基于黃褐棉導入系的抗黃萎病QTL鑒定分析

鄧 琳， 劉 靜， 張 咪， 黃 芳， 周水娟， 劉 倩， 梅 艷， 王 澤， 王 凱， 汪保華

[1.南通大學生命科學學院，江蘇南通 226019； 2.福建省海峽植物應用系統(tǒng)生物學重點實驗室(福建農(nóng)林大學)，福建福州 350002]

棉花是紡織工業(yè)的重要原料，也是重要的油料作物[1]。棉屬(GossypiumL.)包含4個栽培種，即草棉(G.herbaceum)、亞洲棉(G.arboreum)、陸地棉(G.hirsutum)、海島棉(G.barbadense)，其中陸地棉栽培對棉花產(chǎn)量貢獻最大。經(jīng)過長期的引種馴化，現(xiàn)代陸地棉栽培種已具備高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等諸多優(yōu)良特性；然而，人類的選育也對遺傳多樣性造成一定的影響，并直接導致棉花對生物及非生物脅迫的抗性降低[2]。其中，棉花黃萎病病菌導致的土傳真菌維管束病害，即棉花黃萎病，在生產(chǎn)中極具毀滅性且難以防治[3]。在棉花育種實踐中，利用野生資源拓寬棉花遺傳多樣性，發(fā)掘野生棉一些新的基因位點對陸地棉改良有明顯的作用[4]。原產(chǎn)于巴西的黃褐棉(G.mustelinum)[5]在野生異源四倍體棉種里與陸地棉遺傳距離較遠[6]，且具有抗黃萎病的優(yōu)良特性，其優(yōu)異的等位基因?qū)Ω牧缄懙孛蘅裹S萎病具備潛在的重要價值。

Tanksley等提出的回交高世代數(shù)量性狀基因座(advanced backcross quantitative trait locus，簡稱AB-QTL)分析法，解決了從野生種導入優(yōu)良基因到栽培品種的問題[7]。Paterson等提出了利用導入系(introgression line，簡稱IL)作圖群體進行QTL精細定位，并取得了良好效果[8]。張星星等在BC3F3種子中鑒定出來自加拿大優(yōu)質(zhì)強筋小麥品種Glenlea的Glu-A1a、Glu-B1al、Glu-D1d位點不同組合的7種導入系材料，研究表明，DLGlu1可用于Glu-1 位點近等導入系的快速創(chuàng)制，對Glu-1位點功能研究和改良具有重要價值[9]。張蕾等研究的由小麥和中間偃麥草Z1141雜交、回交而來的高代導入系CH7124，在苗期高度耐受鹽脅迫環(huán)境，后續(xù)用100個簡單重復序列(simple sequence repeats，簡稱SSR)標記對親本CH7124和綿陽11以及F2群體的耐鹽/敏感池進行篩選，結(jié)果獲得2個多態(tài)性標記Xwmc175、Xgwm213[10]。潘曉雪等以死苗率為鑒定指標，對糯稻89-1導入系群體(BC1F9)進行苗期耐寒性鑒定試驗，篩選出強抗寒性株系并對篩選出的株系進行了生理生化分析[11]。

為揭示棉花抗病的遺傳基礎，許多研究者已經(jīng)進行了獨立的研究，并在一些定位群體中檢測出許多與棉花抗病性相關(guān)聯(lián)的QTL。Guo等利用2個黃萎病抗性品系5026、60182鑒定了25個與抗病相關(guān)的QTL，4個優(yōu)良QTL分別位于5號、6號、8號、13號染色體上[12]。Zhao等基于疾病苗圃和溫室環(huán)境，通過關(guān)聯(lián)作圖鑒定了與黃萎病抗性相關(guān)的42個QTL，廣泛分布在15條染色體中，16號染色體上的抗性QTL簇也在其研究中得到證實，這與該染色體的緊密連鎖具有一致性[13]。Ning等在抗性Acala-Prema和易感栽培種86-1之間的雜交群體中檢測到7個位于1號、3號、5號、7號染色體上的抗性QTL[14]。Fang等構(gòu)建了易感Sure-Grow 747(陸地棉)與抗性Pima S-7(海島棉)雜交的回交高世代群體，檢測到在4號、19號等染色體上的共42個QTL，增效親本大多來自抗性Pima S-7[15]。Jiang等利用抗性棉花材料60182與易感栽培品種Junmian 1雜交，在7號和9號染色體上同時篩選出具有高貢獻率的QTL簇，這對改善棉花育種的計劃有所促進[16]。Bolek等利用高度耐受的棉花品系Pima S-7(海島棉)和易感的Acala 44(陸地棉)雜交，通過具有明顯連鎖關(guān)聯(lián)的15個標記，共檢測出9個分布于10號、11號、12號、25號染色體的QTL[17]。

針對棉花抗黃萎病相關(guān)表達序列標簽(expressed sequence tag，簡稱EST)資源，筆者所在團隊已開發(fā)106對有效、非冗余的抗黃萎病SSR標記，并對所開發(fā)的引物進行評價，同時進行棉屬種間轉(zhuǎn)移性研究，成效顯著[18]。本研究在利用Wang等將陸地棉與黃褐棉雜交而構(gòu)建的回交高世代群體[19]的基礎上，分子標記輔助選擇抗病表現(xiàn)優(yōu)異的近等基因系，并結(jié)合病圃的表型差異，在構(gòu)建的棉花導入系群體中對抗病QTL進行鑒定和分析，以期為抗病QTL精細定位及抗病分子育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 用于QTL定位的黃褐棉導入系群體的培育

前期研究中以陸地棉PD94042(P1)為受體親本、以黃褐棉(G.mustelinum)(P2)為供體親本進行雜交，并以陸地棉PD94042(P1)為輪回親本構(gòu)建了回交高世代群體[19]，從中選育出1組覆蓋棉花全基因組的導入系(共計65份材料)，其過程主要包括親本雜交獲得F1代，然后與陸地棉回交3次獲得回交3代，再進行自交，獲得試驗需要的導入系群體(圖1)。

1.2 導入系群體黃萎病抗性鑒定

導入系群體及2個親本分別在2011年種于江蘇省南通市(環(huán)境1)、鹽城市(環(huán)境2)兩地，各家系按行種植，隨機區(qū)組設計，2次重復，每個重復每行材料種植5株。2013年12月份鑒定發(fā)生黃萎病劈稈的病情指數(shù)，病級劃分參照吳征彬的方法[20](表1)，病情指數(shù)計算公式如下：

式中：R是某一家系的黃萎病病情指數(shù)；X是病級(0～4)；Y是某一病級的單株數(shù)；α是所調(diào)查家系的棉花單株總數(shù)。

表1 棉花黃萎病病級劃分標準

1.3 DNA提取、PCR擴增和電泳檢測

對各材料的基因組DNA采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltriethyl ammnonium bromide，簡稱CTAB)法提取，用紫外分光光度計檢測其濃度[21]。

PCR反應體系總體積為10 μL，具體包括1.0 μL 10×Reaction buffer(不含Mg2+)，1.0 μL Mg2+(25 mol/L)，1.0 μL dNTP(10 mmol/L)，各0.5 μL上、下游引物(10 μmol/L)，0.2 μLTaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)，1.0 μL模板DNA(50 ng/μL)，4.8 μL ddH2O，上覆10.0 μL液體石蠟油。

PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；最后在4 ℃冷卻保存。

聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)方法：用10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測，在擴增產(chǎn)物中加入3 μL溴酚藍上樣緩沖液混勻，從中取2.5 μL加入點樣孔，并用50 bp DNA Ladder進行標記。在電泳緩沖液為1×Tris-硼酸，150 V恒壓環(huán)境下電泳 1.5 h。銀染分析：在He等的方法[22-23]基礎上稍加改良，經(jīng)固定、銀染、顯色、水洗等步驟后，拍照保存。

1.4 導入系群體的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

1.4.1 基因型數(shù)據(jù)統(tǒng)計 通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，參考DNA Ladder標準記載，對比條帶顯示結(jié)果，記錄親本及子代SSR標記的類型，共顯性標記記錄中，與親本P1相同的純合帶型記為“1”，與親本P2相同的純合帶型記為“2”，兩親本的雜合帶型記為“3”；當親本P1為顯性、親本P2為隱性時，P1、F1的帶型記為“5”，P2的帶型記為“2”；當親本P2為顯性、親本P1為隱性時，P2、F1的帶型記為“4”，P1的帶型記為“1”；模糊或缺失數(shù)據(jù)記為“0”。將每個標記的數(shù)據(jù)輸入Excel表格。

1.4.2 表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計 將病圃的表型數(shù)據(jù)進行相應的統(tǒng)計分析，計算其相應的病情指數(shù)。

1.5 黃萎病抗性QTL定位

綜合導入系群體的基因型數(shù)據(jù)，首先對于標記之間的連鎖關(guān)系用MapMaker 3.0軟件進行分析，構(gòu)建分子標記的遺傳連鎖圖譜。利用Win QTL Cart 2.5軟件將病圃的表型數(shù)據(jù)結(jié)合基因型數(shù)據(jù)開展黃萎病抗性QTL定位，檢測QTL最低連鎖系數(shù)(likelihood of odds，簡稱LOD)值為2.5，最后對于目標QTL在染色體或連鎖圖譜上的位置用MapChart繪圖軟件進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗病表型分析

病情指數(shù)越低，抗性越高。由圖2可知，陸地棉絕大部分為易感病材料，黃褐棉為抗病材料。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果可以證明該導入系群體中存在一定量抗病相關(guān)的黃褐棉漸滲片段，從而使得該導入系群體抗病性得到提高。

2.2 抗病QTL分析

由表2可知，在2種環(huán)境下共檢測到10個抗病性QTL，其中，在環(huán)境1下檢測到2個QTL，qVW-5-1定位在5號染色體60.09 cM處，側(cè)鄰標記為CICR016-CICR186，LOD值為3.4，解釋17.6%的表型變異率，病指增效基因貢獻親本為陸地棉PD94042；qVW-9-1定位在9號染色體14.99 cM處，側(cè)鄰標記為CICR658-BNL3779，LOD值為2.7，解釋 14.6% 的表型變異率，增效基因貢獻親本為陸地棉PD94042；在環(huán)境2下檢測到8個QTL，qVW-4-1定位在4號染色體0.01 cM處，側(cè)鄰標記為DPL0085-BNL530，LOD值為 2.7，解釋14.0%的表型變異率，增效基因貢獻親本為陸地棉PD94042；qVW-10-1定位在10號染色體0.01 cM處，側(cè)鄰標記為BNL1438-CICR002a，LOD值為2.8，解釋14.0%的表型變異率，增效基因貢獻親本為黃褐棉；qVW-16-1定位在16號染色體79.67 cM處，側(cè)鄰標記為CICR166b-BNL1604，LOD值為2.6，解釋19.1%的表型變異率，增效基因貢獻親本為黃褐棉；qVW-18-1定位在18號染色體 49.51 cM 處，側(cè)鄰標記為BNL1721-MUSS603，LOD值為 2.7，解釋17.9%的表型變異率，增效基因貢獻親本為黃褐棉；定位于19號染色體的抗病QTL有3個，其中qVW-19-1定位在19號染色體312.67 cM處，側(cè)鄰標記為BNL3029-DPL0444，LOD值為2.9，解釋18.6%的表型變異率，增效基因貢獻親本為黃褐棉；另外qVW-19-2定位在19號染色體33.52 cM處，側(cè)鄰標記為CICR524-CICR056，LOD值為2.6，解釋21.9%的表型變異率，增效基因貢獻親本為陸地棉PD94042；qVW-19-3定位在19號染色體70.39 cM處，側(cè)鄰標記為BNL3811-MUSS118，LOD值為3.0，解釋18.7%的表型變異率，增效基因貢獻親本為陸地棉PD94042。特別地，位于22號染色體上的QTLqVW-22-1可解釋39.3%的表型變異率，且LOD值高達4.8，其病情指數(shù)增效基因來自陸地棉，即黃褐棉等位基因具有抗病作用，有必要開展深入研究。

表2 QTL定位結(jié)果

用繪圖軟件MapChart繪制目標QTL在染色體或連鎖圖譜上的位置，如圖3所示：圖中為qVW-22-1主效QTL的遺傳圖譜分析，圖上劃線標記的是QTL的多態(tài)性位點，顯示的是可能存在于該區(qū)間的抗病QTL，線性標注即是該區(qū)間的范圍，而中間的矩形實心區(qū)域是可能性較大的QTL位置，這表明更為精細的位點可能在此區(qū)域；右邊的矩形方框是根據(jù)LOD值所畫的散點圖。

3 討論

在眾多作物(水稻[24]、大豆[25]、棉花[26]等)中均有報道通過高世代回交和分子標記輔助選擇相結(jié)合來構(gòu)建染色體片段代換系，但具有黃褐棉染色體片段代換系的報道較少。本研究所用親本材料中的PD94042是感病陸地棉品系，另一個親本是高抗黃萎病的黃褐棉品系，兩親本在抗黃萎病性狀方面差異明顯，因此利于進行抗病QTL研究。

前人研究中，已報道許多棉花黃萎病抗性QTL[27-28]。劉劍光等構(gòu)建的一個以棉花抗黃萎病品系蘇抗045和感黃萎病品系蘇研116為親本的含有237個F2單株的群體中，在NAU2970-MUSS138區(qū)間內(nèi)檢測到1個定位于5號染色體上的抗黃萎病QTL，可解釋9.69%的表型變異率[29]。Shi等構(gòu)建了來自高抗性品系Hai1(海島棉)和易感品種CCRI36(陸地棉)作為輪回親本的BC1F1、BC1S1、BC2F1群體，在全棉基因組中使用來自BC1F1群體的高密度簡單重復序列遺傳連鎖圖譜檢測與抗病抗性相關(guān)的QTL共48個，其中定位于19號染色體上的抗病QTL側(cè)鄰標記NAU5489與筆者所在實驗室鑒定的qVW-19-3側(cè)鄰標記相距甚小，可能有一定的相關(guān)性，位于22號染色體上的QTL側(cè)鄰標記CICR0438也出現(xiàn)在本研究的圖譜上；同時也檢測出來自5號、9號、10號染色體上的許多QTL，但由于缺乏共同標記，難以比較[30]。Yang等利用耐受品種Hai7124(海島棉)與易感品種Junmian 1(陸地棉)進行雜交，檢測到定位于4號染色體上的抗病QTL側(cè)鄰標記NAU3437也在筆者所在實驗室的檢測范圍內(nèi)，與筆者所在實驗室鑒定的qVW-4-1可能具有一定的關(guān)聯(lián)[31]。

本研究檢測到的抗病QTL大多離散地分布在多條染色體上， 而在19號染色體連鎖群上有3個QTL，這些QTL主要集中在標記DPL0444、CICR056、MUSS118附近，這種QTL成簇分布現(xiàn)象在其他研究中也有報道，在棉花基因組中可能存在著對棉花生長發(fā)育具有更大作用的高度重復的基因富集區(qū)，QTL能發(fā)揮多重功能以彌補數(shù)量上的不足[32]。后續(xù)的研究將對一些重點QTL開展精細定位，同時進行標記輔助選擇，以期為棉花抗黃萎病育種實踐服務。