海洋低溫脂肪酶菌株的篩選鑒定、誘變育種及酶學性質研究

魏計東， 于 爽， 張慶芳， 遲乃玉

(1.大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連 116622； 2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧大連 116622)

脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)，又稱甘油三酰酯水解酶，是一類重要的工業(yè)酶，可以在油水界面上催化甘油三酯生成脂肪酸和甘油，以及甘油一酯和甘油二酯；廣泛存在于動物、植物各種組織及微生物中，是最早研究的酶類之一[1]。低溫酶[2]的定義是最適酶活溫度在30 ℃左右，在0 ℃左右仍有一定的催化活性。低溫酶主要是低溫微生物生產，它們長期生活在低溫環(huán)境中，例如南極、北極以及海洋底部等極端環(huán)境中[3]。相比較中高溫脂肪酶，低溫脂肪酶的優(yōu)勢是在低溫條件下(0～30 ℃)具有極高的催化活力和較低的熱穩(wěn)定性[4]；在工業(yè)上的優(yōu)勢在于酶的活化能和反應最適溫度較低，可以節(jié)約資源、保護環(huán)境。低溫脂肪酶具有高效、可低溫下作用、作用周期短等優(yōu)勢[5]，在應用上具有中高溫脂肪酶無法取代的優(yōu)越性，因此在食品[6]、輕紡[7]、化妝品[8]、洗滌劑[9]、有機合成[10]、環(huán)境治理[11]以及醫(yī)藥[12]等領域有廣泛的應用前景。微生物脂肪酶種類多，作用溫度及pH值范圍比動、植物脂肪酶廣[13-14]，底物專一性高，且便于工業(yè)生產以獲得較高純度的酶制劑，已成為工業(yè)生產脂肪酶的主要來源。

本研究通過對海泥樣品中微生物的分離篩選，獲得1株產低溫脂肪酶耐冷菌株；該菌株在低溫下具有較高的活性，為提高該菌株的產酶量，應用物理化學合成誘變即紫外(UV)誘變與硫酸二乙酯(DES)誘變，并且研究了其酶學性質。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 試驗菌株液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)FS119篩選自黃海大連長?？h海域的海泥和海水樣品，后經誘變得到高產誘變菌株FS119-1，現(xiàn)由遼寧省海洋微生物工程技術研究中心保藏。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 橄欖油聚乙烯醇乳化液[15]：取4%聚乙烯醇和橄欖油按3 ∶1的比例混合均勻，于10 000 r/min乳化3 min，暫停5 min而后繼續(xù)乳化3 min。

富集培養(yǎng)基[16]：(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，NaCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，酵母膏0.5%，橄欖油0.5%，pH值自然。

平板分離培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，NaCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，瓊脂2%，pH值為8.0，121 ℃滅菌20 min。橄欖油聚乙烯醇乳化液121 ℃滅菌20 min，取12 mL橄欖油聚乙烯醇乳化液加入到100 mL上述培養(yǎng)基中即為油脂同化培養(yǎng)基。

純化培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%，瓊脂2.0%，pH值8.0。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，酵母膏0.5%，NaCl 0.1%，pH值8.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，葡萄糖0.5%，橄欖油1.0%，pH值自然。

斜面保藏培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，瓊脂2.0%，pH值8.0。

1.1.3 儀器與設備 LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；LTI-700恒溫培養(yǎng)箱：上海愛郎儀器有限公司；HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；HD-1360超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；AL-204電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；RDY-SP1Z型核酸電泳儀：北京榮陽靜電科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選 (1)富集培養(yǎng)：取1 g泥樣或1 mL水樣于20 mL帶有玻璃珠的無菌水中，使沉積物懸浮，取懸浮液 1 mL 接種到100 mL的富集培養(yǎng)基三角瓶中，20 ℃ 150 r/min培養(yǎng)3 d后轉接400 μL渾濁的菌液到新鮮的液體富集培養(yǎng)基中，連續(xù)富集3輪；(2)菌株的初篩：取0.1 mL富集菌液梯度稀釋后涂布平板分離培養(yǎng)基進行初篩，20 ℃培養(yǎng)3～7 d后觀察透明圈的大??；(3)菌株的純化：挑取初篩培養(yǎng)基上菌落周圍變色圈大的菌落，稀釋涂布于純化培養(yǎng)基上進一步純化，得到純化的單菌落；(4)菌株的復篩：將單菌落點種于分離培養(yǎng)基上，20 ℃培養(yǎng)3 d，測量透明圈直徑大??；將透明圈直徑最大的菌株接入種子培養(yǎng)基中150 r/min培養(yǎng)24 h，再以6%的接種量接到初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，在不同溫度下測定其發(fā)酵液酶活力。

1.2.2 菌株的鑒定 (1)形態(tài)學特征：參照文獻[17-18]，在菌落生長的平板上觀察單菌落的形狀、大小、透明度、顏色、邊緣和表面特征。采用革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色和鞭毛染色，用光學顯微鏡觀察菌體形狀特征。(2)生理生化特征：參照文獻[17-18]，對FS119菌株進行生理生化鑒定，包括接觸酶試驗、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗、運動型試驗、M.R和V.P試驗、檸檬酸鹽試驗、明膠液化試驗、酯酶(油脂、Tween 80)試驗、KOH拉絲試驗、好氧性試驗、氧化酶試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗、淀粉試驗、脲酶試驗。(3)菌株16S rDNA序列分析：利用UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取FS119菌基因組DNA。以菌株FS119基因組DNA為模板進行PCR擴增，而后將PCR產物交由上海生工生物工程有限公司測序，將測序結果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast序列比對，利用MEGA軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 脂肪酶活力測定 采用NaOH滴定法[19]進行低溫脂肪酶的篩選和酶活的測定；同時，選用p-NPP比色法進行驗證。

堿滴定法測定脂肪酶酶活：發(fā)酵液經10 000 r/min離心20 min，取上清液測酶活。取3個100 mL錐形瓶，分別加入 4 mL 聚乙烯醇橄欖油乳化液，5 mL 0.05 mol/L、pH值為8的磷酸鹽緩沖液，其中1個錐形瓶作為對照樣，提前加入95%乙醇15 mL，于30 ℃水浴鍋中預熱5 min。向3個錐形瓶中加入1 mL酶液，立即混勻計時10 min，向2個樣品瓶中加入15 mL 95%乙醇終止反應。向3個錐形瓶中滴加3滴酚酞作為指示劑，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定水解產生的游離脂肪酸，根據(jù)酶活公式計算酶活。酶活定義：1 mL酶液于 30 ℃、pH值8的條件下，水解脂肪1 min生成1 μmol的脂肪酸所需要的酶量定義為1個酶活力單位。

p-NPP法[20-21]，脂肪酶1個單位的定義是：在pH值為8、30 ℃條件下，作用10 min，1 min分解對硝基棕櫚酸酯釋放1 μmol對-硝基酚(p-nitrophenol)所需的酶量。

1.2.4 紫外線-硫酸二乙酯復合誘變 (1)紫外線(UV)誘變：取5 mL菌懸液轉于內徑90 mm的裝有滅菌轉子的培養(yǎng)皿中，將平皿置于紫外燈正下方18 cm處的磁力攪拌器上，先將整個平皿照射1 min后，打開皿蓋，開動磁力攪拌器[22]，每隔5 s定時取出菌液，于冰浴中保存1 h；分別取未照射的空白液和照射不同時段的菌液0.1 mL涂布于平板上，每個梯度涂布3個平板，用黑色膠袋包好于20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，計算致死率(誘變后未存活的總細胞數(shù)與未誘變存活的總細胞數(shù)的百分比)和正突變率(產量高于出發(fā)菌株產量的數(shù)量與誘變后存活的細胞數(shù)目的百分比)，通過最高的正突變率選出最佳的紫外照射時間。

(2)硫酸二乙酯誘變：吸取5 mL菌懸液于大試管中，加入體積分數(shù)2%的硫酸二乙酯(DES)5 mL，在20 ℃水浴條件下振蕩，設定不同處理時間[23]。用0.85%生理鹽水適當稀釋后涂布于油脂同化培養(yǎng)基上，每個平板上有40～50個菌落為宜。置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，根據(jù)生長出的菌落數(shù)計算致死率。

(3)紫外線-硫酸二乙酯復合誘變：根據(jù)紫外線與硫酸二乙酯單獨誘變結果，確定最佳的紫外線照射時間和硫酸二乙酯處理時間，進行復合誘變。即將紫外線在最佳時間照射后，取誘變液2 mL，立即加入硫酸二乙酯誘變劑，再繼續(xù)進行誘變[24]。稀釋后涂布于油脂同化培養(yǎng)基上，用黑紙包好，于20 ℃條件下恒溫培養(yǎng)36 h，根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑比值大小和發(fā)酵培養(yǎng)酶活的測定初步挑選產酶高的菌株。

(4)遺傳穩(wěn)定性測定：對紫外線與硫酸二乙酯復合誘變篩選出的產酶最高的菌株進行連續(xù)5代傳代培養(yǎng)，測定其酶活，并比較前后酶活力變化，確定誘變菌種的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.5 粗酶液的制備 發(fā)酵液于4 ℃ 10 000 r/min離心 20 min，取上清液作為粗酶液。向粗酶液中加入硫酸銨至10%飽和度，4 ℃放置1 h，10 000 r/min離心20 min，向上清液繼續(xù)加入硫酸銨至80%飽和度，4 ℃放置24 h，15 000 r/min 離心15 min，用Tris-HCl緩沖液溶解并透析過夜，直至除去NH4+，經硫酸銨脫鹽的低溫脂肪酶用于酶初步性質研究。

1.2.6 酶學性質研究

12.6.1 酶最適作用溫度 分別測定酶液在0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 ℃條件下的相對酶活，做3組平行試驗。

1.2.6.2 酶的熱穩(wěn)定性 將酶液分別置于0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 ℃條件下處理1 h，測定脂肪酶相對酶活，做3組平行試驗。

1.2.6.3 酶最適作用pH值 在酶最適作用溫度下，分別在pH值為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5。Tris-HCl緩沖體系中測定脂肪酶相對酶活，做3組平行試驗。

1.2.6.4 酶的pH值穩(wěn)定性 將酶液分別置于pH值為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5 Tris-HCl緩沖體系中處理24 h，測定脂肪酶相對酶活，做3組平行試驗。

1.2.6.5 金屬離子與EDTA對酶活影響 在酶最適作用條件下，向酶反應體系中各加入各種金屬陽離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Zn2+、Ba2+及乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，使各反應體系中金屬離子終濃度為10 mmol/L，測定脂肪酶相對酶活，做3組平行試驗。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

對海水、海泥樣品初篩和復篩，得到7株具有脂肪酶活力的菌株，測量透明圈直徑大小，結果見表1。獲得1株直徑比最大的菌株FS119。在不同的溫度(15、20、25、30、35、40 ℃)測定其發(fā)酵液酶活力。由表2可知，菌株FS119在20 ℃時酶活均達到最高，故此可以初步確定其為低溫菌，最適培養(yǎng)溫度為20 ℃。

表1 菌落透明圈直徑比

表2 菌株FS119在不同溫度下的發(fā)酵液酶活

2.2 菌株FS119的鑒定

2.2.1 菌株FS119形態(tài)學特征 菌株FS119菌落經革蘭氏染色，由圖1可知，菌落呈圓形菌落、呈乳白色、不透明、圓形稍突起，邊緣整齊，表面光滑、濕潤、黏稠、易挑起、質地較均勻，菌落各部分顏色一致；經光學顯微鏡觀察菌株FS119為革蘭氏染色陰性菌，菌體直桿狀，單個或成對排列，兩端較平直，端圓，直徑為0.5～0.8 μm，長0.9～2.0 μm，無芽孢，有莢膜和鞭毛，能運動。

2.2.2 生理生化特征 參照《細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株進行生理生化試驗，結果見表3。由表3可知，菌株FS119生理生化特征為：接觸酶試驗、葡萄糖的氧化發(fā)酵試驗、運動型試驗、M.R和V.P試驗、檸檬酸鹽試驗、明膠液化試驗、酯酶(油脂、Tween 80)試驗結果均為陽性；KOH拉絲試驗、好氧性試驗、氧化酶試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗、淀粉試驗、脲酶試驗結果均為陰性。由生理生化試驗結果可初步鑒定其為液化沙雷氏菌。

表3 菌株FS119生理生化特征

注：“+”陽性反應；“-”陰性反應。

2.2.3 16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 對菌株FS119進行16S rDNA序列鑒定，用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，將提取到的基因組DNA作為模版進行PCR擴增。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示PCR擴增產物序列長度為1 423 bp。將菌株FS119的16S rDNA序列輸入GenBank，與FS119的16S rDNA相似性高的菌株的16s rDNA序列進行同源性比較，對比結果用Clustal X進行多序列匹配比對，通過MEGA軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，計算出序列的系統(tǒng)進化距離，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖2。

2.3 菌株FS119的復合誘變

2.3.1 菌株FS119紫外線(UV)誘變 出發(fā)菌株FS119經紫外線照射不同時間的致死曲線如圖3所示，紫外線照射不同劑量下的誘變效果如圖4所示。由圖3、圖4可知，隨著照射時間的延長，負變率逐漸增大，不變率逐漸降低。照射時間為30 s時正變率最高，為41%。確定紫外照射30 s為最佳誘變劑量，此時致死率達87%。

2.3.2 菌株FS119硫酸二乙酯(DES)誘變 出發(fā)菌株FS119經硫酸二乙酯處理不同時間的致死曲線如圖5所示，硫酸二乙酯誘變不同劑量下的誘變效果如圖6所示。由圖5、圖6可知隨著照射時間的延長，負變率逐漸增大，不變率逐漸降低。反應時間為30 min時正變率最高，為43%。確定紫外照射30 min為最佳誘變劑量，此時致死率達92%。

2.3.3 菌株FS119紫外線與硫酸二乙酯復合誘變 將紫外照射時間為30 s篩選得到的高產菌株作為二次出發(fā)菌株，制成菌懸液，選擇致死率為92%的處理劑量繼續(xù)進行誘變，即用體積分數(shù)2%的DES處理30 min，經油脂同化培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選出透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌株復篩，經反復篩選，最終獲得1株高產誘變菌株FS119-1(圖7)，其透明圈直徑與菌落直徑比為5.21，其酶活達到24.9 U/mL，將其與原始菌株對照，其直徑比和酶活均約為原始菌株的 1.4 倍。

2.3.4 菌株FS119-1遺傳穩(wěn)定性 高產誘變菌株FS119-1在斜面上分別傳代10次后分別發(fā)酵培養(yǎng)，測定搖瓶培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵測酶活。由圖8可知，菌株FS119-1在傳代至第10代時，仍能保持一個穩(wěn)定的脂肪酶產量，說明此菌株遺傳性能穩(wěn)定。

2.4 酶學性質研究

2.4.1 酶最適作用溫度 由圖9可知，酶的最適反應溫度為30 ℃，30℃后酶活力逐漸下降，0～40 ℃酶活力保持在50%以上，0 ℃有51%的相對酶活，符合低溫酶特性，在較短的時間產生大量脂肪酶。

2.4.2 酶的熱穩(wěn)定性 由圖10可知，脂肪酶在較低的溫度(0～40) ℃下能保持良好的穩(wěn)定性，超過40 ℃后酶活力迅速下降。40 ℃以上的溫度使酶變性失活，55 ℃處理1 h可使酶活力完全喪失，表明該酶具有熱不穩(wěn)定性。

2.4.3 酶最適作用pH值 由圖11可知，酶的最適反應pH值為9，在pH值為7～9時，有50%以上的活性，表明該酶屬于堿性脂肪酶。

2.4.4 酶的pH值穩(wěn)定性 由圖12可知，低溫脂肪酶在pH值為4.0～9.5下能保持良好的穩(wěn)定性，這符合堿性脂肪酶的特性。

2.4.5 金屬離子及螯合劑對酶活的影響 由表4可知，K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+對脂肪酶的活性有明顯促進作用；Ca2+是酶活性發(fā)揮所必需的[25]，沈永強等研究表明Ca2+和脂肪酸生成的皂鈣促進了酶反應進行[26]，也有人推測Ca2+是脂肪酶的組成成分[27]；Na+、Zn2+、Fe2+、Fe3+對脂肪酶活性有微弱抑制作用，殘留酶活保持在80%以上；Cu2+、Mn2+、EDTA對脂肪酶活性有嚴重抑制作用，殘留酶活在30%以下，可能是由于這些離子與酶中心的巰基基團結合，進而引起酶失活。

3 結論

本試驗從黃海大連長?？h海域的海泥和海水樣品中初篩到7株產低溫脂肪酶菌株，對其進行酶活測定復篩，得到1株酶活較高菌株FS119，20 ℃為其最佳培養(yǎng)溫度，屬于低溫酶類。并對其進行形態(tài)學、生理生化特征、16S rDNA序列分析，鑒定菌株FS119為液化沙雷氏菌，大連海域未見有關此屬菌株海洋產低溫脂肪酶的報道。通過對液化沙雷氏菌FS119的物理化學合成誘變，即紫外(UV)誘變與硫酸二乙酯(DES)誘變，篩選出1株高產誘變菌株FS119-1，該菌株遺傳性能穩(wěn)定，酶活達到24.9 U/mL，為原始菌株的1.4倍。對高產誘變菌株FS119-1的酶學性質初步研究表明，該低溫脂肪酶的最適反應溫度為30 ℃，0 ℃時仍有酶活，熱穩(wěn)定性比較差；最適pH值為9，酸堿穩(wěn)定性良好；K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+對脂肪酶的活性有明顯促進作用，Cu2+、Mn2+、EDTA對脂肪酶活性有嚴重抑制作用，該酶在堿性條件下較為穩(wěn)定，初步判斷為堿性脂肪酶。

表4 金屬離子及螯合劑對酶活力的影響