白鮮中梣酮標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

王岱杰 宋祥云 耿巖玲 付瑞明 于金倩 王曉

中圖分類號 R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）13-1776-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.12

摘 要 目的：制備梣酮標(biāo)準(zhǔn)樣品，確保梣酮及相關(guān)產(chǎn)品檢測的準(zhǔn)確性、可比性和可溯源性。方法：以蕓香科植物白鮮的干燥根皮為原料，采用硅膠柱色譜分離制備梣酮單體。分別采用高效液相色譜（HPLC）法、薄層色譜（TLC）法和液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)對梣酮單體純度進(jìn)行分析，通過紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜和核磁共振等波譜技術(shù)對梣酮單體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并參照GB/T 15000.3標(biāo)準(zhǔn)樣品的工作導(dǎo)則要求考察其均勻性、穩(wěn)定性和定值。結(jié)果：HPLC、TLC和LC-MS檢測結(jié)果顯示，所制單體純度較高，在相關(guān)圖譜中無明顯雜質(zhì)峰或斑點(diǎn)存在；經(jīng)多種波譜技術(shù)鑒定分離單體化合物為梣酮；所制梣酮單體的均勻性良好，10瓶樣品間純度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；梣酮單體在0～4 ℃條件下貯藏24個(gè)月穩(wěn)定性良好，穩(wěn)定性的擴(kuò)展不確定度為0.16%；8家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值試驗(yàn)確定其標(biāo)準(zhǔn)值為99.75%，擴(kuò)展不確定度為0.34%。結(jié)論：成功制備了符合GB/T 15000.3要求的梣酮標(biāo)準(zhǔn)樣品，該樣品可用于梣酮及相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制和檢測方法的評定。

關(guān)鍵詞 梣酮；標(biāo)準(zhǔn)樣品；均勻性；穩(wěn)定性；定值；不確定度

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare fraxinellone standard sample，and guarantee accuracy，comparability and traceability of fraxinellone and related products. METHODS： Fraxinellone monomer was obtained by means of silica gel chromatography from dried bark of Dictamnus dasycarpus. HPLC，TLC and LC-MS were used to analyze the purity of fraxinellone monomer. Their structures were confirmed by UV，IR，MS and NMR. Homogeneity，stability and constant value of it were investigated by referring to GB/T 15000.3 standard sample. RESULTS： Results of HPLC，TLC and LC-MS showed that the purity of prepared monomer was high. No significant impurity peak or spot was found in related chromatograms. A variety of spectroscopic techniques were used to identify prepared monomeric compound as fraxinellone. Prepared fraxinellone monomer had good uniformity， there was no statistical significance in purity difference among 10 samples（P>0.05）. The stability of prepared fraxinellone monomer was good at 0-4 ℃ for 24 months， the extended uncertainty of stability was 0.16%. The standard value of fraxinellone monomer was 99.75% in combination constant value tests of 8 laboratories，and expanded uncertainty was 0.34%. CONCLUSIONS： The fraxinellone was successfully prepared that was conformed to the technical requirement of GB/T 15000.3， and it can be used in the content determination and testing method validation of fraxinellone related products.

KEYWORDS Fraxinellone； Standard sample； Homogeneity； Stability； Constant value； Uncertainty

標(biāo)準(zhǔn)樣品是具有一種或多種足夠均勻的、確定了特性值的材料或物質(zhì)，可以用來校準(zhǔn)儀器、評價(jià)測量方法和給材料賦值[1]。隨著天然產(chǎn)物（包括中藥材）的發(fā)展日益國際化，對于符合國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）要求的標(biāo)準(zhǔn)樣品的需求進(jìn)一步迫切，其研制也成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前，我國研發(fā)的天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品種類和數(shù)量嚴(yán)重不足，影響了相關(guān)產(chǎn)品的檢測，也制約了相關(guān)行業(yè)的發(fā)展[2]，為改善這一現(xiàn)狀，我國天然產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品的研究正在廣泛開展。

白鮮為蕓香科植物，多生長于林下、林緣或山坡等地，在我國東北、華北、西北和華東等地區(qū)廣泛分布，是重要的植物資源，其干燥根皮——白鮮皮為常用大宗藥材，具有抗炎、抗菌、抗過敏、殺蟲、神經(jīng)保護(hù)等作用[3-9]，臨床主要用于治療濕熱瘡毒、黃水淋漓、濕疹、風(fēng)疹、疥癬瘡癩、風(fēng)濕熱痹、黃疸尿赤等病癥[10]，還可用于治療皮膚性疾病（如濕疹、皮炎和銀屑?。11]。梣酮為2015年版《中國藥典》（一部）中白鮮皮的質(zhì)量控制指標(biāo)成分，規(guī)定其含量不得少于0.050%（按干燥品計(jì)）[10]?，F(xiàn)代藥理研究表明，梣酮還具有抗炎、保肝、抑菌和殺蟲等多種功效[12-19]。目前市場上梣酮樣品主要以對照品為主，純度參差不齊，未按照國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性和定值試驗(yàn)，最終結(jié)果沒有不確定度評價(jià)，樣品也不具有溯源性。因此，為了滿足梣酮及相關(guān)產(chǎn)品的檢測需求，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性和溯源性，筆者參照GB/T 15000.3標(biāo)準(zhǔn)樣品的工作導(dǎo)則[20]，制備了梣酮國家標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1 材料

1.1 儀器

R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；SCIENTZ- 10N型冷凍干燥儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；1260型高效液相色譜（HPLC）儀、6520 Q-TOF型液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）儀（美國安捷倫公司）；WRS-1B型數(shù)字熔點(diǎn)儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；INOVA 600 MHz型核磁共振（NMR）波譜儀（美國Varian公司）。

1.2 藥材與試劑

白鮮皮藥材購自濟(jì)南建聯(lián)中藥店，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為蕓香科植物白鮮（Dictamnus dasycarpus Turcz.）的干燥根皮，樣本存放于山東省分析測試中心，樣品編號為2014060203；甲醇為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 梣酮單體的制備

取白鮮皮藥材500 g，粉碎至40目，95%乙醇加熱回流3次，每次3 h，抽濾，減壓濃縮至無醇味；將提取物加水分散，用乙酸乙酯萃取3次，萃取液減壓濃縮，得到乙酸乙酯浸膏17.3 g，冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

將乙酸乙酯浸膏進(jìn)行硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯溶劑體系梯度（100 ∶ 1、50 ∶ 1、20 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、 3 ∶ 1、2 ∶ 1、1 ∶ 1，V/V）洗脫，分瓶收集，薄層色譜（TLC）和HPLC監(jiān)測（具體條件見“2.2”項(xiàng)下），收集梣酮含量較高的洗脫組分，減壓濃縮。將樣品用氯仿溶解，放置于室溫進(jìn)行結(jié)晶，得到白色針狀晶體，即梣酮單體。

2.2 純度分析

筆者分別采用HPLC法、TLC法和LC-MS法對“2.1”項(xiàng)下分離得到的樣品進(jìn)行純度分析。

2.2.1 HPLC法 取“2.1”項(xiàng)下分離的單體樣品，以甲醇為溶劑，制備成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的樣品溶液，分別按以下兩種洗脫條件進(jìn)樣測定。（1）等度洗脫。色譜柱：Shim-pack C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（62 ∶ 38，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；運(yùn)行時(shí)間：30 min；檢測波長：213 nm；進(jìn)樣量：10 μL。（2）梯度洗脫。色譜柱：YMC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為水，梯度洗脫（0～20 min，62%A；20～40 min，62%→100%A；40～50 min，100%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；運(yùn)行時(shí)間：50 min；檢測波長：213 nm；進(jìn)樣量：10 μL。采用HPLC的二極管陣列檢測器（DAD檢測器）對色譜峰進(jìn)行3D總吸收圖掃描，檢測結(jié)果扣除溶劑峰。HPLC純度分析結(jié)果表明，未見明顯雜質(zhì)峰存在，色譜圖見圖1。

2.2.2 TLC法 精密稱取“2.1”項(xiàng)下樣品5 mg，加甲醇制備成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的樣品溶液。展開劑分別為正己烷-乙酸乙酯（1 ∶ 1，V/V）和氯仿，定量毛細(xì)點(diǎn)樣管分別吸取20、40、60、80、100 μg樣品，梯度將樣品點(diǎn)于GF254硅膠板上，用兩種展開劑分別展開，取出，晾干。分別用熒光（波長分別為254 nm和365 nm）和顯色劑（10%硫酸乙醇為顯色劑，105 ℃下烤3 min）顯色，至斑點(diǎn)顯色清晰。熒光和顯色劑顯色結(jié)果表明，樣品呈現(xiàn)深灰色斑點(diǎn)，比移值（Rf）分別為0.74（圖A、B）和0.44（圖A′ 、B′ ），未見明顯雜質(zhì)斑點(diǎn)存在，薄層色譜圖見圖2。

2.2.3 LC-MS法 （1）分析條件：色譜柱為Shim-pack C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（62 ∶ 38，V/V）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；運(yùn)行時(shí)間為30 min。（2）MS條件：電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子模式下掃描；毛細(xì)管電壓為4.0 kV；載氣為氮?dú)?，載氣流速為10 L/min，載氣溫度為300 ℃；掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）100～1 000。根據(jù)LC-MS結(jié)果可見，圖譜中未見明顯的雜質(zhì)峰存在，總離子流圖見圖3。

2.3 結(jié)構(gòu)表征

采用紫外光譜（UV）、紅外光譜（IR）、MS和NMR等技術(shù)對梣酮單體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。UV法的測試溶劑為甲醇，掃描范圍為200～400 nm；IR法采用溴化鉀（KBr）壓片，掃描波數(shù)為400～4 000 cm-1；MS為ESI源，載氣為氮?dú)猓d氣溫度為300 ℃，載氣流速為10 L/min，毛細(xì)管電壓為4.0 kV，掃描范圍m/z為100～1 000；NMR 法的氘代試劑為CDCl3。結(jié)果，樣品的熔點(diǎn)為115～116 ℃；UV[λEtOH][max]：213 nm；[IRcm-1][Vmax]：2 932、2 878（νCH），1 743 （νC=O）、1 672（νC=C），1 453、1 373（δCH），1 204、1 023（νCO）；ESI-MS：m/z [M+H]+為233.110 4，[M+Na]+為255.092 6，[2M+Na]+為487.194 9，[M-H]-為231.094 2。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.48（1H，brs，H-5′ ），7.44（1H，brs，H-2′ ），6.35（1H，brs，H-4′ ），2.13～2.30（2H，m，H-6），2.14（3H，s，8-CH3），1.70-1.87（2H，m，H-5），1.43～1.48（2H，m，H-4），0.86（3H，s，9-CH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：169.9（C-1），148.6（C-7），143.4（C-5′ ），139.8（C-2′ ），127.4（C-7a），120.6（C-3′ ），108.6（C-4′ ），83.4（C-3），43.0（C-3a），32.1（C-6），31.6（C-5），20.3（C-4），18.5（C-9），18.2（C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]比較基本一致，故確定本研究分離單體為梣酮。

2.4 均勻性檢驗(yàn)

將分離制備的梣酮樣品進(jìn)行分裝，每瓶10 mg，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品導(dǎo)則中均勻性檢驗(yàn)要求[20]，采用順序重復(fù)隨機(jī)測量，隨機(jī)抽取分裝好的樣品10瓶（>1.5[√N(yùn)] [3]，N為所分裝梣酮的瓶數(shù)），按抽樣順序的不同，將試驗(yàn)分為3組（第1組抽樣順序?yàn)?-3-5-7-9-2-4-6-8-10；第2組抽樣順序?yàn)?0-9-8-7-6-5-4-3-2-1；第3組抽樣順序?yàn)?-4-6-8-10-1-3- 5-7-9）。樣品按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，樣品純度讀取采用峰面積歸一化法，采用DPS 9.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和F檢驗(yàn)，確定梣酮樣品的均勻性。均勻性檢驗(yàn)結(jié)果見表1，方差分析結(jié)果見表2。

以組間自由度υ1=9及組內(nèi)自由度υ2=20為變量，查詢F界值表，可知臨界值F0.05（9，20）=2.94，由于F2.5 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

將梣酮樣品儲(chǔ)存在溫度為0～4 ℃的環(huán)境中，考察樣品在2年內(nèi)的穩(wěn)定性。分別在放置0、6、12、18、24個(gè)月時(shí)取樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，采用峰面積歸一化法測定樣品純度，每份樣品測定5次。采用DPS 9.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)[22]。采用直線模型，觀察直線斜率值變化趨勢，計(jì)算斜率變化的絕對值，對樣品穩(wěn)定性進(jìn)行預(yù)測。穩(wěn)定性檢測結(jié)果見表3。

由于斜率變化的絕對值│b1│

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（收稿日期：2018-01-07 修回日期：2018-04-16）

（編輯：林 靜）