肺腺癌Ubiquilin 1蛋白的表達(dá)與臨床病理關(guān)系的研究

孟文 王聞?wù)?孟靖飛 馮興 江洪 王宇 王效舉

肺癌是嚴(yán)重影響人群生命健康的惡性腫瘤之一[1]，肺腺癌是肺癌主要的病理類型。盡管針對肺癌的治療已有長足的進(jìn)步，但目前其5年生存率仍然較差[2]。發(fā)現(xiàn)有效的肺癌標(biāo)志物，從而篩選出肺癌手術(shù)后的高危患者，及時采取有效的治療措施，對延長手術(shù)后患者生存期有重要意義。Ubiquilin 1蛋白是泛素樣蛋白，可以介導(dǎo)錯誤折疊蛋白的降解，參與一些病理生理過程[3]。本研究探討肺腺癌中Ubiquilin 1蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 由國家人類遺傳資源共享服務(wù)平臺提供并制作的肺腺癌組織芯片，為2004年7月至2009年6月90例肺腺癌手術(shù)切除的標(biāo)本，男49例，女41例，年齡30～84（62.4±9.9）歲。其中根治性手術(shù) 79 例，非根治性手術(shù)8例，手術(shù)方式不詳3例。平臺編號：2005DKA21300；實驗編號：13939；陣列編號：HLug-Ade180Sur-01；分析點(diǎn)數(shù)：180，包括90例患者肺腺癌組織點(diǎn)和配對癌旁正

常組織點(diǎn)。組織芯片樣點(diǎn)包括肺腺癌癌區(qū)域及配對正常癌旁組織（距腫瘤＞3.0cm），均經(jīng)病理檢查證實。病理分期根據(jù)肺癌第七版TNM分期。生存時間從手術(shù)結(jié)束時間開始計算，隨訪時間5～10年。另選擇杭州市第一人民醫(yī)院2012年1月至2014年6月因肺結(jié)節(jié)住院手術(shù)的患者17例作為對照，手術(shù)后診斷均為肺良性病變，包括肺錯構(gòu)瘤7例，肺肉芽腫性變4例，硬化性血管瘤2例，炎性假瘤4例。本研究經(jīng)杭州市第一人民醫(yī)院倫理學(xué)委員會同意，所有患者均知情同意并填寫知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色及分析 所用抗體Anti-Ubiquilin1購于杭州麥通生物技術(shù)有限公司（Abcam公司，目錄號：ab128011）。應(yīng)用免疫組化Envision二步法完成免疫組化實驗，抗體的稀釋度：1∶1 500。兩位病理醫(yī)師獨(dú)自做出判斷,對于有異議或疑難病例，由上級醫(yī)師會診，做出最終診斷。定位判定：細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞核。染色強(qiáng)度的判定：在低倍鏡下對整個視野進(jìn)行觀察，將染色強(qiáng)度分為4級：0分：細(xì)胞無染色；1分：輕度染色，淡黃色；2分：中度染色，棕黃色；3分：強(qiáng)染色，棕褐色。選取3個不同的染色強(qiáng)度視野，在高倍鏡下分別估算其陽性率，取其平均值，將染色比例分為5級：0分：陽性細(xì)胞數(shù)＜5%；1分：5%～25%的陽性細(xì)胞；2分：26%～50%的陽性細(xì)胞；3分：51%～75%的陽性細(xì)胞；4分：≥76%的陽性細(xì)胞。表達(dá)水平=染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)+染色比例分?jǐn)?shù)。表達(dá)水平0～3為低表達(dá)，4～7為高表達(dá)。

1.2.2 觀察指標(biāo) （1）應(yīng)用免疫組化的方法對組織芯片進(jìn)行Ubiquilin1蛋白染色，判斷癌組織及癌旁組織之間的表達(dá)差異。（2）分析肺腺癌Ubiquilin1蛋白的高表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、癌的分化分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、癌旁Ubiquilin1蛋白高表達(dá)、5年生存率、表皮生長因子受體（EGFR）狀態(tài)的關(guān)系。（3）分析癌旁U-biquilin1蛋白的高表達(dá)、癌的高表達(dá)、性別、年齡、腫瘤大小、癌的分化分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤的位置與生存的關(guān)系。（4）分析癌及癌旁Ubiquilin1蛋白表達(dá)與生存的關(guān)系。（5）對17例肺良性疾患的組織切片進(jìn)行Ubiquilin1蛋白染色，分析其表達(dá)，并與肺腺癌及癌旁表達(dá)比較。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。肺腺癌及配對癌旁之間的Ubiquilin 1蛋白的表達(dá)差異應(yīng)用paired Wilcoxon檢驗。Ubiquilin 1蛋白的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系采用χ2檢驗。多因素Cox回歸模型分析對預(yù)后有意義的因素，采用Kaplan-Meier的方法繪制生存曲線，并采用Log-nank統(tǒng)計檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌和癌旁中Ubiquilin 1蛋白表達(dá)的比較 在芯片制作過程中發(fā)生脫片2例，故在隨后的研究中刪除此2例，共計88例。典型病例結(jié)果見圖1-3（插頁）。

由圖1-3可見，典型病例1患者肺腺癌及癌旁均可見Ubiquilin 1蛋白高表達(dá)。典型病例2患者肺腺癌高表達(dá)，癌旁低表達(dá)。典型病例3肺腺癌及癌旁均可見低表達(dá)。陽性染色位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞膜及細(xì)胞核無染色。88例腺癌組織中,高表達(dá)60例（68.2%），而配對癌旁高表達(dá)僅為26例（29.5%）。兩者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-5.831，P＜0.01）。17例肺良性病變患者中，高表達(dá)3例（17.6%），其中肺錯構(gòu)瘤2例，炎性肉芽腫陽性1例，高表達(dá)率與肺腺癌高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15.160，P＜0.01），與癌旁高表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.502，P=0.479）。

2.2 肺腺癌Ubiquilin 1蛋白表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系隨訪過程中，EGFR表達(dá)信息不全7例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移信息不全3例，病理分期結(jié)果缺失4例，肺腺癌組織中U-biquilin 1蛋白表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系見表1。

由表1可見，肺腺癌高表達(dá)與配對癌旁高表達(dá)及5年生存率相關(guān)（P＜0.01）。但與性別、年齡、腫瘤大小、癌的分化分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、EGFR表達(dá)均無關(guān)（均P＞0.05）。

2.3 肺腺癌的生存分析 見表2、圖4。

由表2可見，肺癌中高表達(dá)、癌旁中高表達(dá)、TNM分期、性別、癌的分化分級是回歸模型篩選出來的預(yù)后因子，其中，肺癌中高表達(dá)、癌旁中高表達(dá)、TNM分期、性別是統(tǒng)計學(xué)有意義的預(yù)后指標(biāo)（P＜0.05）。

由圖4可見，肺癌高表達(dá)及癌旁高表達(dá)均與不良預(yù)后有關(guān)（P＜0.000）。

3 討論

Ubiquilin1蛋白與肺腺癌的關(guān)系目前還未定論。目前對該蛋白結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，其包含了泛素樣（UBL）區(qū)域、泛素相關(guān)（UBA）區(qū)域、多個熱休克伴侶（STI）區(qū)域，Ubiquilin 1蛋白通過UBA區(qū)域與泛素化蛋白相互作用，通過UBL區(qū)域與蛋白酶體相互作用[4-6]。因此，其可以在泛素化蛋白和蛋白酶體之間充當(dāng)“橋梁”作用，促進(jìn)泛素化蛋白的降解，通過這種機(jī)制參與多種病理或生理過程。Beverly等[3]研究顯示，Ubiquilin1蛋白能與抗凋亡基因BCL2編碼的BCLb相互作用，促進(jìn)BCLb多個位點(diǎn)的泛素化，這對保持BCLb的穩(wěn)定性有重要意義，所以其在抗凋亡過程中起重要作用。Funakoshi等[7]報道，非洲爪蟾Ubiquilin 1同源基因XDRP1，與cyclinA（A1和A2）結(jié)合，有阻止爪蟾胚胎細(xì)胞進(jìn)一步分化的作用。Ubiquilin 1還可與腫瘤抑制蛋白DAN和S蛋白相互作用，調(diào)整DNA合成，進(jìn)而影響細(xì)胞分化。Ubiquilin 1與腫瘤作用機(jī)制研究愈來愈引起人們的興趣，但詳細(xì)的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

表1 肺腺癌Ubiquilin 1蛋白的高表達(dá)與臨床特征病理關(guān)系

少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌Ubiquilin 1 mRNA水平較正常對照顯著增高[3，8]。Chen 等[8]應(yīng)用 Western blot的方法，對9例肺腺癌和配對癌旁組織的比較發(fā)現(xiàn)：Ubiquilin 1蛋白水平在肺腺癌中高于癌旁正常對照，血清Ubiquilin 1自身抗體對肺腺癌的診斷起重要作用[8-11]。所以，先前的研究提示Ubiquilin 1很可能參與了肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，Ubiquilin 1蛋白可能與肺腺癌的臨床病理存在著某種重要的聯(lián)系。

表2 肺腺癌預(yù)后變量分析

圖4 Kaplan-Meier曲線分析Ubiquilin1蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系（a:肺腺癌組織中Ubiquilin1蛋白高表達(dá)與低表達(dá)的比較；b:肺腺癌癌旁組織Ubiquilin1蛋白高表達(dá)與低表達(dá)的比較）

本研究發(fā)現(xiàn)：肺腺癌組織中Ubiquilin 1蛋白的表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，并且高于配對的癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，Ubiquilin 1在肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中充當(dāng)重要的角色，而其具體的作用位置可能就在細(xì)胞質(zhì)。關(guān)于Ubiquilin 1與預(yù)后的研究，Beverly在其基因水平，對少數(shù)肺腺癌患者進(jìn)行了初步的研究，Beverly等[3]研究了19例低表達(dá)的肺癌患者以及19例高表達(dá)肺癌患者發(fā)現(xiàn)高表達(dá)患者的預(yù)后較差。該項研究通過組織芯片技術(shù)（TMA）對88例肺腺癌與長期預(yù)后的關(guān)系（5～10年）研究，發(fā)現(xiàn)Ubiquilin 1在蛋白水平亦與長期不良預(yù)后相關(guān)。Ubiquilin 1蛋白高表達(dá)與性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、EGFR表達(dá)狀態(tài)無關(guān)。該研究還發(fā)現(xiàn)，肺癌高表達(dá)Ubiquilin 1、腫瘤分期是肺腺癌生存模型中有統(tǒng)計學(xué)意義的因素。因此，Ubiquilin 1可以作為肺腺癌手術(shù)后潛在的重要預(yù)測因子，對于篩選手術(shù)后高危患者可能有重要的補(bǔ)充意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，Ubiquilin 1蛋白在癌旁中的高表達(dá)與肺腺癌不良預(yù)后有關(guān)，提示Ubiquilin 1在肺腺癌癌旁微環(huán)境中可能扮演重要角色。癌旁組織中的高U-biquilin 1對于肺腺癌的生長及進(jìn)展起促進(jìn)作用。另外一項研究提示Ubiquilin 1在腫瘤發(fā)生過程中起調(diào)節(jié)作用，具有抑制遷移及非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用[12]。所以，Ubiquilin 1在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展中所充當(dāng)?shù)慕巧赡芟喈?dāng)復(fù)雜，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究較為系統(tǒng)地研究了Ubiquilin 1與肺腺癌臨床病理、預(yù)后的關(guān)系，隨訪時間較長，達(dá)到5～10年。研究證明肺腺癌及癌旁正常高表達(dá)U-biquilin 1蛋白與不良預(yù)后有關(guān)，其可以作為潛在的評價預(yù)后指標(biāo)，指導(dǎo)肺腺癌的手術(shù)后治療。Ubiquilin 1與肺腺癌之間的具體作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究。

圖1 典型病例1的HE染色結(jié)果及免疫組化染色結(jié)果（a:腺癌組織，HE染色，×35；b：癌旁組織，HE染色，×35；c：腺癌組織，免疫組化染色，×35；d：癌旁組織，免疫組化染色，×35）

圖2 典型病例2的HE染色結(jié)果及免疫組化染色結(jié)果（a:腺癌組織，HE染色，×35；b：癌旁組織，HE染色，×35；c：腺癌組織，免疫組化染色，×35；d：癌旁組織，免疫組化染色，×35）

圖3 典型病例3的HE染色結(jié)果及免疫組化染色結(jié)果（a:腺癌組織，HE染色，×35；b：癌旁組織，HE染色，×35；c：腺癌組織，免疫組化染色，×35；d：癌旁組織，免疫組化染色，×35）