魏計東, 于 爽, 張慶芳, 遲乃玉
(1.大連大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116622; 2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心,遼寧大連 116622)
脂肪酶(lipase,EC3.1.1.3),又稱甘油三酰酯水解酶,是一類重要的工業(yè)酶,可以在油水界面上催化甘油三酯生成脂肪酸和甘油,以及甘油一酯和甘油二酯;廣泛存在于動物、植物各種組織及微生物中,是最早研究的酶類之一[1]。低溫酶[2]的定義是最適酶活溫度在30 ℃左右,在0 ℃左右仍有一定的催化活性。低溫酶主要是低溫微生物生產,它們長期生活在低溫環(huán)境中,例如南極、北極以及海洋底部等極端環(huán)境中[3]。相比較中高溫脂肪酶,低溫脂肪酶的優(yōu)勢是在低溫條件下(0~30 ℃)具有極高的催化活力和較低的熱穩(wěn)定性[4];在工業(yè)上的優(yōu)勢在于酶的活化能和反應最適溫度較低,可以節(jié)約資源、保護環(huán)境。低溫脂肪酶具有高效、可低溫下作用、作用周期短等優(yōu)勢[5],在應用上具有中高溫脂肪酶無法取代的優(yōu)越性,因此在食品[6]、輕紡[7]、化妝品[8]、洗滌劑[9]、有機合成[10]、環(huán)境治理[11]以及醫(yī)藥[12]等領域有廣泛的應用前景。微生物脂肪酶種類多,作用溫度及pH值范圍比動、植物脂肪酶廣[13-14],底物專一性高,且便于工業(yè)生產以獲得較高純度的酶制劑,已成為工業(yè)生產脂肪酶的主要來源。
本研究通過對海泥樣品中微生物的分離篩選,獲得1株產低溫脂肪酶耐冷菌株;該菌株在低溫下具有較高的活性,為提高該菌株的產酶量,應用物理化學合成誘變即紫外(UV)誘變與硫酸二乙酯(DES)誘變,并且研究了其酶學性質。
1.1.1 菌株 試驗菌株液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)FS119篩選自黃海大連長??h海域的海泥和海水樣品,后經誘變得到高產誘變菌株FS119-1,現(xiàn)由遼寧省海洋微生物工程技術研究中心保藏。
1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 橄欖油聚乙烯醇乳化液[15]:取4%聚乙烯醇和橄欖油按3 ∶1的比例混合均勻,于10 000 r/min乳化3 min,暫停5 min而后繼續(xù)乳化3 min。
富集培養(yǎng)基[16]:(NH4)2SO40.1%,K2HPO40.1%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.05%,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%,酵母膏0.5%,橄欖油0.5%,pH值自然。
平板分離培養(yǎng)基:(NH4)2SO40.1%,K2HPO40.1%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.05%,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%,瓊脂2%,pH值為8.0,121 ℃滅菌20 min。橄欖油聚乙烯醇乳化液121 ℃滅菌20 min,取12 mL橄欖油聚乙烯醇乳化液加入到100 mL上述培養(yǎng)基中即為油脂同化培養(yǎng)基。
純化培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1.0%,NaCl 0.5%,瓊脂2.0%,pH值8.0。
種子培養(yǎng)基:蛋白胨1.0%,酵母膏0.5%,NaCl 0.1%,pH值8.0。
初始發(fā)酵培養(yǎng)基:(NH4)2SO40.1%,K2HPO40.1%,MgSO4·7H2O 0.05%,葡萄糖0.5%,橄欖油1.0%,pH值自然。
斜面保藏培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,NaCl 0.5%,瓊脂2.0%,pH值8.0。
1.1.3 儀器與設備 LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠;LTI-700恒溫培養(yǎng)箱:上海愛郎儀器有限公司;HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱:上海精宏實驗設備有限公司;HD-1360超凈工作臺:北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;AL-204電子天平:梅特勒-托利多儀器有限公司;RDY-SP1Z型核酸電泳儀:北京榮陽靜電科技有限公司。
1.2.1 菌株的篩選 (1)富集培養(yǎng):取1 g泥樣或1 mL水樣于20 mL帶有玻璃珠的無菌水中,使沉積物懸浮,取懸浮液 1 mL 接種到100 mL的富集培養(yǎng)基三角瓶中,20 ℃ 150 r/min培養(yǎng)3 d后轉接400 μL渾濁的菌液到新鮮的液體富集培養(yǎng)基中,連續(xù)富集3輪;(2)菌株的初篩:取0.1 mL富集菌液梯度稀釋后涂布平板分離培養(yǎng)基進行初篩,20 ℃培養(yǎng)3~7 d后觀察透明圈的大??;(3)菌株的純化:挑取初篩培養(yǎng)基上菌落周圍變色圈大的菌落,稀釋涂布于純化培養(yǎng)基上進一步純化,得到純化的單菌落;(4)菌株的復篩:將單菌落點種于分離培養(yǎng)基上,20 ℃培養(yǎng)3 d,測量透明圈直徑大??;將透明圈直徑最大的菌株接入種子培養(yǎng)基中150 r/min培養(yǎng)24 h,再以6%的接種量接到初始發(fā)酵培養(yǎng)基中,在不同溫度下測定其發(fā)酵液酶活力。
1.2.2 菌株的鑒定 (1)形態(tài)學特征:參照文獻[17-18],在菌落生長的平板上觀察單菌落的形狀、大小、透明度、顏色、邊緣和表面特征。采用革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色和鞭毛染色,用光學顯微鏡觀察菌體形狀特征。(2)生理生化特征:參照文獻[17-18],對FS119菌株進行生理生化鑒定,包括接觸酶試驗、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗、運動型試驗、M.R和V.P試驗、檸檬酸鹽試驗、明膠液化試驗、酯酶(油脂、Tween 80)試驗、KOH拉絲試驗、好氧性試驗、氧化酶試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗、淀粉試驗、脲酶試驗。(3)菌株16S rDNA序列分析:利用UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取FS119菌基因組DNA。以菌株FS119基因組DNA為模板進行PCR擴增,而后將PCR產物交由上海生工生物工程有限公司測序,將測序結果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast序列比對,利用MEGA軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.2.3 脂肪酶活力測定 采用NaOH滴定法[19]進行低溫脂肪酶的篩選和酶活的測定;同時,選用p-NPP比色法進行驗證。
堿滴定法測定脂肪酶酶活:發(fā)酵液經10 000 r/min離心20 min,取上清液測酶活。取3個100 mL錐形瓶,分別加入 4 mL 聚乙烯醇橄欖油乳化液,5 mL 0.05 mol/L、pH值為8的磷酸鹽緩沖液,其中1個錐形瓶作為對照樣,提前加入95%乙醇15 mL,于30 ℃水浴鍋中預熱5 min。向3個錐形瓶中加入1 mL酶液,立即混勻計時10 min,向2個樣品瓶中加入15 mL 95%乙醇終止反應。向3個錐形瓶中滴加3滴酚酞作為指示劑,用0.05 mol/L NaOH溶液滴定水解產生的游離脂肪酸,根據(jù)酶活公式計算酶活。酶活定義:1 mL酶液于 30 ℃、pH值8的條件下,水解脂肪1 min生成1 μmol的脂肪酸所需要的酶量定義為1個酶活力單位。
p-NPP法[20-21],脂肪酶1個單位的定義是:在pH值為8、30 ℃條件下,作用10 min,1 min分解對硝基棕櫚酸酯釋放1 μmol對-硝基酚(p-nitrophenol)所需的酶量。
1.2.4 紫外線-硫酸二乙酯復合誘變 (1)紫外線(UV)誘變:取5 mL菌懸液轉于內徑90 mm的裝有滅菌轉子的培養(yǎng)皿中,將平皿置于紫外燈正下方18 cm處的磁力攪拌器上,先將整個平皿照射1 min后,打開皿蓋,開動磁力攪拌器[22],每隔5 s定時取出菌液,于冰浴中保存1 h;分別取未照射的空白液和照射不同時段的菌液0.1 mL涂布于平板上,每個梯度涂布3個平板,用黑色膠袋包好于20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h,計算致死率(誘變后未存活的總細胞數(shù)與未誘變存活的總細胞數(shù)的百分比)和正突變率(產量高于出發(fā)菌株產量的數(shù)量與誘變后存活的細胞數(shù)目的百分比),通過最高的正突變率選出最佳的紫外照射時間。
(2)硫酸二乙酯誘變:吸取5 mL菌懸液于大試管中,加入體積分數(shù)2%的硫酸二乙酯(DES)5 mL,在20 ℃水浴條件下振蕩,設定不同處理時間[23]。用0.85%生理鹽水適當稀釋后涂布于油脂同化培養(yǎng)基上,每個平板上有40~50個菌落為宜。置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h,根據(jù)生長出的菌落數(shù)計算致死率。
(3)紫外線-硫酸二乙酯復合誘變:根據(jù)紫外線與硫酸二乙酯單獨誘變結果,確定最佳的紫外線照射時間和硫酸二乙酯處理時間,進行復合誘變。即將紫外線在最佳時間照射后,取誘變液2 mL,立即加入硫酸二乙酯誘變劑,再繼續(xù)進行誘變[24]。稀釋后涂布于油脂同化培養(yǎng)基上,用黑紙包好,于20 ℃條件下恒溫培養(yǎng)36 h,根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑比值大小和發(fā)酵培養(yǎng)酶活的測定初步挑選產酶高的菌株。
(4)遺傳穩(wěn)定性測定:對紫外線與硫酸二乙酯復合誘變篩選出的產酶最高的菌株進行連續(xù)5代傳代培養(yǎng),測定其酶活,并比較前后酶活力變化,確定誘變菌種的遺傳穩(wěn)定性。
1.2.5 粗酶液的制備 發(fā)酵液于4 ℃ 10 000 r/min離心 20 min,取上清液作為粗酶液。向粗酶液中加入硫酸銨至10%飽和度,4 ℃放置1 h,10 000 r/min離心20 min,向上清液繼續(xù)加入硫酸銨至80%飽和度,4 ℃放置24 h,15 000 r/min 離心15 min,用Tris-HCl緩沖液溶解并透析過夜,直至除去NH4+,經硫酸銨脫鹽的低溫脂肪酶用于酶初步性質研究。
1.2.6 酶學性質研究
12.6.1 酶最適作用溫度 分別測定酶液在0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 ℃條件下的相對酶活,做3組平行試驗。
1.2.6.2 酶的熱穩(wěn)定性 將酶液分別置于0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 ℃條件下處理1 h,測定脂肪酶相對酶活,做3組平行試驗。
1.2.6.3 酶最適作用pH值 在酶最適作用溫度下,分別在pH值為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5。Tris-HCl緩沖體系中測定脂肪酶相對酶活,做3組平行試驗。
1.2.6.4 酶的pH值穩(wěn)定性 將酶液分別置于pH值為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5 Tris-HCl緩沖體系中處理24 h,測定脂肪酶相對酶活,做3組平行試驗。
1.2.6.5 金屬離子與EDTA對酶活影響 在酶最適作用條件下,向酶反應體系中各加入各種金屬陽離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Zn2+、Ba2+及乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA),使各反應體系中金屬離子終濃度為10 mmol/L,測定脂肪酶相對酶活,做3組平行試驗。
對海水、海泥樣品初篩和復篩,得到7株具有脂肪酶活力的菌株,測量透明圈直徑大小,結果見表1。獲得1株直徑比最大的菌株FS119。在不同的溫度(15、20、25、30、35、40 ℃)測定其發(fā)酵液酶活力。由表2可知,菌株FS119在20 ℃時酶活均達到最高,故此可以初步確定其為低溫菌,最適培養(yǎng)溫度為20 ℃。
表1 菌落透明圈直徑比
表2 菌株FS119在不同溫度下的發(fā)酵液酶活
2.2.1 菌株FS119形態(tài)學特征 菌株FS119菌落經革蘭氏染色,由圖1可知,菌落呈圓形菌落、呈乳白色、不透明、圓形稍突起,邊緣整齊,表面光滑、濕潤、黏稠、易挑起、質地較均勻,菌落各部分顏色一致;經光學顯微鏡觀察菌株FS119為革蘭氏染色陰性菌,菌體直桿狀,單個或成對排列,兩端較平直,端圓,直徑為0.5~0.8 μm,長0.9~2.0 μm,無芽孢,有莢膜和鞭毛,能運動。
2.2.2 生理生化特征 參照《細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株進行生理生化試驗,結果見表3。由表3可知,菌株FS119生理生化特征為:接觸酶試驗、葡萄糖的氧化發(fā)酵試驗、運動型試驗、M.R和V.P試驗、檸檬酸鹽試驗、明膠液化試驗、酯酶(油脂、Tween 80)試驗結果均為陽性;KOH拉絲試驗、好氧性試驗、氧化酶試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗、淀粉試驗、脲酶試驗結果均為陰性。由生理生化試驗結果可初步鑒定其為液化沙雷氏菌。
表3 菌株FS119生理生化特征
注:“+”陽性反應;“-”陰性反應。
2.2.3 16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 對菌株FS119進行16S rDNA序列鑒定,用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA,將提取到的基因組DNA作為模版進行PCR擴增。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,結果顯示PCR擴增產物序列長度為1 423 bp。將菌株FS119的16S rDNA序列輸入GenBank,與FS119的16S rDNA相似性高的菌株的16s rDNA序列進行同源性比較,對比結果用Clustal X進行多序列匹配比對,通過MEGA軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析,計算出序列的系統(tǒng)進化距離,構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結果見圖2。
2.3.1 菌株FS119紫外線(UV)誘變 出發(fā)菌株FS119經紫外線照射不同時間的致死曲線如圖3所示,紫外線照射不同劑量下的誘變效果如圖4所示。由圖3、圖4可知,隨著照射時間的延長,負變率逐漸增大,不變率逐漸降低。照射時間為30 s時正變率最高,為41%。確定紫外照射30 s為最佳誘變劑量,此時致死率達87%。
2.3.2 菌株FS119硫酸二乙酯(DES)誘變 出發(fā)菌株FS119經硫酸二乙酯處理不同時間的致死曲線如圖5所示,硫酸二乙酯誘變不同劑量下的誘變效果如圖6所示。由圖5、圖6可知隨著照射時間的延長,負變率逐漸增大,不變率逐漸降低。反應時間為30 min時正變率最高,為43%。確定紫外照射30 min為最佳誘變劑量,此時致死率達92%。
2.3.3 菌株FS119紫外線與硫酸二乙酯復合誘變 將紫外照射時間為30 s篩選得到的高產菌株作為二次出發(fā)菌株,制成菌懸液,選擇致死率為92%的處理劑量繼續(xù)進行誘變,即用體積分數(shù)2%的DES處理30 min,經油脂同化培養(yǎng)基培養(yǎng),篩選出透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌株復篩,經反復篩選,最終獲得1株高產誘變菌株FS119-1(圖7),其透明圈直徑與菌落直徑比為5.21,其酶活達到24.9 U/mL,將其與原始菌株對照,其直徑比和酶活均約為原始菌株的 1.4 倍。
2.3.4 菌株FS119-1遺傳穩(wěn)定性 高產誘變菌株FS119-1在斜面上分別傳代10次后分別發(fā)酵培養(yǎng),測定搖瓶培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵測酶活。由圖8可知,菌株FS119-1在傳代至第10代時,仍能保持一個穩(wěn)定的脂肪酶產量,說明此菌株遺傳性能穩(wěn)定。
2.4.1 酶最適作用溫度 由圖9可知,酶的最適反應溫度為30 ℃,30℃后酶活力逐漸下降,0~40 ℃酶活力保持在50%以上,0 ℃有51%的相對酶活,符合低溫酶特性,在較短的時間產生大量脂肪酶。
2.4.2 酶的熱穩(wěn)定性 由圖10可知,脂肪酶在較低的溫度(0~40) ℃下能保持良好的穩(wěn)定性,超過40 ℃后酶活力迅速下降。40 ℃以上的溫度使酶變性失活,55 ℃處理1 h可使酶活力完全喪失,表明該酶具有熱不穩(wěn)定性。
2.4.3 酶最適作用pH值 由圖11可知,酶的最適反應pH值為9,在pH值為7~9時,有50%以上的活性,表明該酶屬于堿性脂肪酶。
2.4.4 酶的pH值穩(wěn)定性 由圖12可知,低溫脂肪酶在pH值為4.0~9.5下能保持良好的穩(wěn)定性,這符合堿性脂肪酶的特性。
2.4.5 金屬離子及螯合劑對酶活的影響 由表4可知,K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+對脂肪酶的活性有明顯促進作用;Ca2+是酶活性發(fā)揮所必需的[25],沈永強等研究表明Ca2+和脂肪酸生成的皂鈣促進了酶反應進行[26],也有人推測Ca2+是脂肪酶的組成成分[27];Na+、Zn2+、Fe2+、Fe3+對脂肪酶活性有微弱抑制作用,殘留酶活保持在80%以上;Cu2+、Mn2+、EDTA對脂肪酶活性有嚴重抑制作用,殘留酶活在30%以下,可能是由于這些離子與酶中心的巰基基團結合,進而引起酶失活。
本試驗從黃海大連長??h海域的海泥和海水樣品中初篩到7株產低溫脂肪酶菌株,對其進行酶活測定復篩,得到1株酶活較高菌株FS119,20 ℃為其最佳培養(yǎng)溫度,屬于低溫酶類。并對其進行形態(tài)學、生理生化特征、16S rDNA序列分析,鑒定菌株FS119為液化沙雷氏菌,大連海域未見有關此屬菌株海洋產低溫脂肪酶的報道。通過對液化沙雷氏菌FS119的物理化學合成誘變,即紫外(UV)誘變與硫酸二乙酯(DES)誘變,篩選出1株高產誘變菌株FS119-1,該菌株遺傳性能穩(wěn)定,酶活達到24.9 U/mL,為原始菌株的1.4倍。對高產誘變菌株FS119-1的酶學性質初步研究表明,該低溫脂肪酶的最適反應溫度為30 ℃,0 ℃時仍有酶活,熱穩(wěn)定性比較差;最適pH值為9,酸堿穩(wěn)定性良好;K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+對脂肪酶的活性有明顯促進作用,Cu2+、Mn2+、EDTA對脂肪酶活性有嚴重抑制作用,該酶在堿性條件下較為穩(wěn)定,初步判斷為堿性脂肪酶。
表4 金屬離子及螯合劑對酶活力的影響