救必應(yīng)胃痛片的HPLC指紋圖譜研究

蔣秋香 韋雪丹 莫海彥 黎理 蔡毅 馬妍

中圖分類(lèi)號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）13-1786-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.14

摘 要 目的：建立救必應(yīng)胃痛片的指紋圖譜，為完善其質(zhì)量控制提供參考。方法：采用高效液相色譜法建立13批救必應(yīng)胃痛片的指紋圖譜，采用《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012年版）對(duì)生成的指紋圖譜進(jìn)行分析，并以方中3種藥材（木香、肉桂和陳皮）提取液為對(duì)照對(duì)各共有峰進(jìn)行歸屬。結(jié)果：13批救必應(yīng)胃痛片指紋圖譜的相似度均大于0.952，共確定了12個(gè)共有色譜峰，并指認(rèn)了其中3、4、10、12號(hào)共有色譜峰分別為橙皮苷、桂皮醛、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯。其中，2、3、5、8、9、11號(hào)共有色譜峰歸屬于陳皮藥材，10、12號(hào)共有色譜峰歸屬于木香藥材，1、4、6、7號(hào)共有色譜峰歸屬于肉桂藥材。結(jié)論：本研究為救必應(yīng)胃痛片的質(zhì)量控制提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 救必應(yīng)胃痛片；高效液相色譜法；指紋圖譜

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish fingerprint for Jiubiying weitong tablets， and to provide reference for improving quality control of it. METHODS： The fingerprints for 13 batches of Jiubiying weitong tablets were established by HPLC. Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2012 edition） was used to analyze fingerprint. The attribution of common peaks were assigned by using 3 kinds of medicinal materials （Aucklandia lappa， Cinnamomum cassia and Citrus reticulata） extracts as reference. RESULTS： The similarity of 13 batches of Jiubiying weitong tablets was higher than 0.952， and 12 common chromatographic peaks were observed. No. 3， 4， 10 and 12 common chromatographic peaks were hesperidin， cinnamaldehyde， costuslactone and dehydrocostuslactone， respectively. No. 2， 3， 5， 8， 9， 11 common chromatographic peaks were attributed to C. reticulate； No. 10 and 12 common chromatographic peaks were attributed to A. lappa； No. 1， 4， 6， 7 common chromatographi peaks were attributed to C. cassia. CONCLUSIONS： The study provide certain evidence for quality control of Jiubiying weitong tablets.

KEYWORDS Jiubiying weitong tablets； HPLC； Fingerprint

救必應(yīng)胃痛片由木香、救必應(yīng)、高良姜、肉桂、陳皮、甘草流浸膏、碳酸氫鈉和三硅酸鎂等組成，具有鎮(zhèn)痛、解痙、制酸、健胃等功效，用于胃、十二指腸潰瘍和慢性胃炎屬肝胃不和證者[1]。救必應(yīng)胃痛片的現(xiàn)行版質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的WS-10593（ZD- 0593）-2002-2012Z，其項(xiàng)下有3個(gè)化學(xué)反應(yīng)鑒別項(xiàng)，用于鑒別處方中的碳酸氫鈉、三硅酸鎂；3個(gè)薄層色譜鑒別項(xiàng)，用于鑒別橙皮苷、桂皮醛和木香；3個(gè)含量測(cè)定項(xiàng)，用于測(cè)定橙皮苷、碳酸氫鈉和三硅酸鎂的含量。但是中成藥中各藥材的化學(xué)成分繁多且復(fù)雜，不同的成分表現(xiàn)出不同的藥效，建立其質(zhì)量控制方法頗為困難。目前，中藥指紋圖譜研究是國(guó)際上公認(rèn)且有效的中藥質(zhì)量控制方法[2]。筆者擬進(jìn)行探索性研究，建立救必應(yīng)胃痛片的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，測(cè)定13批次救必應(yīng)胃痛片樣品的相關(guān)數(shù)據(jù)，采用《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012年版）對(duì)圖譜和數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理和相似度評(píng)價(jià)，以期為控制該制劑質(zhì)量的穩(wěn)定性和優(yōu)良性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1525型HPLC儀（美國(guó)Waters公司）；AE200型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；AS7240BT型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

救必應(yīng)胃痛片[廣西圣特藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.36 g/片，批號(hào)：131001、131101、140101、140102、140301、140601、141101、150101、150301、150601、151001、151201、160101，上述13批樣品按批號(hào)依次簡(jiǎn)稱(chēng)為S1～S13]；木香烴內(nèi)酯（批號(hào)：111524-200503）、去氫木香烴內(nèi)酯（批號(hào)：111525-200505）、桂皮醛（批號(hào)：110710- 201418）、橙皮苷（批號(hào)：110721-200512）對(duì)照品和肉桂（批號(hào)：121363-200401）、陳皮（批號(hào)：120969-200507）、木香（批號(hào)：120921-201309）對(duì)照藥材均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院（其中對(duì)照品純度：均>99.0%）；甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B）（梯度洗脫：0～30 min，30%→45%A；30～70 min，45%→75%A）[3-6]；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～30 min為283 nm，30～70 min為225 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取木香烴內(nèi)酯對(duì)照品10.32 mg、去氫木香烴內(nèi)酯對(duì)照品10.09 mg，分別置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為對(duì)照貯備液A、B；精密稱(chēng)取桂皮醛對(duì)照品15.49 mg、橙皮苷對(duì)照品15.30 mg，分別置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為對(duì)照貯備液C、D；分別精密吸取上述對(duì)照貯備液A、B、C各1 mL和對(duì)照貯備液D 2 mL，置于同一10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得木香烴內(nèi)酯質(zhì)量濃度為10.32 μg/mL、去氫木香烴內(nèi)酯質(zhì)量濃度為10.09 μg/mL、桂皮醛質(zhì)量濃度為30.79 μg/mL和橙皮苷質(zhì)量濃度為61.20 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取研細(xì)的救必應(yīng)胃痛片樣品0.5 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率：250 W，頻率：50 kHz）20 min，放冷，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用90%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得[7-8]。

2.2.3 3種對(duì)照藥材提取液 分別取木香、肉桂和陳皮3種中藥材適量，粉碎，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率：250 W，頻率：50 kHz）20 min，放冷，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用90%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液、供試品（批號(hào)：140101）溶液和3種對(duì)照藥材提取液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果顯示，各個(gè)色譜峰間均能達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，表明該方法專(zhuān)屬性較好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品（批號(hào)：140101）溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜。以3號(hào)峰橙皮苷為參照峰S，計(jì)算各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.06%～0.20%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為0.37%～2.13%（n=6），表明該方法精密度良好[9-10]。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批次救必應(yīng)胃痛片樣品（批號(hào)：140101）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。以3號(hào)峰橙皮苷為參照峰S，計(jì)算各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.08%～0.27%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為0.27%～2.88%（n=6），表明該方法的重復(fù)性良好[9-10]。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品（批號(hào)：140101）溶液，室溫放置0、2、4、8、12、24 h后分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。以3號(hào)峰橙皮苷為參照峰S，計(jì)算各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.06%～0.31%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為0.50%～2.76%（n=6），表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好[9-10]。

2.4 HPLC指紋圖譜研究

2.4.1 指紋圖譜的生成及相似度、共有峰分析 取13批救必應(yīng)胃痛片樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和3種對(duì)照藥材提取液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并記錄色譜圖。采用《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012年版）對(duì)HPLC圖譜進(jìn)行分析處理，以批號(hào)為140101的救必應(yīng)胃痛片的圖譜為參照，經(jīng)過(guò)多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配，采用均值法生成對(duì)照指紋圖譜R并進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果顯示，共得到12個(gè)共有色譜峰，各共有色譜峰與對(duì)照指紋圖譜R的相似度均大于0.952，并指認(rèn)了其中3號(hào)共有色譜峰為橙皮苷、4號(hào)共有色譜峰為桂皮醛、10號(hào)共有色譜峰為木香烴內(nèi)酯、12號(hào)共有色譜峰為去氫木香烴內(nèi)酯。救必應(yīng)胃痛片樣品（批號(hào)：140101）和混合對(duì)照品的HPLC圖見(jiàn)圖1，指紋圖譜見(jiàn)圖2，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，共有峰的相對(duì)峰面積測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2（以3號(hào)色譜峰為參照），相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4.2 色譜峰的歸屬 取“2.2.3”項(xiàng)下3種對(duì)照藥材提取液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，進(jìn)行色譜峰的歸屬確認(rèn)。通過(guò)與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行比較，確定2、3、5、8、9、11號(hào)共有色譜峰歸屬于陳皮藥材，10、12號(hào)共有色譜峰歸屬于木香藥材，1、4、6、7號(hào)共有色譜峰歸屬于肉桂藥材，3種對(duì)照藥材提取液的HPLC圖見(jiàn)圖3。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

參考2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[3]中陳皮、桂枝和木香等藥材含量測(cè)定項(xiàng)下的流動(dòng)相條件，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[4-6]報(bào)道，筆者在前期預(yù)試驗(yàn)中以甲醇為流動(dòng)相A、水為流動(dòng)相B分別進(jìn)行了如下梯度洗脫：（1）0～30 min為35%A，30～70 min為65%A；（2）0～20 min為38%A，20～70 min為38%→70%A；（4）0～20 min為38%A，20～50 min為38%→75%A，50～60 min為75%A；（4）0～30 min為30%→45%A，30～70 min為45%→75%A。綜合分析保留時(shí)間、理論板數(shù)、基線、雜質(zhì)影響、分離效果等各方面因素，發(fā)現(xiàn)方案（4）為最理想的流動(dòng)相條件，故本研究以此為洗脫條件。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)二級(jí)管陣列檢測(cè)器（DAD檢測(cè)器）在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，參考2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[3]中陳皮、桂枝和木香等藥材含量測(cè)定項(xiàng)下的檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)合實(shí)際的試驗(yàn)操作條件，將0～30 min檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為283 nm，30～70 min檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為225 nm。此條件下，圖譜基線平穩(wěn)、色譜峰較多、峰形較好。

3.3 供試品溶液制備方法的選擇和優(yōu)化

在前期研究中，筆者以溶劑體積、甲醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間作為考察因素，以去氫木香烴內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯、桂皮醛和橙皮苷的得率為考核指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)供試品溶液的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，得出最優(yōu)水平組合為使用90%甲醇25 mL超聲處理（功率：250 W，頻率：50 kHz）20 min。此條件下提取的供試品溶液進(jìn)樣后所得的色譜峰個(gè)數(shù)較多且峰形較好，且為該條件下測(cè)定去氫木香烴內(nèi)酯、木香烴內(nèi)酯、桂皮醛和橙皮苷的含量奠定了基礎(chǔ)。

3.4 3種對(duì)照藥材選擇的依據(jù)

筆者曾按照處方比例自制救必應(yīng)胃痛片樣品，用于薄層色譜鑒別和HPLC法測(cè)定，經(jīng)過(guò)多次不同提取方法、不同展開(kāi)系統(tǒng)及不同流動(dòng)相分離的預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果，薄層板上，救必應(yīng)對(duì)照藥材均能在與對(duì)照品紫丁香苷和長(zhǎng)梗冬青苷色譜相應(yīng)的位置出現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，比移值（Rf）適中，能與雜質(zhì)分離。然而在供試品及按處方比例自制的樣品中，卻未能出現(xiàn)相應(yīng)的斑點(diǎn)。HPLC圖中，救必應(yīng)對(duì)照藥材在與對(duì)照品紫丁香苷和長(zhǎng)梗冬青苷色譜峰的保留時(shí)間處出現(xiàn)相應(yīng)的色譜峰，分離度均大于1.5，且理論板數(shù)均大于4 000，然而在供試品及按處方比例自制的樣品中，卻未能出現(xiàn)相應(yīng)的色譜峰。綜合上述2個(gè)試驗(yàn)結(jié)果，故筆者在本研究中未設(shè)置救必應(yīng)藥材對(duì)照。對(duì)于此結(jié)果，筆者分析原因可能為以下兩點(diǎn)：（1）單味藥材的成分較單一，且各成分之間的性質(zhì)頗為接近，在提取時(shí)各成分之間的相互作用較少；（2）救必應(yīng)藥材中的紫丁香苷和長(zhǎng)梗冬青苷均為苷類(lèi)化合物，苷鍵在酸、堿、酶或氧化的情況下都有可能開(kāi)裂、水解，與其他幾味藥混合提取后，成分變得復(fù)雜，各成分之間的相互作用、相互影響增大，導(dǎo)致目標(biāo)成分分解或未能提出，最終導(dǎo)致薄層斑點(diǎn)不清晰，液相色譜不出峰。

3.5 指紋圖譜建立的思考

本研究對(duì)13批救必應(yīng)胃痛片樣品進(jìn)行了HPLC指紋圖譜研究，共生成12個(gè)共有峰，并對(duì)12個(gè)共有峰進(jìn)行了藥味歸屬，初步闡明了共有峰來(lái)源，并通過(guò)與對(duì)照指紋圖譜對(duì)比的方法，將部分色譜峰進(jìn)行了定性分析。其中，確定2、3、5、8、9、11號(hào)峰歸屬于陳皮藥材，指認(rèn)了3號(hào)峰為橙皮苷峰；1、4、6、7號(hào)峰歸屬于肉桂藥材，指認(rèn)了4號(hào)峰為桂皮醛峰。在參照色譜峰的選擇上，以3號(hào)峰橙皮苷為參照峰S計(jì)算各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，是因?yàn)槌绕ぼ辗迮赃厽o(wú)雜質(zhì)峰干擾、基線平直、出峰時(shí)間適當(dāng)且峰面積大小合適。

筆者曾將0～30 min時(shí)流動(dòng)相中的甲醇體積分?jǐn)?shù)調(diào)至20%→45%和40%→65%，發(fā)現(xiàn)在不同流動(dòng)相下4 min處色譜峰保留時(shí)間未發(fā)生改變，故考慮該峰可能為溶劑峰或流動(dòng)相峰，因此未將此峰作為共有峰處理。本制劑中含6味中藥材，各藥材成分繁多，種質(zhì)資源復(fù)雜，不同地區(qū)采收時(shí)間各異，導(dǎo)致藥材含量也各有不同，甚至成分也略有差異，批號(hào)為131001的樣品（S1）和批號(hào)為1150101的樣品（S8）在68 min處出現(xiàn)色譜峰，而其他12批次在此處未見(jiàn)出峰，這可能與各批次樣品中原藥材的成分差異有關(guān)。

從指紋圖譜的相似度來(lái)看，13批救必應(yīng)胃痛片樣品生成的對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.952～0.999，相似度較高，表明差異較小、穩(wěn)定性好，比較客觀地體現(xiàn)了該藥中木香、陳皮、肉桂等原藥材產(chǎn)地的穩(wěn)定性、生產(chǎn)工藝的成熟性和產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量的穩(wěn)定均一性。然而，對(duì)于該復(fù)方制劑中其余各成分的結(jié)構(gòu)確定，比如1、2、5、6、7、8、9和11等8個(gè)共有色譜峰在本研究中未能得到指認(rèn)，還需結(jié)合其他試驗(yàn)手段進(jìn)行深入研究，這將是筆者下一步繼續(xù)研究的方向。

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（收稿日期：2017-11-02 修回日期：2018-04-08）

（編輯：林 靜）