改性桑枝韌皮纖維素納米協(xié)同抗菌劑的研究

王小燕 劉利 曾秀 谷山林 馬群忠 熊定奎 王海燕

摘要： 為了克服無(wú)機(jī)抗菌劑納米銀易團(tuán)聚的缺點(diǎn)，有效改善四環(huán)素長(zhǎng)期使用產(chǎn)生的耐藥性及副作用問(wèn)題，以廢棄桑枝韌皮為原料，采用化學(xué)方法去除果膠、木質(zhì)素和半纖維素制備桑枝韌皮纖維素，用氯乙酸反應(yīng)對(duì)桑枝韌皮進(jìn)行表面改性，并將四環(huán)素以化學(xué)鍵形式牢固修飾在纖維素表面，納米銀成功負(fù)載在纖維素中，創(chuàng)造性地制備了載銀改性桑枝韌皮纖維素（Ag?T?CMC）協(xié)同抗菌劑。試驗(yàn)結(jié)果表明：Ag?T?CMC呈現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌性能和較好的協(xié)同抗菌性，載銀量在1.5%時(shí)抗菌性能最優(yōu);且對(duì)動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性，有望實(shí)現(xiàn)在傷口敷料上的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞： 桑枝韌皮;纖維素;納米銀;抗生素;耐藥性;協(xié)同抗菌

Study on synergistic antibacterial agent of Ag?carried tetracycline?mulberry bast carboxymethyl cellulose

WANG Xiaoyan1， LIU Li2， ZENG Xiu1， GU Shanlin1， MA Qunzhong1， XIONG Dingkui1， WANG Haiyan1

（1.Chongqing Academic of Animal Science， Chongqing 402460， China;

2.Chongqing Academy of Metrology and Quality Inspection of Third Branch， Chongqing 402160， China）

Abstract： In order to overcome the shortcoming of inorganic antibacterial agent nano?Ag easy to agglomerate， and effectively solve the drug resistance and side effects caused by the long?term use of tetracycline， Ag?modified mulberry bast fiber （Ag?T?CMC） synergistic antibacterial agent was creatively prepared by the following method and materials： discarded mulberry bast was used as the raw material， and pectin， lignin and hemicellulose were removed chemically to prepare mulberry bast cellulose; chloroacetic acid was used to modify mulberry bast， and tetracycline is firmly modified on cellulose surface in the form of chemical bond to successfully load nano?Ag in cellulose. The results showed that Ag?T?CMC exhibited excellent antibacterial properties and good synergistic antibacterial properties. The antibacterial property was optimal when the Ag?loaded quantity was 1.5%. Besides， it is not cytotoxic to animal cells， so it is expected to be applied to wound dressings.

Key words： mulberry bast; cellulose; nano?Ag; antibiotic; drug resistance; synergistic antiseptic

四環(huán)素是一種廣譜抗生素[1]，有較強(qiáng)的抗菌作用，但四環(huán)素進(jìn)入人體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生很多副作用[2]，如導(dǎo)致牙黃和影響胃腸功能，并且長(zhǎng)期使用容易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[3];無(wú)機(jī)納米抗菌劑較傳統(tǒng)抗生素不存在耐藥性問(wèn)題[4]。其中納米銀抗菌效果最好，但是納米銀有易團(tuán)聚的特點(diǎn)，且納米銀單獨(dú)使用具有細(xì)胞毒性。為了克服單一抗菌劑的缺點(diǎn)，LIU等[4]首次制備出載銀有機(jī)膦酸鋯有機(jī)?無(wú)機(jī)協(xié)同抗菌劑，創(chuàng)造性地組合了有機(jī)抗菌劑和無(wú)機(jī)抗菌劑的優(yōu)點(diǎn)，但其價(jià)格昂貴難以從應(yīng)用上得到推廣。

桑枝為桑園冬管的大宗副產(chǎn)物，量大且是制漿、制板的良好材料，其韌皮還可以提取纖維素進(jìn)一步制備納米纖維素。納米纖維素具有較大的比表面積[5]，故具有較大的吸附能力，能夠吸附納米銀等納米顆粒，因此，納米纖維素可以作為納米銀的載體。且納米纖維素分子具有較多羥基官能團(tuán)，能夠用氯乙酸進(jìn)行表面修飾得到化學(xué)活性更好的羧甲基納米纖維素[6]，進(jìn)而能夠在纖維素表面修飾具有抗菌功能的官能團(tuán)。制備出有機(jī)?無(wú)機(jī)協(xié)同抗菌劑，該抗菌劑既擁有有機(jī)抗菌劑的廣譜抗菌性和無(wú)機(jī)抗菌劑的長(zhǎng)效性等優(yōu)點(diǎn)，能有效解決四環(huán)素長(zhǎng)期使用產(chǎn)生的耐藥性、副作用和無(wú)機(jī)抗菌劑易團(tuán)聚的問(wèn)題。

1?試?驗(yàn)

1.1?材料與試劑

桑枝（重慶市畜牧科學(xué)院蠶業(yè)研究所），無(wú)水乙醇、異丙醇、甲基異丙酮、氯乙酸、硝酸銀、葡萄糖均為國(guó)產(chǎn)分析純AR（成都市科龍化工試劑廠(chǎng)），牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉為生化試劑BR（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），金黃色葡萄球菌、大腸桿菌（青島海博生物技術(shù)有限公司）。

1.2?儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），SHZ?D循環(huán)真空泵和DF?101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），THC?10B數(shù)控超聲波提取機(jī)（濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司），Nicolet170SX傅立葉變換紅外光譜儀（美國(guó)Madison公司），XRD?3D X射線(xiàn)衍射儀（北京普析通用儀器有限公司）。

1.3?羧甲基化纖維素的制備

將桑枝韌皮干燥后粉碎過(guò)60目篩，稱(chēng)取桑枝韌皮粉60g，加甲基異丙酮300mL，95%乙醇192mL，異丙醇60mL，去離子水48mL，于1000mL圓底燒瓶中。在溫度60℃，功率600W提取120min，40℃恒溫水浴保溫3h，待完全沉淀后抽濾，95%乙醇洗滌去雜質(zhì)，取濾餅50℃干燥得桑枝韌皮纖維素，取10g桑枝韌皮纖維素，400mL異丙醇，10mL 50%氯乙酸乙醇溶液于1000mL圓底燒瓶中，80℃恒溫水浴2h，抽濾，無(wú)水乙醇洗滌去雜質(zhì)，50℃干燥得羧甲基化纖維素（carboxymethyl cellulose， CMC）。

1.4?改性桑枝韌皮纖維素納米協(xié)同抗菌劑的制備

取10g上述羧甲基化纖維素，加600mL 95%乙醇于1000mL圓底燒瓶中，待磁力攪拌分散均勻后，加入5g四環(huán)素，于室溫條件下避光反應(yīng)6h，抽濾，烘干得四環(huán)素?羧甲基韌皮纖維素（tetracycline?carboxymethyl cellulose T?CMC）;取5g上述四環(huán)素?羧甲基韌皮纖維素于500mL圓底燒瓶中，加250mL 95%乙醇，磁力攪拌分散均勻后加入0.1g硝酸銀，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h后加入1mL 0.05g/mL的抗壞血酸乙醇溶液，攪拌反應(yīng)0.5h后過(guò)濾干燥即得載銀改性桑枝韌皮纖維素（Ag?tetracycline?carboxymethyl cellulose， Ag?T?CMC）協(xié)同抗菌材料。

1.5?抗菌性能評(píng)價(jià)

取具有代表性的兩種細(xì)菌進(jìn)行抗菌試驗(yàn)：即金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922。

抗菌性能測(cè)試通過(guò)二倍稀釋法在96孔板上完成，由紫外?可見(jiàn)分光光度計(jì)來(lái)測(cè)試細(xì)菌生長(zhǎng)狀況，波長(zhǎng)600nm測(cè)OD值，每個(gè)組重復(fù)測(cè)3次，結(jié)果取平均值。其中最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration， MIC）是指目標(biāo)化合物可以殺死99%的細(xì)菌的最低濃度，通常以美國(guó)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)推薦的方法為標(biāo)準(zhǔn)[7]。選用革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌各一種：即金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922評(píng)價(jià)制備的改性桑枝韌皮纖維素納米協(xié)同抗菌材料的抗菌活性。

1.6?安全性評(píng)價(jià)

1.6.1?四環(huán)素釋放測(cè)試

取1g抗菌性能最佳的Ag?T?CMC樣品于半透膜中，將半透膜置于燒杯中，加入100mL、pH7.4的緩沖溶液攪拌，每隔1h用紫外?可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為350nm處測(cè)試溶液中四環(huán)素的濃度。

1.6.2?細(xì)胞毒性試驗(yàn)

T?CMC和Ag?T?CMC體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)測(cè)試細(xì)胞選用人體肺腺癌細(xì)胞（A549）。用細(xì)胞計(jì)數(shù)（cell counting Kit?8，CCK?8）法分析[8]，當(dāng)有活細(xì)胞存在時(shí)CCK?8的主要成分2?（2?甲氧基?4?硝苯基）?3?（4?硝苯基）?5?（2，4?二磺基苯）?2H?四唑單鈉鹽（WST?8）會(huì)被還原為水溶性的黃色的甲臜產(chǎn)物，生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，細(xì)胞的存活率通過(guò)紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為450nm處的OD值檢測(cè)。

2?結(jié)果與分析

2.1?結(jié)構(gòu)分析

2.1.1?紅外數(shù)據(jù)分析

桑枝韌皮纖維素、羧甲基化纖維素（CMC）、四環(huán)素?羧甲基韌皮纖維素（T?CMC）的傅里葉紅外光譜如圖1所示。由圖1可知，波長(zhǎng)在3430cm-1處有較強(qiáng)的吸收峰，對(duì)應(yīng)纖維素的━OH伸縮振動(dòng)吸收峰，2900cm-1處的峰對(duì)應(yīng)━C━H伸縮振動(dòng)吸收峰，1635cm-1處的峰對(duì)應(yīng)━C═O吸收峰，1060cm-1處的峰對(duì)應(yīng)━C━O伸縮振動(dòng)吸收峰，668cm-1處的峰對(duì)應(yīng)━OH變形振動(dòng)峰，以上共同構(gòu)成了纖維素的紅外光譜圖。圖1中，T?CMC在1320cm-1處出現(xiàn)了特征吸收峰，該峰對(duì)應(yīng)四環(huán)素中━C━N吸收峰，證明成功合成了四環(huán)素?羧甲基韌皮纖維素。

2.1.2?X射線(xiàn)衍射分析（XRD）

桑枝韌皮纖維素、T?CMC、Ag?T?CMC的X射線(xiàn)衍射如圖2所示。由圖2可知，在2θ角為22.7°處有共同衍射峰，該峰對(duì)應(yīng)纖維素[002]晶面衍射峰;圖2中，Ag?T?CMC在2θ角為38.3°處出現(xiàn)一個(gè)較強(qiáng)的衍射峰，對(duì)應(yīng)納米銀的[111]晶面的衍射峰，證明納米銀被成功負(fù)載。

2.1.3?透射電鏡分析（TEM）

Ag?T?CMC的TEM表征如圖3所示。從圖3可以看見(jiàn)，納米銀顆粒均勻分布在纖維素之間，與X射線(xiàn)衍射分析相對(duì)應(yīng)，證明成功負(fù)載了納米銀，納米銀平均尺寸約為20nm。

2.2?抗菌性能表征

2.2.1?MIC值

抗菌性能采用MIC值判定，納米銀、T?CMC、Ag?T?CMC的MIC值如表1所示，納米銀對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別是64μg/mL和128μg/mL[9]，Ag?T?CMC對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別是8μg/mL和16μg/mL，比單獨(dú)的納米銀和T?CMC的抗菌性能強(qiáng)。為了探索Ag?T?CMC中的最佳納米銀比例，做了不同納米銀含量的Ag?T?CMC的MIC值，結(jié)果如圖4所示，隨著納米銀含量的增大，MIC值先減小后增大，當(dāng)納米銀含量在1.5%時(shí)達(dá)到最低。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因，分析認(rèn)為：開(kāi)始，隨著納米銀含量的增加，Ag?T?CMC的協(xié)同抗菌性能增強(qiáng);但隨著納米銀含量的增大，大于1.5%時(shí)，納米銀的尺寸變大，Ag?T?CMC的抗菌效果減弱。

2.2.2?協(xié)同抗菌性

分級(jí)抑菌濃度（fractional inhibitory concentration， FIC）用MIC值通過(guò)式（1）計(jì)算，當(dāng)FIC≤0.5，為協(xié)同作用;當(dāng)0.52，為拮抗作用[10?11]。不同納米銀含量的Ag?T?CMC的FIC值見(jiàn)表2，當(dāng)納米銀含量為0.25%時(shí)Ag?T?CMC中的納米銀和T?CMC無(wú)相關(guān)作用;隨著納米銀含量增加到0.5%時(shí)，Ag?T?CMC中的納米銀和T?CMC呈現(xiàn)出相加作用;當(dāng)納米銀含量進(jìn)一步增大，Ag?T?CMC中的納米銀和T?CMC呈現(xiàn)出協(xié)同抗菌作用，且協(xié)同抗菌性變化趨勢(shì)與抗菌性保持一致。

FIC=MIC0MIC1+MIC0MIC2（1）

式中：MIC0為Ag?T?CMC的MIC值，MIC1為T(mén)?CMC的MIC值，MIC2為Ag NPS的MIC值。

2.3?安全性能表征

2.3.1?四環(huán)素釋放表征

四環(huán)素進(jìn)入人體會(huì)對(duì)人造成一定副作用，為了保證抗菌劑的安全性，Ag?T?CMC中的四環(huán)素必須牢固負(fù)載在纖維素上。為了探究Ag?T?CMC的安全性，模擬人體pH值環(huán)境（pH7.4）做四環(huán)素釋放表征。四環(huán)素釋放結(jié)果如圖5所示，在5h前Ag?T?CMC緩慢釋放出微量四環(huán)素，釋放最大濃度為0.11μg/mL，當(dāng)5h后四環(huán)素不再被釋放。分析認(rèn)為，這可能是大部分四環(huán)素與羧甲基化的纖維素以化學(xué)鍵牢固結(jié)合的同時(shí)，有微量四環(huán)素是被物理表面吸附在纖維素中，在溶液中微量四環(huán)素被釋放出來(lái)。為了進(jìn)一步探索四環(huán)素釋放原因，取出釋放24h的樣品再次放入100mL緩沖溶液（pH7.4）中進(jìn)行釋放表征，在新的緩沖溶液中未檢測(cè)出四環(huán)素，進(jìn)一步證明猜想是正確的。

2.3.2?細(xì)胞毒性

圖6為細(xì)胞毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)。從圖6可以看出，當(dāng)Ag?T?CMC的質(zhì)量濃度達(dá)到256μg/mL時(shí)A549細(xì)胞存活率依然是100%，證明在該濃度下Ag?T?CMC對(duì)細(xì)胞活性也無(wú)毒性，進(jìn)一步說(shuō)明在Ag?T?CMC抗菌劑使用量的范圍內(nèi)對(duì)人體和動(dòng)物是無(wú)細(xì)胞毒性的。

3?結(jié)?論

本研究制備的協(xié)同抗菌劑載銀改性桑枝韌皮纖維素（Ag?T?CMC），載銀比例在1.5%時(shí)Ag?T?CMC的抗菌性能最佳，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC值分別是8μg/mL和16μg/mL，且該比例協(xié)同抗菌性最佳（FIC 0.125），四環(huán)素以化學(xué)鍵形式與纖維素牢固結(jié)合，在Ag?T?CMC的質(zhì)量濃度達(dá)到256μg/mL時(shí)依然對(duì)A549細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。Ag?T?CMC優(yōu)異的抗菌性能和良好的生物相容性，使得它在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域尤其是傷口敷料上有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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