad3/β-actin假手術(shù)組 3 0.29±0.07 0.19±0.05模型組 3 1.11±0.15* 0.85±0.12*陽性藥組 3 0.26±0.08# 0.31±0.06#參葵通脈顆粒低劑量組 3 0.51±0.08# 0.42±0.08#參葵通脈顆粒中劑量組 3 0.48±0.05# 0.40±0.05#參葵通脈顆粒高劑量組 3 0.25±0.09# 0.32±0.07#

圖2 各組大鼠心肌組織TGF-β1、p-Smad3表達

本研究結(jié)果表明，與模型組比較，參葵通脈顆粒各組LVEDP顯著降低，+dp/dt max、-dp/dt max顯著升高，提示參葵通脈顆粒對CHF具有良好的治療作用。參葵通脈顆粒中劑量、高劑量的改善作用優(yōu)于低劑量，高劑量改善作用優(yōu)于陽性藥，中劑量與陽性藥改善作用相當。LVMI結(jié)果顯示，參葵通脈顆粒可以改善CHF大鼠的心肌重塑。進一步的Masson染色驗證參葵通脈顆?？梢越档虲HF大鼠的心肌纖維化程度。

CHF發(fā)生、發(fā)展的重要的病理學(xué)機制是心肌重塑，在組織水平上呈現(xiàn)出纖維化的病理改變[9]。TGF-β1是一類功能廣泛、作用復(fù)雜的生長因子，在心肌重塑過程中，TGF-β1通過Smad3信號途徑調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)等，促進心肌纖維化[10-11]。本實驗結(jié)果顯示，參葵通脈顆粒能夠顯著抑制慢性心衰模型大鼠心肌組織中TGF-β1、p-Smad3的表達，降低心肌纖維化水平，減輕心肌重塑。后續(xù)研究將采用心肌細胞體外實驗與基因沉默等方法進一步驗證參葵通脈顆粒改善CHF心肌重塑的靶點。