• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    海洋低溫脂肪酶菌株的篩選鑒定、誘變育種及酶學性質研究

    2018-09-10 07:11:36魏計東張慶芳遲乃玉
    江蘇農業(yè)科學 2018年15期
    關鍵詞:脂肪酶乙酯硫酸

    魏計東, 于 爽, 張慶芳, 遲乃玉

    (1.大連大學生命科學與技術學院,遼寧大連 116622; 2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心,遼寧大連 116622)

    脂肪酶(lipase,EC3.1.1.3),又稱甘油三酰酯水解酶,是一類重要的工業(yè)酶,可以在油水界面上催化甘油三酯生成脂肪酸和甘油,以及甘油一酯和甘油二酯;廣泛存在于動物、植物各種組織及微生物中,是最早研究的酶類之一[1]。低溫酶[2]的定義是最適酶活溫度在30 ℃左右,在0 ℃左右仍有一定的催化活性。低溫酶主要是低溫微生物生產,它們長期生活在低溫環(huán)境中,例如南極、北極以及海洋底部等極端環(huán)境中[3]。相比較中高溫脂肪酶,低溫脂肪酶的優(yōu)勢是在低溫條件下(0~30 ℃)具有極高的催化活力和較低的熱穩(wěn)定性[4];在工業(yè)上的優(yōu)勢在于酶的活化能和反應最適溫度較低,可以節(jié)約資源、保護環(huán)境。低溫脂肪酶具有高效、可低溫下作用、作用周期短等優(yōu)勢[5],在應用上具有中高溫脂肪酶無法取代的優(yōu)越性,因此在食品[6]、輕紡[7]、化妝品[8]、洗滌劑[9]、有機合成[10]、環(huán)境治理[11]以及醫(yī)藥[12]等領域有廣泛的應用前景。微生物脂肪酶種類多,作用溫度及pH值范圍比動、植物脂肪酶廣[13-14],底物專一性高,且便于工業(yè)生產以獲得較高純度的酶制劑,已成為工業(yè)生產脂肪酶的主要來源。

    本研究通過對海泥樣品中微生物的分離篩選,獲得1株產低溫脂肪酶耐冷菌株;該菌株在低溫下具有較高的活性,為提高該菌株的產酶量,應用物理化學合成誘變即紫外(UV)誘變與硫酸二乙酯(DES)誘變,并且研究了其酶學性質。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株 試驗菌株液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)FS119篩選自黃海大連長??h海域的海泥和海水樣品,后經誘變得到高產誘變菌株FS119-1,現(xiàn)由遼寧省海洋微生物工程技術研究中心保藏。

    1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 橄欖油聚乙烯醇乳化液[15]:取4%聚乙烯醇和橄欖油按3 ∶1的比例混合均勻,于10 000 r/min乳化3 min,暫停5 min而后繼續(xù)乳化3 min。

    富集培養(yǎng)基[16]:(NH4)2SO40.1%,K2HPO40.1%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.05%,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%,酵母膏0.5%,橄欖油0.5%,pH值自然。

    平板分離培養(yǎng)基:(NH4)2SO40.1%,K2HPO40.1%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.05%,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%,瓊脂2%,pH值為8.0,121 ℃滅菌20 min。橄欖油聚乙烯醇乳化液121 ℃滅菌20 min,取12 mL橄欖油聚乙烯醇乳化液加入到100 mL上述培養(yǎng)基中即為油脂同化培養(yǎng)基。

    純化培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1.0%,NaCl 0.5%,瓊脂2.0%,pH值8.0。

    種子培養(yǎng)基:蛋白胨1.0%,酵母膏0.5%,NaCl 0.1%,pH值8.0。

    初始發(fā)酵培養(yǎng)基:(NH4)2SO40.1%,K2HPO40.1%,MgSO4·7H2O 0.05%,葡萄糖0.5%,橄欖油1.0%,pH值自然。

    斜面保藏培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,NaCl 0.5%,瓊脂2.0%,pH值8.0。

    1.1.3 儀器與設備 LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠;LTI-700恒溫培養(yǎng)箱:上海愛郎儀器有限公司;HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱:上海精宏實驗設備有限公司;HD-1360超凈工作臺:北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;AL-204電子天平:梅特勒-托利多儀器有限公司;RDY-SP1Z型核酸電泳儀:北京榮陽靜電科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 菌株的篩選 (1)富集培養(yǎng):取1 g泥樣或1 mL水樣于20 mL帶有玻璃珠的無菌水中,使沉積物懸浮,取懸浮液 1 mL 接種到100 mL的富集培養(yǎng)基三角瓶中,20 ℃ 150 r/min培養(yǎng)3 d后轉接400 μL渾濁的菌液到新鮮的液體富集培養(yǎng)基中,連續(xù)富集3輪;(2)菌株的初篩:取0.1 mL富集菌液梯度稀釋后涂布平板分離培養(yǎng)基進行初篩,20 ℃培養(yǎng)3~7 d后觀察透明圈的大??;(3)菌株的純化:挑取初篩培養(yǎng)基上菌落周圍變色圈大的菌落,稀釋涂布于純化培養(yǎng)基上進一步純化,得到純化的單菌落;(4)菌株的復篩:將單菌落點種于分離培養(yǎng)基上,20 ℃培養(yǎng)3 d,測量透明圈直徑大??;將透明圈直徑最大的菌株接入種子培養(yǎng)基中150 r/min培養(yǎng)24 h,再以6%的接種量接到初始發(fā)酵培養(yǎng)基中,在不同溫度下測定其發(fā)酵液酶活力。

    1.2.2 菌株的鑒定 (1)形態(tài)學特征:參照文獻[17-18],在菌落生長的平板上觀察單菌落的形狀、大小、透明度、顏色、邊緣和表面特征。采用革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色和鞭毛染色,用光學顯微鏡觀察菌體形狀特征。(2)生理生化特征:參照文獻[17-18],對FS119菌株進行生理生化鑒定,包括接觸酶試驗、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗、運動型試驗、M.R和V.P試驗、檸檬酸鹽試驗、明膠液化試驗、酯酶(油脂、Tween 80)試驗、KOH拉絲試驗、好氧性試驗、氧化酶試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗、淀粉試驗、脲酶試驗。(3)菌株16S rDNA序列分析:利用UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取FS119菌基因組DNA。以菌株FS119基因組DNA為模板進行PCR擴增,而后將PCR產物交由上海生工生物工程有限公司測序,將測序結果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast序列比對,利用MEGA軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.2.3 脂肪酶活力測定 采用NaOH滴定法[19]進行低溫脂肪酶的篩選和酶活的測定;同時,選用p-NPP比色法進行驗證。

    堿滴定法測定脂肪酶酶活:發(fā)酵液經10 000 r/min離心20 min,取上清液測酶活。取3個100 mL錐形瓶,分別加入 4 mL 聚乙烯醇橄欖油乳化液,5 mL 0.05 mol/L、pH值為8的磷酸鹽緩沖液,其中1個錐形瓶作為對照樣,提前加入95%乙醇15 mL,于30 ℃水浴鍋中預熱5 min。向3個錐形瓶中加入1 mL酶液,立即混勻計時10 min,向2個樣品瓶中加入15 mL 95%乙醇終止反應。向3個錐形瓶中滴加3滴酚酞作為指示劑,用0.05 mol/L NaOH溶液滴定水解產生的游離脂肪酸,根據(jù)酶活公式計算酶活。酶活定義:1 mL酶液于 30 ℃、pH值8的條件下,水解脂肪1 min生成1 μmol的脂肪酸所需要的酶量定義為1個酶活力單位。

    p-NPP法[20-21],脂肪酶1個單位的定義是:在pH值為8、30 ℃條件下,作用10 min,1 min分解對硝基棕櫚酸酯釋放1 μmol對-硝基酚(p-nitrophenol)所需的酶量。

    1.2.4 紫外線-硫酸二乙酯復合誘變 (1)紫外線(UV)誘變:取5 mL菌懸液轉于內徑90 mm的裝有滅菌轉子的培養(yǎng)皿中,將平皿置于紫外燈正下方18 cm處的磁力攪拌器上,先將整個平皿照射1 min后,打開皿蓋,開動磁力攪拌器[22],每隔5 s定時取出菌液,于冰浴中保存1 h;分別取未照射的空白液和照射不同時段的菌液0.1 mL涂布于平板上,每個梯度涂布3個平板,用黑色膠袋包好于20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h,計算致死率(誘變后未存活的總細胞數(shù)與未誘變存活的總細胞數(shù)的百分比)和正突變率(產量高于出發(fā)菌株產量的數(shù)量與誘變后存活的細胞數(shù)目的百分比),通過最高的正突變率選出最佳的紫外照射時間。

    (2)硫酸二乙酯誘變:吸取5 mL菌懸液于大試管中,加入體積分數(shù)2%的硫酸二乙酯(DES)5 mL,在20 ℃水浴條件下振蕩,設定不同處理時間[23]。用0.85%生理鹽水適當稀釋后涂布于油脂同化培養(yǎng)基上,每個平板上有40~50個菌落為宜。置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h,根據(jù)生長出的菌落數(shù)計算致死率。

    (3)紫外線-硫酸二乙酯復合誘變:根據(jù)紫外線與硫酸二乙酯單獨誘變結果,確定最佳的紫外線照射時間和硫酸二乙酯處理時間,進行復合誘變。即將紫外線在最佳時間照射后,取誘變液2 mL,立即加入硫酸二乙酯誘變劑,再繼續(xù)進行誘變[24]。稀釋后涂布于油脂同化培養(yǎng)基上,用黑紙包好,于20 ℃條件下恒溫培養(yǎng)36 h,根據(jù)透明圈直徑與菌落直徑比值大小和發(fā)酵培養(yǎng)酶活的測定初步挑選產酶高的菌株。

    (4)遺傳穩(wěn)定性測定:對紫外線與硫酸二乙酯復合誘變篩選出的產酶最高的菌株進行連續(xù)5代傳代培養(yǎng),測定其酶活,并比較前后酶活力變化,確定誘變菌種的遺傳穩(wěn)定性。

    1.2.5 粗酶液的制備 發(fā)酵液于4 ℃ 10 000 r/min離心 20 min,取上清液作為粗酶液。向粗酶液中加入硫酸銨至10%飽和度,4 ℃放置1 h,10 000 r/min離心20 min,向上清液繼續(xù)加入硫酸銨至80%飽和度,4 ℃放置24 h,15 000 r/min 離心15 min,用Tris-HCl緩沖液溶解并透析過夜,直至除去NH4+,經硫酸銨脫鹽的低溫脂肪酶用于酶初步性質研究。

    1.2.6 酶學性質研究

    12.6.1 酶最適作用溫度 分別測定酶液在0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 ℃條件下的相對酶活,做3組平行試驗。

    1.2.6.2 酶的熱穩(wěn)定性 將酶液分別置于0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 ℃條件下處理1 h,測定脂肪酶相對酶活,做3組平行試驗。

    1.2.6.3 酶最適作用pH值 在酶最適作用溫度下,分別在pH值為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5。Tris-HCl緩沖體系中測定脂肪酶相對酶活,做3組平行試驗。

    1.2.6.4 酶的pH值穩(wěn)定性 將酶液分別置于pH值為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5 Tris-HCl緩沖體系中處理24 h,測定脂肪酶相對酶活,做3組平行試驗。

    1.2.6.5 金屬離子與EDTA對酶活影響 在酶最適作用條件下,向酶反應體系中各加入各種金屬陽離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Zn2+、Ba2+及乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA),使各反應體系中金屬離子終濃度為10 mmol/L,測定脂肪酶相對酶活,做3組平行試驗。

    2 結果與分析

    2.1 菌株的篩選

    對海水、海泥樣品初篩和復篩,得到7株具有脂肪酶活力的菌株,測量透明圈直徑大小,結果見表1。獲得1株直徑比最大的菌株FS119。在不同的溫度(15、20、25、30、35、40 ℃)測定其發(fā)酵液酶活力。由表2可知,菌株FS119在20 ℃時酶活均達到最高,故此可以初步確定其為低溫菌,最適培養(yǎng)溫度為20 ℃。

    表1 菌落透明圈直徑比

    表2 菌株FS119在不同溫度下的發(fā)酵液酶活

    2.2 菌株FS119的鑒定

    2.2.1 菌株FS119形態(tài)學特征 菌株FS119菌落經革蘭氏染色,由圖1可知,菌落呈圓形菌落、呈乳白色、不透明、圓形稍突起,邊緣整齊,表面光滑、濕潤、黏稠、易挑起、質地較均勻,菌落各部分顏色一致;經光學顯微鏡觀察菌株FS119為革蘭氏染色陰性菌,菌體直桿狀,單個或成對排列,兩端較平直,端圓,直徑為0.5~0.8 μm,長0.9~2.0 μm,無芽孢,有莢膜和鞭毛,能運動。

    2.2.2 生理生化特征 參照《細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株進行生理生化試驗,結果見表3。由表3可知,菌株FS119生理生化特征為:接觸酶試驗、葡萄糖的氧化發(fā)酵試驗、運動型試驗、M.R和V.P試驗、檸檬酸鹽試驗、明膠液化試驗、酯酶(油脂、Tween 80)試驗結果均為陽性;KOH拉絲試驗、好氧性試驗、氧化酶試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗、淀粉試驗、脲酶試驗結果均為陰性。由生理生化試驗結果可初步鑒定其為液化沙雷氏菌。

    表3 菌株FS119生理生化特征

    注:“+”陽性反應;“-”陰性反應。

    2.2.3 16S rDNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 對菌株FS119進行16S rDNA序列鑒定,用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA,將提取到的基因組DNA作為模版進行PCR擴增。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳,結果顯示PCR擴增產物序列長度為1 423 bp。將菌株FS119的16S rDNA序列輸入GenBank,與FS119的16S rDNA相似性高的菌株的16s rDNA序列進行同源性比較,對比結果用Clustal X進行多序列匹配比對,通過MEGA軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析,計算出序列的系統(tǒng)進化距離,構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結果見圖2。

    2.3 菌株FS119的復合誘變

    2.3.1 菌株FS119紫外線(UV)誘變 出發(fā)菌株FS119經紫外線照射不同時間的致死曲線如圖3所示,紫外線照射不同劑量下的誘變效果如圖4所示。由圖3、圖4可知,隨著照射時間的延長,負變率逐漸增大,不變率逐漸降低。照射時間為30 s時正變率最高,為41%。確定紫外照射30 s為最佳誘變劑量,此時致死率達87%。

    2.3.2 菌株FS119硫酸二乙酯(DES)誘變 出發(fā)菌株FS119經硫酸二乙酯處理不同時間的致死曲線如圖5所示,硫酸二乙酯誘變不同劑量下的誘變效果如圖6所示。由圖5、圖6可知隨著照射時間的延長,負變率逐漸增大,不變率逐漸降低。反應時間為30 min時正變率最高,為43%。確定紫外照射30 min為最佳誘變劑量,此時致死率達92%。

    2.3.3 菌株FS119紫外線與硫酸二乙酯復合誘變 將紫外照射時間為30 s篩選得到的高產菌株作為二次出發(fā)菌株,制成菌懸液,選擇致死率為92%的處理劑量繼續(xù)進行誘變,即用體積分數(shù)2%的DES處理30 min,經油脂同化培養(yǎng)基培養(yǎng),篩選出透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌株復篩,經反復篩選,最終獲得1株高產誘變菌株FS119-1(圖7),其透明圈直徑與菌落直徑比為5.21,其酶活達到24.9 U/mL,將其與原始菌株對照,其直徑比和酶活均約為原始菌株的 1.4 倍。

    2.3.4 菌株FS119-1遺傳穩(wěn)定性 高產誘變菌株FS119-1在斜面上分別傳代10次后分別發(fā)酵培養(yǎng),測定搖瓶培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵測酶活。由圖8可知,菌株FS119-1在傳代至第10代時,仍能保持一個穩(wěn)定的脂肪酶產量,說明此菌株遺傳性能穩(wěn)定。

    2.4 酶學性質研究

    2.4.1 酶最適作用溫度 由圖9可知,酶的最適反應溫度為30 ℃,30℃后酶活力逐漸下降,0~40 ℃酶活力保持在50%以上,0 ℃有51%的相對酶活,符合低溫酶特性,在較短的時間產生大量脂肪酶。

    2.4.2 酶的熱穩(wěn)定性 由圖10可知,脂肪酶在較低的溫度(0~40) ℃下能保持良好的穩(wěn)定性,超過40 ℃后酶活力迅速下降。40 ℃以上的溫度使酶變性失活,55 ℃處理1 h可使酶活力完全喪失,表明該酶具有熱不穩(wěn)定性。

    2.4.3 酶最適作用pH值 由圖11可知,酶的最適反應pH值為9,在pH值為7~9時,有50%以上的活性,表明該酶屬于堿性脂肪酶。

    2.4.4 酶的pH值穩(wěn)定性 由圖12可知,低溫脂肪酶在pH值為4.0~9.5下能保持良好的穩(wěn)定性,這符合堿性脂肪酶的特性。

    2.4.5 金屬離子及螯合劑對酶活的影響 由表4可知,K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+對脂肪酶的活性有明顯促進作用;Ca2+是酶活性發(fā)揮所必需的[25],沈永強等研究表明Ca2+和脂肪酸生成的皂鈣促進了酶反應進行[26],也有人推測Ca2+是脂肪酶的組成成分[27];Na+、Zn2+、Fe2+、Fe3+對脂肪酶活性有微弱抑制作用,殘留酶活保持在80%以上;Cu2+、Mn2+、EDTA對脂肪酶活性有嚴重抑制作用,殘留酶活在30%以下,可能是由于這些離子與酶中心的巰基基團結合,進而引起酶失活。

    3 結論

    本試驗從黃海大連長??h海域的海泥和海水樣品中初篩到7株產低溫脂肪酶菌株,對其進行酶活測定復篩,得到1株酶活較高菌株FS119,20 ℃為其最佳培養(yǎng)溫度,屬于低溫酶類。并對其進行形態(tài)學、生理生化特征、16S rDNA序列分析,鑒定菌株FS119為液化沙雷氏菌,大連海域未見有關此屬菌株海洋產低溫脂肪酶的報道。通過對液化沙雷氏菌FS119的物理化學合成誘變,即紫外(UV)誘變與硫酸二乙酯(DES)誘變,篩選出1株高產誘變菌株FS119-1,該菌株遺傳性能穩(wěn)定,酶活達到24.9 U/mL,為原始菌株的1.4倍。對高產誘變菌株FS119-1的酶學性質初步研究表明,該低溫脂肪酶的最適反應溫度為30 ℃,0 ℃時仍有酶活,熱穩(wěn)定性比較差;最適pH值為9,酸堿穩(wěn)定性良好;K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+對脂肪酶的活性有明顯促進作用,Cu2+、Mn2+、EDTA對脂肪酶活性有嚴重抑制作用,該酶在堿性條件下較為穩(wěn)定,初步判斷為堿性脂肪酶。

    表4 金屬離子及螯合劑對酶活力的影響

    猜你喜歡
    脂肪酶乙酯硫酸
    豉香型白酒中三種高級脂肪酸乙酯在蒸餾及原酒貯存過程中變化規(guī)律的研究
    釀酒科技(2022年8期)2022-08-20 10:25:04
    硫酸渣直接還原熔分制備珠鐵
    2019年硫酸行業(yè)運行情況
    2018磷復肥硫酸大數(shù)據(jù)發(fā)布
    硫酸很重要特點要知道
    脂肪酶Novozyme435手性拆分(R,S)-扁桃酸
    脂肪酶N435對PBSA與PBSH的酶催化降解和分子模擬
    中國塑料(2016年7期)2016-04-16 05:25:53
    醬油中氨基甲酸乙酯檢測方法的研究
    丁酸乙酯對卷煙煙氣的影響
    煙草科技(2015年8期)2015-12-20 08:27:06
    咖啡酸苯乙酯對順鉑所致大鼠腎損傷的保護作用及機制
    亚洲午夜精品一区,二区,三区| 黄色女人牲交| 国产伦人伦偷精品视频| x7x7x7水蜜桃| 欧美乱码精品一区二区三区| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 高清黄色对白视频在线免费看| 免费在线观看黄色视频的| 成人18禁在线播放| 一二三四在线观看免费中文在| 国产成人系列免费观看| 丝袜美腿诱惑在线| 老司机午夜十八禁免费视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 中文字幕制服av| 高清视频免费观看一区二区| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产精品久久久av美女十八| 男女下面插进去视频免费观看| 久久久国产成人免费| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产不卡一卡二| 黄频高清免费视频| 人妻久久中文字幕网| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 身体一侧抽搐| 亚洲熟女毛片儿| 这个男人来自地球电影免费观看| 午夜精品在线福利| 国产成人影院久久av| 久久性视频一级片| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产国语露脸激情在线看| 欧美丝袜亚洲另类 | 黄色片一级片一级黄色片| 久久草成人影院| 午夜免费鲁丝| 国产在视频线精品| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品久久久久久久久久免费视频 | 欧美精品av麻豆av| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产成人欧美| 欧美+亚洲+日韩+国产| 在线天堂中文资源库| 国产欧美日韩一区二区精品| 丁香六月欧美| 中文字幕制服av| 美女高潮到喷水免费观看| 黄片大片在线免费观看| 国产成人免费无遮挡视频| 国产高清视频在线播放一区| 免费高清在线观看日韩| 女人被狂操c到高潮| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 黑人猛操日本美女一级片| 国产精品一区二区精品视频观看| 精品人妻在线不人妻| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 两个人看的免费小视频| 不卡一级毛片| 90打野战视频偷拍视频| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美乱妇无乱码| 一级作爱视频免费观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲情色 制服丝袜| 一本综合久久免费| 一区二区三区激情视频| 亚洲精品在线观看二区| 一进一出好大好爽视频| 黑丝袜美女国产一区| 久久久久国内视频| 最新在线观看一区二区三区| 国产精品一区二区在线不卡| 99国产精品一区二区三区| 老汉色∧v一级毛片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 婷婷丁香在线五月| 亚洲三区欧美一区| 91精品三级在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产亚洲欧美98| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 男女午夜视频在线观看| 69av精品久久久久久| 国产激情久久老熟女| 国产精品一区二区精品视频观看| 午夜福利,免费看| 免费观看a级毛片全部| 一区二区三区国产精品乱码| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久久久久久久免费视频了| 色在线成人网| 亚洲五月天丁香| 久久影院123| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产麻豆69| 在线国产一区二区在线| 超碰97精品在线观看| 天天影视国产精品| 日韩欧美三级三区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 黄片播放在线免费| 新久久久久国产一级毛片| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲在线自拍视频| 18禁观看日本| 日韩欧美免费精品| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 亚洲午夜理论影院| 久热这里只有精品99| 青草久久国产| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 精品人妻1区二区| 性色av乱码一区二区三区2| 国产激情久久老熟女| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久草成人影院| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 日韩欧美三级三区| 热99re8久久精品国产| 美国免费a级毛片| 久久狼人影院| 一级作爱视频免费观看| 后天国语完整版免费观看| 99热网站在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影 | 波多野结衣av一区二区av| 人成视频在线观看免费观看| 欧美大码av| 午夜视频精品福利| 露出奶头的视频| 欧美一级毛片孕妇| 久久久久久免费高清国产稀缺| 五月开心婷婷网| 女人被狂操c到高潮| 一级a爱视频在线免费观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久久国产成人精品二区 | 国产免费av片在线观看野外av| 成人黄色视频免费在线看| 9191精品国产免费久久| 精品国产一区二区三区四区第35| 中文字幕人妻熟女乱码| 老司机深夜福利视频在线观看| 丰满的人妻完整版| 精品无人区乱码1区二区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 黄色女人牲交| 99热国产这里只有精品6| 欧美人与性动交α欧美软件| www.999成人在线观看| 极品人妻少妇av视频| 岛国在线观看网站| 久久久久精品人妻al黑| 大片电影免费在线观看免费| 久久久久久久国产电影| 国产精品久久视频播放| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 黄片小视频在线播放| 日本wwww免费看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 欧美日本中文国产一区发布| 国产精品免费大片| 美女视频免费永久观看网站| a级毛片在线看网站| 欧美最黄视频在线播放免费 | 中文字幕人妻丝袜一区二区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲精品在线美女| 69av精品久久久久久| 一级毛片女人18水好多| 无遮挡黄片免费观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 不卡一级毛片| 亚洲黑人精品在线| 精品国内亚洲2022精品成人 | 久久久久久久午夜电影 | 男女床上黄色一级片免费看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 国产欧美日韩综合在线一区二区| xxxhd国产人妻xxx| 国产一区二区三区视频了| 亚洲视频免费观看视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 欧美另类亚洲清纯唯美| 手机成人av网站| 国产高清激情床上av| 1024视频免费在线观看| 免费av中文字幕在线| 精品福利观看| 午夜福利乱码中文字幕| 久久精品成人免费网站| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美日韩精品网址| 两个人免费观看高清视频| 午夜福利在线观看吧| 欧美国产精品一级二级三级| 嫩草影视91久久| 一级片免费观看大全| 一级毛片精品| 午夜福利,免费看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 脱女人内裤的视频| 黄片小视频在线播放| 国产成人欧美在线观看 | 操美女的视频在线观看| 在线观看www视频免费| 欧美日韩乱码在线| 中文字幕高清在线视频| 国产精品二区激情视频| 国产高清videossex| 亚洲伊人色综图| 亚洲av欧美aⅴ国产| 午夜日韩欧美国产| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 在线观看66精品国产| 国产av精品麻豆| 黄片播放在线免费| 一进一出好大好爽视频| 国产精品久久电影中文字幕 | 欧美日韩视频精品一区| 亚洲专区国产一区二区| 极品教师在线免费播放| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲片人在线观看| 精品欧美一区二区三区在线| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久九九热精品免费| 国产成+人综合+亚洲专区| 天堂√8在线中文| 午夜久久久在线观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产av又大| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产成人av激情在线播放| 国产不卡一卡二| 亚洲人成伊人成综合网2020| 午夜视频精品福利| 香蕉国产在线看| 又黄又爽又免费观看的视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲成人国产一区在线观看| www.熟女人妻精品国产| 一a级毛片在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 中文字幕制服av| 99riav亚洲国产免费| av电影中文网址| 成年人免费黄色播放视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 精品无人区乱码1区二区| 不卡一级毛片| 最新的欧美精品一区二区| 女性被躁到高潮视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 妹子高潮喷水视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 精品免费久久久久久久清纯 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲国产精品合色在线| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲av成人一区二区三| 日本黄色日本黄色录像| 黄片播放在线免费| 99热只有精品国产| 欧美精品av麻豆av| 欧美午夜高清在线| 国产精品永久免费网站| 一区福利在线观看| 人妻久久中文字幕网| videos熟女内射| 波多野结衣一区麻豆| 麻豆成人av在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲国产欧美网| 一二三四社区在线视频社区8| 国产高清videossex| 亚洲国产看品久久| 国产亚洲欧美精品永久| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产欧美日韩一区二区三| 91字幕亚洲| 成在线人永久免费视频| 精品久久蜜臀av无| 色老头精品视频在线观看| 国产淫语在线视频| 大片电影免费在线观看免费| 精品一区二区三卡| 婷婷丁香在线五月| 国产又色又爽无遮挡免费看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 无遮挡黄片免费观看| 很黄的视频免费| 悠悠久久av| 青草久久国产| 亚洲精品国产区一区二| 青草久久国产| 国产成人欧美| 欧美日韩一级在线毛片| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产av又大| 国产亚洲一区二区精品| 中国美女看黄片| 国产精品国产高清国产av | 久99久视频精品免费| netflix在线观看网站| 欧美午夜高清在线| 欧美大码av| 丰满的人妻完整版| 久久人妻av系列| 精品国产美女av久久久久小说| 大片电影免费在线观看免费| 一区福利在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 成年动漫av网址| 欧美成人免费av一区二区三区 | 精品熟女少妇八av免费久了| 91字幕亚洲| 国产极品粉嫩免费观看在线| 成人国产一区最新在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 嫩草影视91久久| 一进一出抽搐动态| 亚洲精品国产区一区二| 老司机影院毛片| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 成年版毛片免费区| 天堂动漫精品| tocl精华| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 波多野结衣av一区二区av| 母亲3免费完整高清在线观看| 看免费av毛片| 国产男靠女视频免费网站| 久久精品亚洲av国产电影网| 一本综合久久免费| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 中文欧美无线码| 中文字幕精品免费在线观看视频| 一进一出好大好爽视频| 一夜夜www| 夜夜爽天天搞| 免费av中文字幕在线| 免费在线观看影片大全网站| 精品免费久久久久久久清纯 | 无遮挡黄片免费观看| 黄色片一级片一级黄色片| 不卡一级毛片| 超色免费av| 国产精品98久久久久久宅男小说| 成在线人永久免费视频| 亚洲免费av在线视频| av免费在线观看网站| 美女午夜性视频免费| 欧美精品高潮呻吟av久久| av网站免费在线观看视频| 成人影院久久| 欧美 日韩 精品 国产| 在线视频色国产色| 久久精品国产亚洲av高清一级| 黄色怎么调成土黄色| 三上悠亚av全集在线观看| 天天操日日干夜夜撸| 国精品久久久久久国模美| 国产男靠女视频免费网站| 一级,二级,三级黄色视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 欧美乱妇无乱码| 色综合婷婷激情| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久9热在线精品视频| av不卡在线播放| 午夜福利乱码中文字幕| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 精品第一国产精品| 久久久国产欧美日韩av| 嫁个100分男人电影在线观看| 在线观看舔阴道视频| 18禁国产床啪视频网站| 成人三级做爰电影| 精品人妻在线不人妻| 成人影院久久| 国产欧美亚洲国产| 精品国产国语对白av| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产精品国产高清国产av | 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 91成人精品电影| 狂野欧美激情性xxxx| 涩涩av久久男人的天堂| 欧美丝袜亚洲另类 | 免费黄频网站在线观看国产| 国产精品免费大片| 高清视频免费观看一区二区| 一区二区三区国产精品乱码| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲av熟女| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲 国产 在线| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 欧美av亚洲av综合av国产av| 在线播放国产精品三级| 天堂√8在线中文| 午夜日韩欧美国产| 亚洲av熟女| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 婷婷丁香在线五月| 亚洲第一青青草原| 一级毛片精品| 精品免费久久久久久久清纯 | 精品熟女少妇八av免费久了| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 午夜久久久在线观看| 午夜福利,免费看| 国产成人免费无遮挡视频| 久久中文字幕一级| 黄色成人免费大全| 男人操女人黄网站| 午夜影院日韩av| www.精华液| 欧美黑人欧美精品刺激| 精品卡一卡二卡四卡免费| 男女免费视频国产| 亚洲成人免费电影在线观看| 午夜免费观看网址| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 天堂动漫精品| 国产亚洲精品一区二区www | 日韩制服丝袜自拍偷拍| 成熟少妇高潮喷水视频| 深夜精品福利| 91九色精品人成在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美成人午夜精品| 免费在线观看黄色视频的| 久久国产乱子伦精品免费另类| 欧美另类亚洲清纯唯美| 91精品三级在线观看| 黑人操中国人逼视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 啦啦啦 在线观看视频| 国产亚洲精品一区二区www | 老熟女久久久| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲精品美女久久av网站| netflix在线观看网站| 精品福利永久在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产97色在线日韩免费| 精品国产美女av久久久久小说| 窝窝影院91人妻| 国产伦人伦偷精品视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 99热国产这里只有精品6| 国产在线观看jvid| 国产精品一区二区免费欧美| 丝袜美腿诱惑在线| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 亚洲片人在线观看| 窝窝影院91人妻| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 无人区码免费观看不卡| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 免费观看精品视频网站| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲五月色婷婷综合| 黄色片一级片一级黄色片| 国产不卡一卡二| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 91精品国产国语对白视频| 在线看a的网站| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产不卡一卡二| xxxhd国产人妻xxx| 男女免费视频国产| 丝袜在线中文字幕| 精品午夜福利视频在线观看一区| 99国产精品免费福利视频| 无限看片的www在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产在线一区二区三区精| √禁漫天堂资源中文www| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲国产欧美网| 麻豆av在线久日| 韩国精品一区二区三区| av一本久久久久| 视频区欧美日本亚洲| 97人妻天天添夜夜摸| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产又爽黄色视频| 亚洲在线自拍视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 黄片播放在线免费| 性色av乱码一区二区三区2| 动漫黄色视频在线观看| 中文字幕色久视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 久久九九热精品免费| 久久国产乱子伦精品免费另类| xxx96com| 18禁美女被吸乳视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 女人被狂操c到高潮| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 免费看十八禁软件| 亚洲伊人色综图| av天堂久久9| 叶爱在线成人免费视频播放| 精品国产亚洲在线| 91麻豆av在线| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲国产精品合色在线| 日本一区二区免费在线视频| 人妻 亚洲 视频| 一级毛片高清免费大全| 在线观看午夜福利视频| 亚洲美女黄片视频| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲七黄色美女视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 午夜成年电影在线免费观看| 免费高清在线观看日韩| 成人特级黄色片久久久久久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 精品乱码久久久久久99久播| 超碰成人久久| 日韩有码中文字幕| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲av片天天在线观看| 又大又爽又粗| 午夜福利视频在线观看免费| 久久青草综合色| 夜夜爽天天搞| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 91老司机精品| 精品福利永久在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲av熟女| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 91大片在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 精品电影一区二区在线| 国产人伦9x9x在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 国产精品综合久久久久久久免费 | 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲国产精品sss在线观看 | 美女国产高潮福利片在线看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 操出白浆在线播放| 国产不卡av网站在线观看| 国产精品久久久久成人av| 亚洲精品自拍成人| 悠悠久久av| 久久久久视频综合| 亚洲精品一二三| 一区二区三区国产精品乱码| 久久99一区二区三区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品国产一区二区久久| 搡老岳熟女国产| 91大片在线观看| 在线看a的网站| av线在线观看网站| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 交换朋友夫妻互换小说| 免费看a级黄色片| 欧美最黄视频在线播放免费 | 热99re8久久精品国产| 午夜福利,免费看| 欧美日韩精品网址| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 午夜两性在线视频| 婷婷丁香在线五月|