外陰陰道假絲酵母菌病病原菌菌種分布及耐藥性分析

曾 文 華麗燕 歐陽凱 麥榮嘉

假絲酵母菌(candida)俗稱念珠菌，是人體皮膚黏膜的一種條件致病真菌，寄居于皮膚、口腔、胃腸道、陰道等部位,表現(xiàn)為急性、亞急性或慢性炎癥，大多為繼發(fā)性感染。因其可產(chǎn)生假菌絲而被稱為假絲酵母菌。本菌屬有81種，其中10種對人有致病性[1]。其中本院主要以白假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌等常見。陰道假絲酵母菌病主要病原菌是假絲酵母菌，常與外陰病變同時存在，故又稱外陰 陰道假絲酵母菌病(Vulvovaginal Candidiasis VVC)，是一種常反復(fù)發(fā)作的機(jī)會性真菌感染[2]。外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis, VVC)是育齡婦女常見的陰道黏膜的真菌感染性疾病，是婦科最常見疾病之一。其主要癥狀為外陰部瘙癢不適、陰道燒灼感、部分患者陰道內(nèi)分泌物異常增多，呈豆渣或凝乳狀表現(xiàn)，伴尿頻、尿痛、性交痛[3]。據(jù)統(tǒng)計，有75%以上的育齡婦女一生中至少有一次既往感染史，且有40%～50%的患者有復(fù)發(fā)史，有5%～8%的患者會發(fā)展成復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病(Recurrent vulvovaginal candidiasis, RVVC)[4]。隨著近年來抗生素濫用、不合理用藥和免疫抑制劑等藥物在臨床上的廣泛使用，VVC的發(fā)生率呈逐漸上升的趨勢，且易反復(fù)發(fā)作難以根治，嚴(yán)重干擾了婦女的日常生活以及身心健康。因此，正確了解女性外陰陰道假絲酵母菌病病原菌的分布、菌群鑒定及其耐藥特點(diǎn)，對臨床的診療及用藥起到非常大的作用。

1 研究對象和方法

1.1 研究對象

選取2017年1月1日-2017年12月31日廣東省婦幼保健院越秀院區(qū)經(jīng)婦科門診擬診為外陰陰道假絲酵母菌病的患者，其納入標(biāo)準(zhǔn)包括：①癥狀：具有陰道假絲酵母菌的典型反應(yīng)癥狀如外陰瘙癢、灼痛、性交痛，異味明顯，陰道分泌物增多等；②體征：外陰紅斑、水腫，多伴抓痕或皮膚皸裂，陰道黏膜潮紅，陰道內(nèi)可見白色黏稠呈乳膠或豆渣樣分泌物；③實(shí)驗室檢查：陰道分泌物鏡檢發(fā)現(xiàn)假菌絲和(或)真菌孢子的患者。共307例，年齡在18～50歲之間。由臨床醫(yī)生采集其陰道分泌物標(biāo)本，包括陰道分泌物涂片檢查及含有陰道分泌物的拭子。

1.2 主要試劑

結(jié)晶紫快速染液、科瑪嘉(CHROMagar)顯色平板、葡萄糖、蛋白胨粉(OXIOD)、酵母粉(OXIOD)、瓊脂(OXIOD)、ATB Fungus 3 酵母樣真菌藥敏試劑盒(微量稀釋法)。

1.3 主要儀器

全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(梅里埃，型號：VITEK2 Compact)、2HFsafe型ClassⅡ級生物安全柜、電子分析天平、 LRH-250A型細(xì)菌生化培養(yǎng)箱、漩渦振蕩器、麥?zhǔn)蠞岫葍x。

1.4 質(zhì)控菌株

白假絲酵母菌ATCC10231，購自廣東省微生物研究所。

2 方法

2.1 標(biāo)本采集

選取經(jīng)本院婦科門診擬診為外陰陰道假絲酵母菌病的307例患者的陰道分泌物，送檢標(biāo)本為陰道分泌物涂片以及陰道分泌物拭子。

2.2 陰道分泌物染色鏡檢及初步培養(yǎng)

將送檢標(biāo)本中的陰道分泌物涂片采用結(jié)晶紫染液快速染色后鏡下觀察，若發(fā)現(xiàn)菌絲或孢子則作為陽性標(biāo)本。同時，將陽性標(biāo)本的棉拭子接種入滅菌YPD液體培養(yǎng)基中(2 ml/每管)，置35 ℃培養(yǎng)24～48小時，培養(yǎng)至渾濁。

2.3 初步鑒定

將YPD液體培養(yǎng)基中的渾濁的菌液接種至念珠菌顯色平板內(nèi)，置35 ℃培養(yǎng)24～48小時，判讀結(jié)果?？片敿?CHROMagar)顯色平板上翠綠色為白色念珠菌，灰藍(lán)色為熱帶念珠菌，粉紅色粗糙菌落為克柔念珠菌，紫紅色為光滑念珠菌；如出現(xiàn)肉眼不能判別假絲酵母菌菌株，分純后由梅里埃VITEK2 Compact全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)完成待測真菌的鑒定。

2.4 藥敏試驗

按照ATB Fungus 3酵母樣真菌藥敏試驗試劑盒的操作說明，挑取分純培養(yǎng)的單個菌落，進(jìn)行藥敏試驗(微量稀釋法)。念珠菌屬需置35 ℃培養(yǎng)24±2小時后判讀結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 鏡檢結(jié)果

經(jīng)結(jié)晶紫染色后鏡檢，共307例患者陰道分泌物顯微鏡檢查可見到真菌孢子和(或)假菌絲，判斷為鏡檢陽性標(biāo)本。

3.2 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果

307例標(biāo)本均為鏡檢陽性標(biāo)本(鏡下觀察到真菌孢子和、或假菌絲)，307例標(biāo)本中YPD液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)出渾濁菌液的標(biāo)本為277例，陽性率為90.23%。

3.3 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果

將YPD液體培養(yǎng)基中的渾濁的菌液接種至念珠菌顯色平板內(nèi)，置35℃培養(yǎng)24～48小時后，念珠菌在科瑪嘉顯色平板中的結(jié)果，如圖1所示：

圖1 念珠菌在科瑪嘉顯色平板中生長，A：白色假絲酵母菌；B：光滑假絲酵母菌；C：克柔假絲酵母菌；D：近平滑假絲酵母菌；E：熱帶假絲酵母菌

3.4 277例陰道假絲酵母菌病病原菌YPD液體培養(yǎng)基陽性標(biāo)本鑒定

結(jié)果如表1所示。

表1 科瑪嘉顯色平板的鑒定結(jié)果 (n)

3.5 藥敏試驗結(jié)果

對檢出的277株陰道假絲酵母菌的藥敏結(jié)果中，可以看出陰道白色假絲酵母菌對5-氟胞嘧啶和兩性霉素B的敏感率較高，分別為84.18、100%，即陰道假絲酵母菌對5-氟胞嘧啶和兩性霉素B的耐藥率最低。陰道白色假絲酵母菌對氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑等唑類抗真菌藥物的敏感率較低，分別為69.49%、66.1%、72.88%，即陰道白假絲酵母菌對氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑的耐藥率較高。而在非白假絲酵母菌中，光滑假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌和克柔假絲酵母菌對5-氟胞嘧啶和兩性霉素B的敏感率均為100%，即5-氟胞嘧啶和兩性霉素B的敏感率仍是最高。而在光滑假絲酵母菌和近平滑假絲酵母菌對伊曲康唑的耐藥明顯，敏感率分別有30%、46.42%。詳見表2。

表2 277株假絲酵母菌屬對五種抗真菌藥物的敏感率 n(%)

注：克柔念珠菌對氟康唑天然耐藥，應(yīng)報耐藥

4 討論

陰道炎是臨床較為常見的婦科疾病之一，臨床表現(xiàn)以外陰瘙癢、灼痛、分泌物增多，異味明顯及性交痛等癥狀為主。較常見的病癥主要為外陰陰道假絲酵母菌病、細(xì)菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎等。據(jù)流行病學(xué)資料顯示，有3/4 的育齡期婦女至少有1次VVC發(fā)病史，而有10.23%的VVC患者由于反復(fù)發(fā)作轉(zhuǎn)化為RVVC，即VVC婦女經(jīng)治療后，臨床癥狀和體征消失，但真菌學(xué)檢查陰性后出現(xiàn)假絲酵母菌感染癥狀，且一年內(nèi)反復(fù)發(fā)作4次及以上[5]。除去妊娠狀態(tài)、合并糖尿病、長期使用廣譜抗生素以及免疫抑制劑等可能存在的誘發(fā)因素外,目前大部分復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病患者的復(fù)發(fā)機(jī)制尚不明確,臨床上對于本病的治療方案尚不統(tǒng)一[6]。隨著近些年來廣譜抗生素和免疫抑制劑等藥物在臨床上的廣泛使用，VVC的發(fā)生率呈逐漸上升的趨勢[7]。其原因一，病原菌種的變遷。過去一直認(rèn)為VVC主要病原菌為白色假絲酵母菌，占疾病的80%～90%，同時白色假絲酵母菌對 5-氟胞嘧啶、兩性霉素 B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑的敏感性均較好，因此臨床治療初診時缺乏菌屬鑒別。近年來，楊淑華等人的研究發(fā)現(xiàn)VVC患者中非白色念珠菌所占的比例有上升趨勢8]。氟康唑和伊曲康唑?qū)Τ咨俳z酵母菌外的其他假絲酵母菌的敏感率較低，尤其是克柔假絲酵母菌對氟康唑天然耐藥；這要求我們在實(shí)際工作中必須加強(qiáng)假絲酵母菌屬的培養(yǎng)、 鑒定和藥敏試驗的工作。其二，不規(guī)范性用藥、錯誤性用藥以及濫用抗真菌藥導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)。白色假絲酵母菌對唑類藥物的耐藥情況愈發(fā)嚴(yán)重，給臨床治療帶來了嚴(yán)重困難。當(dāng)前RVVC的臨床治療原則主要基于積極去除誘因和規(guī)范化應(yīng)用抗真菌藥物，但并未有成熟的方案[9]。本研究通過收集婦科門診擬診為外陰陰道假絲酵母菌病患者的陰道分泌物鏡檢陽性標(biāo)本307例進(jìn)行真菌分離培養(yǎng)，培養(yǎng)得到的渾濁菌液的標(biāo)本為277例，陽性率為90.23%；對于其余30例鏡檢陽性而液體培養(yǎng)陰性標(biāo)本，首先考慮假絲酵母菌屬于機(jī)會致病菌，可定植在陰道里，顯微鏡下觀察可見真菌孢子和(或)菌絲即為陽性標(biāo)本，但并不能確定是否為真正的致病菌，應(yīng)結(jié)合臨床癥狀及實(shí)驗室檢查做出相應(yīng)的診斷；其次，鏡檢存在一定的人為誤差，鏡檢陽性的判斷可能存在一定的誤差；最后，考慮真菌在空氣中分布廣泛，臨床醫(yī)生在取陰道分泌物或者在標(biāo)本的運(yùn)輸、檢測過程中，有可能存在一定的污染可能。在常規(guī)檢查中，顯微鏡檢查仍是最為簡單、經(jīng)濟(jì)、快捷而且準(zhǔn)確的檢測手段。然而，鏡下檢查欠缺區(qū)分假絲酵母菌的種類的能力，導(dǎo)致臨床診斷治療缺乏依據(jù)，臨床醫(yī)生根據(jù)經(jīng)驗用藥，尤其對非白色念珠菌所用的抗真菌藥物缺乏針對性，進(jìn)一步使抗真菌藥物的耐藥率的不斷增高，加上當(dāng)前醫(yī)療環(huán)境下不合理的抗生素使用，破壞陰道內(nèi)正常的微生態(tài)環(huán)境，導(dǎo)致外陰陰道假絲酵母菌病(RVVC)的反復(fù)發(fā)作。所以，了解病原菌的菌種分布及耐藥性分析，對指導(dǎo)臨床用藥有極大意義。目前，臨床上普遍認(rèn)為假絲酵母菌是引起陰道炎反復(fù)發(fā)作的主要原因。國內(nèi)有學(xué)者進(jìn)行陰道炎反復(fù)發(fā)作的病因分析時得出結(jié)論：反復(fù)發(fā)作、單純感染的陰道炎患者中，假絲酵母菌性陰道炎的比例為33.1%，居其病因構(gòu)成的首位。在本研究中，共培養(yǎng)出277例病原菌，其中白色假絲酵母菌177例(63.90%)，光滑假絲酵母菌62例(22.38%)，近平滑假絲酵母菌28例(10.11%)，克柔假絲酵母菌6例(2.17%)，熱帶假絲酵母菌4例(1.44%),結(jié)果符合白色假絲酵母菌是外陰陰道假絲酵母菌病的主要致病菌這一結(jié)論[10]；雖然白色假絲酵母菌的比例仍舊最高(構(gòu)成比為63.9%)，然而VVC患者非白色假絲酵母菌感染率的上升已成為不可忽視的事實(shí)。本研究結(jié)果顯示非白色假絲酵母菌的比例有明顯的增大，構(gòu)成比達(dá)到36.1%。非白色假絲酵母菌構(gòu)成比的升高的主要原因與臨床在診斷外陰陰道假絲酵母菌病時，未進(jìn)一步培養(yǎng)鑒定至具體菌種和藥敏試驗密切相關(guān)。目前，氟康唑?qū)εR床上治療陰道假絲酵母菌的首選藥物[10]。然而，克柔假絲酵母菌對氟康唑天然耐藥，光滑假絲酵母菌與近平滑假絲酵母菌對氟康唑敏感性降低都給臨床治療帶來挑戰(zhàn)；在臨床經(jīng)驗性用藥或者患者不規(guī)范用藥治療VVC時，陰道的微生態(tài)被破壞；白色假絲酵母菌被抑制，而非白假絲酵母菌未被抑制，壓力篩選下，陰道內(nèi)假絲酵母菌屬發(fā)生變遷，導(dǎo)致VVC中非白色假絲酵母菌的比例上升[11-12]。因此，增加假絲酵母菌的菌種鑒別的檢測手段，能有效的預(yù)防VVC的發(fā)病和提高RVVC的治療效果。VVC發(fā)病率有上升的趨勢,主要因為其陰道內(nèi)壞境被破壞，導(dǎo)致菌群失調(diào)，正常的乳酸桿菌活性和質(zhì)量均下降，一些條件致病菌如假絲酵母菌則快速生長導(dǎo)致VVC的發(fā)生，尤其對于長期使用廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑的患者和妊娠婦女更易感染。基于VVC的流行現(xiàn)況，臨床醫(yī)師應(yīng)根據(jù)假絲酵母菌的菌種鑒定以及其藥敏試驗結(jié)果，指導(dǎo)臨床選擇合適的抗真菌藥物以及藥物用量，能有效避免無效用藥或降低假絲酵母菌耐藥菌株產(chǎn)生的風(fēng)險。目前，唑類抗真菌藥物是臨床上主要的抗真菌感染藥物—以氟康唑、伊曲康唑為代表的第3代抗真菌藥是治療真菌感染的首選。然而，國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)白假絲酵母菌對氟康唑的耐藥問題日益顯著，對于非白假絲酵母菌的耐藥情況也有相關(guān)報道[11]。在本研究中，白假絲酵母菌屬對抗菌藥物的敏感率以兩性霉素B最高，達(dá)100%，其次為5-氟胞嘧啶為84.18%，伏立康唑為72.88%，而對氟康唑和伊曲康唑敏感率最低為 69.49%和66.1%。本研究表明，以上5種抗菌藥對于治療白色假絲酵母菌感染仍是有效的抗菌藥物,說明目前臨床使用這些抗真菌藥物有較好療效。臨床藥物治療中，由于兩性霉素B、5-氟胞嘧啶的藥物毒性較大，尤其孕婦禁用，不適合臨床治療的首選，故目前治療外陰陰道假絲酵母菌病主要以第3代抗真菌藥(氟康唑、伊曲康唑)為主，而體外敏感實(shí)驗提示這兩種唑類常用藥敏感率不高，且伊曲康唑的耐藥情況在光滑假絲酵母菌和近平滑假絲酵母菌中比較明顯，其敏感率僅為30%和46.42%，可能與近年來臨床廣泛應(yīng)用唑類藥物誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生有關(guān)。加之非白假絲酵母菌致病比例有逐年上升趨勢，并出現(xiàn)對臨床常用抗真菌藥物的耐藥現(xiàn)象，臨床治療將更復(fù)雜和困難，而VVC患者病情會反復(fù)。其中克柔假絲酵母菌對氟康唑天然耐藥，更需要進(jìn)一步將真菌鑒定到具體菌種并進(jìn)行對應(yīng)的藥敏試驗，有針對性地使用抗真菌藥物才能有效治療克柔假絲酵母菌引起的VVC。結(jié)果顯示5-氟胞嘧啶和兩性霉素B對非假絲酵母菌屬敏感性均很高，耐藥性最低，但由于對人體毒性作用大，臨床使用仍受到一定限制。

綜合比較各菌種間對藥敏試驗中所用五種抗真菌藥物的敏感程度，不同菌種對于不同抗真菌藥物的敏感率存在明顯差異，因而我們在實(shí)際臨床工作中必須加強(qiáng)外陰陰道假絲酵母菌病的菌種鑒定以及其體外藥敏試驗，根據(jù)菌種鑒定結(jié)果及藥敏結(jié)果選擇合適抗真菌藥物進(jìn)行規(guī)范治療，并且強(qiáng)調(diào)足量、足療程、必要時可聯(lián)合用藥，并且重視鞏固治療及根據(jù)醫(yī)囑及時隨訪，避免盲目使用抗真菌藥物，減少臨床耐藥菌株的出現(xiàn)。