MTHFR C677T基因多態(tài)性與缺血性腦卒中合并2型糖尿病的相關(guān)性研究

翁秋燕 查芹 牛艷芳

流行病學(xué)調(diào)查顯示，腦卒中已成為全球第二常見的死亡原因，我國的第一大死亡原因[1]。缺血性腦卒中約占腦卒中的80%[2]。2型糖尿病患者發(fā)生缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)是非糖尿病患者的1.5～3倍[3]。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一種蛋氨酸代謝過程中產(chǎn)生的非蛋白氨基酸。高Hcy血癥被認(rèn)為是發(fā)生缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，約20%～50%的缺血性腦卒中患者存在不同程度的高Hcy血癥[4]。5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶 （5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是Hcy代謝過程中的關(guān)鍵酶之一。MTHFR C677T的位點(diǎn)錯義突變可引起亞甲基四氫葉酸還原酶活性降低，導(dǎo)致血漿Hcy水平升高。本研究分析急性缺血性腦卒中合并2型糖尿病患者的MTHFR C677T基因分布特點(diǎn)及Hcy水平，探討兩者與缺血性腦卒中合并2型糖尿病的關(guān)系，為進(jìn)一步探索急性缺血性腦卒中合并2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015年6月至2017年5月寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的急性缺血性腦卒中患者200例。其中合并2型糖尿病患者（AIS+DM組）100例，男 59 例，女 41 例，年齡 40～82（62.46±10.24）歲。原有2型糖尿病78例，新診斷22例。不合并2型糖尿病患者（AIS組）100例，其中男56例，女44例，年齡42～85（61.09±9.59）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡 40～85 歲；（2）腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合“中國急性缺血性腦卒中診治指南2010”[5]，并且經(jīng)頭顱 MRI檢查證實(shí)；（3）2 型糖尿病均符合1999年WHO糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）其他類型糖尿??；（2）心、肝、腎功能不全，嚴(yán)重感染，腫瘤，其他內(nèi)分泌及自身免疫性疾病、腦血管畸形；（3）近期服用B族維生素、葉酸者；（4）原始資料不全，不配合相關(guān)檢查者。另選取同期寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院健康體檢者100例為對照組，其中男55例，女45例，年齡41～83（60.84±10.52）歲。本研究獲得寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會同意，所有入選者均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 血生化指標(biāo)檢測 所有研究對象均空腹≥8h，于次日清晨空腹采肘靜脈血，采用美國BECKMAN全自動生化免疫流水線檢測 FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、糖化血紅蛋白（HbA1c）、Hcy、葉酸水平。根據(jù)3組對象的MTHFR C677T不同基因型，比較各基因型亞組的Hcy水平。

1.2.2 類肝素藥物治療急性缺血性腦卒中試驗(yàn)（the trial of ORG 10172 in acute stroke treatment，TOAST）病因分型[6]根據(jù)TOAST病因分型，將AIS+DM組和AIS組分為5個亞型：（1）大動脈粥樣硬化性卒中（large-artery atherosclerosis，LAA），（2）小動脈閉塞性卒中（small artery occlusion，SAO），（3）心源性腦栓塞（cardio embolism，CE），（4）其它確定原因引發(fā)的缺血性卒中（stroke of other demonstrated etiology，SOE），（5）原因不明性缺血性卒中（stroke of undemonstrated etiology，SUE）。根據(jù)兩組患者的TOAST病因分型，比較TOAST分型亞組的MTHFR C677T基因多態(tài)性。

1.2.3 MTHFR C677T基因多態(tài)性檢測 所有對象采集空腹外周靜脈血5ml，EDTA抗凝，-20℃冰箱保存，備用。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性方法（PCR-RFLP）作 MTHFR C677T 基因多態(tài)性檢測：（1）基因組DNA抽提（1～1.5h）：用酚-氯仿法常規(guī)抽提基因組DNA。（2）PCR擴(kuò)增C677T所在位點(diǎn)的MTHFR基因（2h）：以抽提得到的基因組DNA為模版，對C677T所在位點(diǎn)的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)上游引物序列為：5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCG-3′；下游引物序列為：5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′。PCR反應(yīng)試劑盒購自北京泰百克生物技術(shù)有限公司。配制20μlPCR反應(yīng)體系：10μl上述 PCR 配方、1μl全血、1μl上游引物、1μl下游引物、加水補(bǔ)足20μl。PCR擴(kuò)增條件：95℃變性1min 后開始循環(huán)，95℃變性反應(yīng) 30s，58℃退火 30s，72℃延伸反應(yīng)1min，進(jìn)入25個循環(huán)，最后72℃反應(yīng)5min，16℃保存。（3）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切：反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行酶切，酶切體系包含有PCR產(chǎn)物，HifI酶，酶切緩沖液和水，37℃水浴鍋中酶切 1h。（4）電泳檢測（1～1.5h）：在2.5%的凝膠上進(jìn)行電泳，加入原PCR產(chǎn)物和酶切后的溶液以及小分子量核酸 Marker，100v恒壓電泳40min。對結(jié)果使用凝膠成像儀進(jìn)行拍照和記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用logistic回歸分析計(jì)算OR值95%CI。用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)確認(rèn)樣本的群體代表性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組對象臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較 見表1。

由表1可見，3組對象性別、年齡、TC、TG、HDL-C比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。AIS+DM組與AIS組患者的收縮壓、FPG、LDL-C水平均高于對照組（t=4.760、12.961、4.440，6.345、5.254、4.914，均P＜0.05）。AIS組及對照組的舒張壓、Hcy水平均低于AIS+DM組（t=1.815、6.875，3.437、8.835，均P＜0.05）。AIS組及對照組的葉酸水平均高于AIS+DM組（t=-9.635、-9.010，均P＜0.05）。

表1 3組研究對象臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較

2.2 AIS+DM組與AIS組的TOAST病因分型比較 兩組TOAST病因分型中，無一例為SOE，其它4型比較見表2。

表2 AIS+DM組與AIS組的TOAST病因分型比較[例（%）]

由表2可見，兩組患者的TOAST病因分型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

此外，群體代表性檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AIS+DM組、AIS組及對照組MTHFR C677T基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，提示樣本具有群體代表性。

2.3 MTHFR C677T基因多態(tài)性分析 見圖1。

由圖1可見，MTHFR基因C677T經(jīng)過PCR擴(kuò)增后可以得到198bp長的DNA片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)過限制性內(nèi)切酶Hin f I作用后：如果為純合子突變（TT型），酶切后得到172bp片段；如果為野生型（CC型），酶切后僅有198bp片段；如果為雜合子突變（C/T型），酶切后會得到2個片段：包含198bp和172bp 2個片段。

2.4 3組對象MTHFR C677T基因多態(tài)性頻率的比較見表3。

表3 3組對象MTHFRC677T基因多態(tài)性頻率的比較[例（%）]

由表3可見，3組對象的MTHFR C677T基因型頻率、等位基因頻率的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AIS+DM組患者M(jìn)THFR C677T基因型頻率與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.755，P＜0.05）。AIS+DM組患者T等位基因頻率高于AIS組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.536，P ＞0.05）。AIS+DM 組、AIS組患者等位基因頻率與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.275、5.349，P＜0.05）。

2.5 AIS+DM組與AIS組患者TOAST病因分型亞組MTHFR C677T基因多態(tài)性比較 見表4。

由表4可見，AIS+DM組與AIS組患者不同TOAST病因分型亞組的MTHFR C677T基因型頻率、等位基因頻率分布中，在SAO亞組水平，AIS+DM組與AIS組MTHFR C677T基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.673，P＜0.05）。在LAA亞組水平，AIS+DM組T等位基因頻率大于AIS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.102，P＜0.05）。

2.6 3組MTHFR C677T不同基因型者Hcy水平的比較 見表5。

表4 AIS+DM組與AIS組患者TOAST病因分型亞組MTHFR C677T基因多態(tài)性比較[例（%）]

表5 3組MTHFR C677T不同基因型者Hcy水平的比較（μmol/L）

由表5可見，3組CT型、TT型對象的血漿Hcy水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AIS+DM組CT型、TT型Hcy水平均大于AIS組及對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-11.448、-10.726，-15.387、-10.116，均P＜0.05）。

2.7 AIS+DM組患者多因素非條件logistic回歸分析結(jié)果 以AIS合并DM為因變量Y，分別對MTHFR C677T 基因型、高 Hcy、性別、TG、LDL-C、HDL-C 等進(jìn)行多因素logistic回歸分析，見表6。

由表6可見，影響腦梗死合并2型糖尿病發(fā)生的獨(dú)立因素為LDL-C、葉酸、高Hcy、MTHFR攜帶T等位基因（MTFHRC CT/T7）、高血壓。從OR值來看，葉酸是保護(hù)性因素；LDL-C、高Hcy、MTHFR C677T攜帶T等位基因（MTFHRC CT/T7）、高血壓是危險(xiǎn)因素。

表6 AIS+DM組患者多因素非條件logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

缺血性腦卒中是由遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的多因子疾病。傳統(tǒng)的高危因素包括高血壓、高脂血癥、糖尿病、吸煙等。近年來，高Hcy血癥被視為急性缺血性腦卒中發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[7-8]，其在AIS的具體機(jī)制包括：（1）通過抑制一氧化氮合酶減少NO生成，對血管內(nèi)皮產(chǎn)生毒性損傷血管內(nèi)皮的舒張功能，從而影響腦梗死后新生血管及側(cè)支循環(huán)的形成；（2）促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)及炎癥因子的合成，激活動脈壁的慢性炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步導(dǎo)致動脈粥樣硬化；（3）引起血管內(nèi)皮損傷，增加泡沫細(xì)胞生成，促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

本研究顯示，AIS+DM組患者的血漿Hcy水平明顯高于AIS組及對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多因素logistic回歸分析，提示高Hcy是影響腦梗死合并2型糖尿病發(fā)生的危險(xiǎn)因素。Zhu等[9]對165例2型糖尿病患者進(jìn)行MTHFR C677T基因多態(tài)性檢測，其中伴有缺血性卒中患者23例，結(jié)果顯示CT型、TT型的腦卒中發(fā)生率分別為18%、21%，明顯高于CC型6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TT型的血漿Hcy水平高于CT型及CC型。但該研究病例選擇不是隨機(jī)的，存在一定的局限性。趙小頔等學(xué)者[10]研究2型糖尿病合并腦梗死組的血清Hcy水平高于單純2型糖尿病組。

高Hcy血癥影響腦梗死合并2型糖尿病發(fā)生的機(jī)制尚未明確，可能包括：胰島素通過影響Hcy代謝中的某些酶如胱硫醚B合成酶的活性增高血漿Hcy水平，從而刺激血管平滑肌細(xì)胞向血管內(nèi)膜移動及增殖，加重血管內(nèi)膜增生，誘發(fā)動脈粥樣硬化及胰島素抵抗[11]。Hcy與糖基化終末產(chǎn)物相互作用后使血栓調(diào)節(jié)蛋白分泌增加，其與糖基化終末產(chǎn)物在血管內(nèi)皮損傷過程中相互協(xié)同[12]。

MTHFR C677T基因多態(tài)性的分布因不同地域、不同人種存在差異。本研究中T等位基因頻率在AIS+DM組、AIS組及對照組分別為56.5%、50.5%、39.0%。與學(xué)者趙小頔等[10]AIS+DM組T等位基因頻率64.81%研究結(jié)果相近。目前國內(nèi)外關(guān)于MTHFR C677T基因多態(tài)性與腦梗死合并2型糖尿病相關(guān)性的研究尚少，結(jié)果存在爭議。Zhu等[9]研究認(rèn)為純合子及雜合子中的T等位基因攜帶均增加2型糖尿病發(fā)生腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)，其中T等位基因?yàn)槲ｋU(xiǎn)因素，C等位基因可能是保護(hù)性因素。另有研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T TT型基因增加2型糖尿病患者發(fā)生急性缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)[13]。Kim等[14]對韓國人群研究發(fā)現(xiàn)，在急性缺血性腦卒中伴代謝綜合征病例組TT型基因頻率顯著高于單純急性缺血性腦卒中組及正常對照組，提示MTHFR C677T基因多態(tài)性可能與急性缺血性腦卒中患者的患代謝綜合征風(fēng)險(xiǎn)增高有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T攜帶T等位基因是腦梗死合并2型糖尿病的危險(xiǎn)因素，OR值為2.387。MTHFR C677T基因突變可能與急性缺血性腦卒中合并2型糖尿病易感性相關(guān)。

MTHFR C677T基因多態(tài)性與急性缺血性腦卒中的TOAST分型之間的相關(guān)性目前仍存在爭議。國內(nèi)外大量研究提示MTHFR C677T基因多態(tài)性是急性缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素[15-16]，而TT基因型可能導(dǎo)致缺血性腦卒中發(fā)生提前。歐洲學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T基因突變與歐洲人群LAA相關(guān)[17]。MTHFR C677T基因多態(tài)性可能是SAO的遺傳危險(xiǎn)因子。而我們的研究發(fā)現(xiàn)，AIS+DM組T等位基因頻率大于AIS組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而LAA亞組水平，AIS+DM組T等位基因頻率64.9%大于AIS組的43.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此提示MTHFR C677T基因多態(tài)性與腦梗死合并2型糖尿病的TOAST分型的LAA相關(guān)。各研究結(jié)果的不同可能與地域、人種、研究方法及納入的樣本量大小相關(guān)。目前國內(nèi)外關(guān)于MTHFR C677T基因多態(tài)性與缺血性腦卒中合并2型糖尿病的相關(guān)性研究尚少。

本研究探討了MTHFR C677T基因多態(tài)性與缺血性腦卒中合并2型糖尿病的相關(guān)性，確立MTFHR C677T攜帶T等位基因是缺血性腦卒中合并2型糖尿病的危險(xiǎn)因素，發(fā)病機(jī)制可能與大動脈粥樣硬化有關(guān)。此結(jié)論尚需大規(guī)模臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。