錦雞兒總黃酮預(yù)處理對局灶性腦缺血再灌注損傷模型大鼠血腦屏障通透性的影響及機(jī)制研究

張亞洲 何前松 胡斐然 樊梓媛

中圖分類號 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）13-1793-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.16

摘 要 目的：研究錦雞兒總黃酮（TFC）預(yù)處理對局灶性腦缺血再灌注損傷模型大鼠血腦屏障通透性的影響及機(jī)制，為其進(jìn)一步開發(fā)和臨床用于治療缺血性腦卒中提供參考。方法：將120只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組（陽性對照，12.6 mg/kg）和TFC高、中、低劑量組（60、30、15 mg/kg），每組20只。各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。末次灌胃2h后，除假手術(shù)組外的其余各組大鼠均采用線栓法復(fù)制局灶性腦缺血再灌注損傷模型。再灌注24 h后，進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色計(jì)算腦梗死面積百分比，分光光度法測定腦組織中伊文思藍(lán)含量以考察血腦屏障的通透性；Western blot法檢測腦缺血半暗帶區(qū)基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、MMP-2和血腦屏障緊密連接相關(guān)蛋白Claudin-5、Occluding的表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積百分比、腦組織中伊文思藍(lán)含量和腦缺血半暗帶區(qū)MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），腦缺血半暗帶區(qū)Claudin-5、Occluding蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，除TFC低劑量組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)MMP-2蛋白表達(dá)水平降低不顯著外，其余各組大鼠上述指標(biāo)均顯著改善（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：TFC對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有一定的預(yù)防作用，可改善神經(jīng)功能缺損，減少腦梗死面積；其機(jī)制可能與抑制MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)Claudin-5、Occluding蛋白表達(dá)，降低血腦屏障的通透性有關(guān)。

關(guān)鍵詞 錦雞兒總黃酮；局灶性腦缺血再灌注損傷；血腦屏障；血腦屏障緊密連接相關(guān)蛋白；預(yù)防作用；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of the pretreatment of total flavonoids of Caragana sinica （TFC） on the permeability of blood-brain barrier in focal cerebral ischemia-reperfusion injury model rats， and to provide reference for further development and clinical treatment of cerebral ischemia stroke. METHODS： A total of 120 rats were randomly divided into sham operation group， model group， nimodipine group （positive control， 12.6 mg/kg） and TFC high-dose， medium-dose and low-dose groups （60， 30， 15 mg/kg）， with 20 rats in each group. Administration groups were given relevant medicine intragastrically. Sham operation group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 7 d. 2 h after last intragastric administration， focal cerebral ischemia-reperfusion injury model was established by suture-occluded method in those groups except for sham operation group. 24 h after reperfusion， neurological deficit score was performed； 2，3，5-TTC staining was used to calculate the percent age of cerebral infraction area； the content of Evans blue was measured by spectrophotometer so as to investigate the permeability of blood-brain barrier. The expression of matrix metalloproteinases 9 （MMP-9）， MMP-2 and blood-brain barrier closely linked protein （Claudin-5 and Occluding） in penumbra area of cerebral ischemic area were detected by Western blot. RESULTS： Compared with sham operation group， neurological deficit score， the percentage of cerebral infraction area， the content of Evans blue in cerebral tissue， the protein expressions of MMP-9 and MMP-2 in penumbra area of cerebral ischemic area were increased significantly （P<0.01）； the protein expressions of Claudin-5 and Occluding in penumbra area of cerebral ischemic area were decreased significantly （P<0.01）. Compared with model group， above indexes of rats in each medicine group were all improved significantly except that the decrease of protein expression of MMP-2 in penumbra area of cerebral ischemic area was not significant in TFC low-dose group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： TFC can prevent focal cerebral ischemia-reperfusion injury of rats， improve neurological deficit and reduce cerebral ischemia area and the permeability of blood-brain barrier. The mechanism of it may be associated with inhibiting the expressions of MMP-9 and MMP-2， promoting the protein expressions of Claudin-5 and Occluding.

KEYWORDS Total flavonoids of Caragana sinica； Focal cerebral ischemia-reperfusion injury； Blood-brain barrier； Blood-brain barrier closely linked protein； Preventive effect； Rats

缺血性腦卒中是一種常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率、致殘率和致死率均很高[1]。目前，公認(rèn)的唯一有效的治療方法是急性期溶栓治療，但溶栓后局部腦血流再通誘發(fā)再灌注損傷后導(dǎo)致的腦水腫是其常見的病理變化過程。然而，血腦屏障（Blood brain barrier，BBB）的破壞可導(dǎo)致血管源性腦水腫，是腦缺血再灌注損傷后腦水腫發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)[2-3]。BBB緊密連接相關(guān)蛋白（Claudin-5和Occluding）是BBB的重要結(jié)構(gòu)成分，其水平的高低與BBB的開放和關(guān)閉密切相關(guān)[4-5]。也有研究顯示，腦缺血再灌注后基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMP）表達(dá)增多，其中MMP-9和MMP-2被認(rèn)為是BBB損傷的標(biāo)志物之一[6]。近年來，有研究報道中藥黃酮類成分對BBB具有保護(hù)作用[7]，挖掘中藥黃酮類成分治療腦卒中具有較好的開發(fā)前景。

錦雞兒根又名金雀花根、板參、陽雀花根、土黃芪，是一種民間常用藥，具有活血祛風(fēng)、補(bǔ)氣益腎之功，民間常用于治療腦缺血疾病，其主要藥效成分是錦雞兒總黃酮（Total flavonoids in Caragana sinica，TFC）[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)，TFC對腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，可提高腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）含量，抑制血液黏度升高，降低血小板聚集，改善紅細(xì)胞變形能力[9-10]。本課題組前期研究證實(shí)，錦雞兒根提取物具有顯著抗缺血缺氧和抗疲勞能力[11-12]，對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用[13]。但TFC對腦缺血再灌注損傷后BBB的破壞是否具有保護(hù)作用，目前未見文獻(xiàn)報道。為此，本研究采用大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，探討TFC對模型大鼠BBB通透性的影響及作用機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)和臨床運(yùn)用TFC治療缺血性腦卒中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

moorVMS-LDF激光多普勒血流儀（英國Moor instruments公司）；Gemini XPS熒光酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)、Trans- Blot?轉(zhuǎn)膜儀和垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

TFC（由貴陽中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提取，批號：20160902，純度：采用紫外分光光度法測定，以蘆丁計(jì)含量為70.3%）；尼莫地平片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號：20160823，規(guī)格：30 mg/片）；伊文思藍(lán)（Evansblue，EB）染料（上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，美國Sigma公司）；化學(xué)發(fā)光超敏反應(yīng)（ECL）試劑盒（美國Pierce公司，批號：36085）；兔抗鼠MMP-9、MMP-2 抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；兔抗鼠β-肌動蛋白（β-actin）、兔抗Claudin-5、Occluding單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）；羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）-辣根過氧化物酶（HRP）抗體（北京索萊寶科技有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.3 動物

健康清潔級Wistar大鼠120只，♂，體質(zhì)量（260±20） g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001。購入后分籠飼養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22～25 ℃、相對濕度為40%～60%。

2 方法

2.1 分組與給藥

將120只大鼠隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組（陽性對照，12.6 mg/kg，根據(jù)臨床用量的10倍劑量換算而得）和TFC高、中、低劑量組（60、30、15 mg/kg，分別根據(jù)臨床用量的20、10、5倍劑量換算而得），每組20只。各給藥組大鼠每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d；假手術(shù)組和模型組大鼠每天灌胃等量生理鹽水。

2.2 造模

末次給藥2h后，采用改良線栓法[14]制作局灶性腦缺血再灌注損傷模型。術(shù)前將大鼠禁食8 h，用面罩吸入持續(xù)給予2%三氟氯溴乙烷、70%N2+30%O2混合氣體將大鼠麻醉，固定在手術(shù)上，沿頸部中線切開皮膚及皮下組織，分離出右側(cè)的頸總動脈及其頸內(nèi)和頸外動脈分枝，夾閉頸總動脈和頸外動脈，將線栓插入頸外動脈，經(jīng)頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉處進(jìn)入頸內(nèi)動脈至大腦中動脈，插入深度約（18.5±0.5） mm，用激光多普勒血流儀監(jiān)測腦血流，以血流值下降至進(jìn)線栓時也不再變化為止，并在整個阻塞過程中用動脈夾夾閉頸總動脈，使腦血流量保持在阻塞水平，造成局灶性腦缺血。缺血90 min后間斷式拔出線栓至頸外動脈切口處，直至線栓拔出之后用激光多普勒血流儀進(jìn)行監(jiān)測，當(dāng)顯示腦血流緩慢恢復(fù)至接近基礎(chǔ)值時，再次縫合皮膚，消毒。假手術(shù)組大鼠除不栓線外其余操作均同模型組。手術(shù)過程中和術(shù)后大鼠均置于電熱恒溫板[（37±0.5） ℃]上保溫，密切觀察生命體征，待大鼠麻醉清醒后放入飼養(yǎng)籠中，20～25 ℃恒溫條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。

2.3 神經(jīng)功能缺損評分

觀察大鼠缺血再灌注24 h后的行為表現(xiàn)，參照文獻(xiàn)方法[15]對神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評分：0分，無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分，輕微神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展左側(cè)前爪；2分，中度局灶性神經(jīng)功能缺損，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，重度局灶性神經(jīng)功能缺損，向左側(cè)傾倒；4分，意識喪失，不能行走。

2.4 腦梗死面積測定

缺血再灌注24 h后，各組隨機(jī)選取6只大鼠麻醉，迅速斷頭取出完整腦組織放入腦槽中（-80 ℃）速凍3 min，從額極至枕極連續(xù)切取厚度為2 mm的冠狀腦片，浸于2%TTC 溶液中，避光，37 ℃恒溫孵育30 min。梗死區(qū)域腦組織呈白色，而周圍正常腦組織呈紅色。然后用4%的中性甲醛固定，數(shù)碼相機(jī)拍攝圖像后，運(yùn)用圖像分析軟件（Image ProPlus 6.0）分別測出每片腦組織的梗死面積，最后計(jì)算出腦梗死面積百分比[腦梗死面積百分比（%）=腦梗死面積/總面積×100%]。

2.5 BBB通透性檢測

缺血再灌注24 h后，各組取6只大鼠，從尾靜脈注射2%EB溶液（4 mL/kg），麻醉后打開胸腔暴露心臟，剪開右心耳，經(jīng)左心室灌注生理鹽水清除血管內(nèi)血液和EB至右心耳流出液體清亮為止，斷頭取腦，稱取適量腦組織放入甲酰胺溶液中充分破碎（每100 mg 腦組織加入1 mL甲酰胺），然后將組織勻漿液置于60 ℃恒溫水浴中孵育24 h，取出一份勻漿液于4 ℃條件下以12 000×g離心10 min，取上清液200 μL加入96孔酶標(biāo)板中，在酶標(biāo)儀上測定630 nm波長處的吸光度（A）值。腦組織中EB含量（μg/g）=待測樣品中EB含量（μg/mL）×甲酰胺量（mL）/腦組織濕質(zhì)量（g），待側(cè)樣品中EB含量根據(jù)前期已制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出。

2.6 腦缺血半暗帶區(qū)MMP-9、MMP-2、Claudin-5和Occluding蛋白表達(dá)檢測

采用Western blot法。腦缺血再灌注24 h后，各組取8只大鼠麻醉，取缺血區(qū)腦組織，稱量100 mg，放于無菌的EP管中，用Western blot及IP細(xì)胞裂解液浸泡，勻漿，然后在4 ℃條件下以12 000×g離心10 min，取上清液，用蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量后調(diào)整樣品濃度。取50 μg蛋白樣品上樣，進(jìn)行電泳（濃縮膠恒壓80 V，約40 min；分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部）、轉(zhuǎn)膜（恒流300 mA，冰浴轉(zhuǎn)膜2 h）、封閉（TBST溶解的5%脫脂奶粉，pH 7.5），室溫輕搖90 min，加入相應(yīng)抗體MMP-9（1 ∶ 1 000）、MMP-2（1 ∶ 1 000）、Claudin-5 （1 ∶ 500）、Occluding（1 ∶ 1 000）及內(nèi)參β-actin（1 ∶ 1 000），然后4 ℃孵育過夜。洗膜后用封閉液將羊抗兔IgG-HRP二抗稀釋（1 ∶ 5 000），然后37 ℃恒溫孵育90 min，加顯影和定影試劑，X射線膠片顯像，掃描。應(yīng)用Image J分析軟件分析目的條帶和內(nèi)參條帶的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比值對MMP-9、MMP-2、Claudin-5和Occluding蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死面積百分比測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分以及腦梗死面積百分比均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死面積百分比均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且具有一定的TFC量效關(guān)系。各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死面積百分比測定結(jié)果見表1。

3.2 BBB通透性測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中EB含量顯著升高（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織中EB含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且具有一定的TFC量效關(guān)系。各組大鼠腦組織中EB含量測定結(jié)果見表2。

3.3 腦缺血半暗帶區(qū)MMP-9、MMP-2、Claudin-5和Occluding蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著升高，Claudin-5、Occluding蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，除TFC低劑量組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)MMP-2蛋白表達(dá)水平降低不顯著外，其余各組大鼠上述指標(biāo)均顯著改善（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠腦缺血半暗帶區(qū)MMP-9、MMP-2、Claudin-5和Occluding蛋白表達(dá)的電泳圖見圖1，測定結(jié)果見表3。

4 討論

BBB是腦毛細(xì)血管壁與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形成的血漿與腦細(xì)胞之間的屏障和由脈絡(luò)叢形成的血漿和腦脊液之間的屏障，這些屏障能夠阻止大分子物質(zhì)由血液進(jìn)入腦組織，對腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起重要作用[16]。因此，BBB完整性的破壞導(dǎo)致其通透性改變是腦缺血再灌注損傷的重要病理基礎(chǔ)。

腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致BBB破壞的病理機(jī)制復(fù)雜，MMP是分解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶類中最重要的一類，參與體內(nèi)眾多的生物學(xué)反應(yīng)，包括動脈粥樣硬化、炎癥、腫瘤生長及轉(zhuǎn)移等，其中MMP-2和MMP-9是MMPs家族的主要成員。有研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2、MMP-9在急性大腦中動脈閉塞患者中的表達(dá)水平高低與腦梗死面積百分比大小具有顯著相關(guān)性[17]；大鼠大腦中動脈閉塞12 h后MMP-9水平顯著升高，腦梗死面積百分比和神經(jīng)功能缺損評分均越高[18]。另有報道指出，腦出血24 h后MMP-9、MMP-2水平顯著升高，腦組織中含水量顯著增加，當(dāng)給予MMP-9抑制劑后腦組織中含水量顯著減少[19]，可見MMP-2、MMP-9 所致的BBB破壞在缺血性腦卒中的病理變化中起著關(guān)鍵作用。MMP-2和MMP-9通過分解細(xì)胞外基質(zhì)Ⅳ型膠原、層黏連蛋白和纖維連接蛋白導(dǎo)致BBB構(gòu)成成分的變化，如BBB的重要構(gòu)成成分緊密連接相關(guān)蛋白（Claudin-5和Occluding）的表達(dá)及其位置分布的異常均可破壞緊密連接的完整性，從而引起B(yǎng)BB通透性的改變[20]。Claudin-5、Occluding蛋白表達(dá)發(fā)生變化時，BBB的功能可能隨之改變，Claudin-5、Occluding蛋白表達(dá)水平下降的程度可作為BBB損傷程度的標(biāo)志[21]。尼莫地平是一種經(jīng)典的Ca2+通道阻滯藥，可抑制平滑肌收縮，有效緩解腦血管痙攣，擴(kuò)張腦血管，增加腦血流量，改善BBB通透性，故本研究以其為陽性對照藥。本研究結(jié)果顯示，TFC預(yù)處理可降低大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死面積百分比，可抑制腦缺血再灌注后MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)和促進(jìn)Claudin-5和Occluding 蛋白的表達(dá)。

綜上所述，TFC對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有一定的預(yù)防作用，可降低BBB的通透性。其作用機(jī)制可能與抑制MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Claudin-5和Occluding蛋白的表達(dá)有關(guān)，這為進(jìn)一步闡明錦雞兒在缺血性腦卒中具有神經(jīng)保護(hù)作用提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2018-03-05 修回日期：2018-05-09）

（編輯：林 靜）