五倍子酯提物抗流感病毒誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷作用機制

張彧 吳東升 齊堃 曾麗紅 張銀銀 李玲 鄧奕輝

〔摘要〕 目的 探索Toll樣受體4（TLR4）在A型流感病毒所致小鼠急性肺損傷中的作用，進一步探討五倍子酯提物的干預(yù)機制。方法 實驗設(shè)正常組、模型組、五倍子酯提物組和奧司他韋組，以流感病毒小鼠肺適應(yīng)株A/PR/8/34滴鼻感染C57BL小鼠，建立小鼠急性肺損傷模型。病毒感染后第1天開始予以相應(yīng)干預(yù)，共6 d。分別于第2、4、6天處理動物。觀察肺組織大體解剖學(xué)變化，肺組織切片病理學(xué)變化，ELISA法檢測肺泡灌洗液中白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）水平，Western blot法檢測肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6的蛋白表達。結(jié)果 流感病毒感染小鼠后，模型組小鼠肺臟充血、水腫，外觀呈暗褐色，肺泡間質(zhì)水腫、肺泡腔變小，內(nèi)有大量炎細胞浸潤，肺泡灌洗液中IL-6、IL-10水平及肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表達升高，與正常組相比，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組相比，五倍子酯提物組能減輕肺部病變，降低肺泡灌洗液中IL-6、IL-10水平及肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表達水平，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 五倍子酯提物可通過抑制TLR4的活化及下游MyD88依賴的轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，減少炎性因子的轉(zhuǎn)錄生成，減輕肺部炎癥，減緩急性肺損傷進程。

〔關(guān)鍵詞〕 五倍子酯提物;流感病毒;Toll樣受體4;急性肺損傷;白細胞介素-6;白細胞介素-10

〔中圖分類號〕R285.5;R563? ? ? ? 〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.12.003

人感染流感病毒引起的嚴(yán)重肺部感染，會通過激活肥大細胞釋放炎性介質(zhì)引起急性肺損傷（acute lung injury，ALI），甚至發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征，被認(rèn)為是流感病毒感染致死的主要原因[1]，引起了醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注。流感病毒誘導(dǎo)ALI機制究竟如何，是防控流感病毒必須解決的關(guān)鍵問題。有研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4（TLR4）能通過識別流感病毒基因組，激活TLR分子通路，并產(chǎn)生大量的炎性因子，導(dǎo)致肺損傷的發(fā)生[2-3]，被認(rèn)為是ALI的強勁推力[4]。MyD88是TLR4信號傳導(dǎo)依賴的經(jīng)典途徑，也對ALI起了重要作用[5]。

《開寶本草》中記載五倍子具有斂肺降火、澀腸止瀉、收濕斂瘡、斂汗止血的功效，用于肺虛久咳、肺熱咳嗽等[6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，五倍子具有多種藥理活性，包括抗病毒、廣譜抑菌、抗腫瘤、清除自由基抗氧化等[7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，五倍子能抑制呼吸道合胞病毒誘導(dǎo)的人支氣管上皮細胞凋亡，降低病毒的復(fù)制[8];抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶的活性，通過控制病毒感染力[9]，降低肺指數(shù)，減輕肺部炎癥等方式發(fā)揮抗流感病毒作用[10]。同時，本研究旨在探索TLR4在流感病毒所致小鼠ALI中的作用，進一步探討五倍子酯提物抗流感病毒的干預(yù)機制。

1 材料

1.1? 實驗動物

SPF級野生型C57BL小鼠，共48只，雌雄各半，體質(zhì)量18～20 g，小鼠及飼料、墊料均由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。動物許可證：SYXK（湘）2013-0005。

1.2? 流感病毒株

A型流感病毒小鼠肺適應(yīng)株（A/PR/8/34），由湖南師范大學(xué)病毒研究室惠贈，本實驗室-75 ℃冰箱保存。復(fù)蘇后經(jīng)10日齡雞胚尿囊腔接種培養(yǎng)傳代，血凝效價1∶640以上者供實驗用。將病毒尿囊液以滅菌生理鹽水作50倍稀釋。

1.3? 藥物制備

五倍子購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。取五倍子1 kg粉碎，以5倍量乙醇回流提取，提取物濃縮后先后以石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，其中乙酸乙酯萃取液濃縮后得五倍子乙酸乙酯浸膏，干燥研成粉末避光冷藏，經(jīng)計算提取率為10.65%。磷酸奧司他韋膠囊（宜昌長江藥業(yè)有限公司，75 mg/粒）購自湖南省人民醫(yī)院門診藥房。五倍子每日人臨床劑量為6 g，動物給藥劑量按動物每公斤體質(zhì)量占人體表面積的比值計算[11]，五倍子臨床等效劑量為0.865 g/kg，五倍子酯提物率為10.65%，即五倍子酯提物的臨床等效劑量為0.092 g/kg。用生理鹽水配制臨床等效劑量的陽性藥物奧司他韋水溶液21.63 mg/kg。

1.4? 主要試劑及設(shè)備

超凈工作臺（Thermo）;SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜設(shè)備（Bio-Rad）;ELX800酶標(biāo)儀（Bio-tek）;TLR4、MyD88、TRAF6兔多克隆抗體（Proteintech）;普通光學(xué)顯微鏡（Olympus）;HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（Proteintech）;4%多聚甲醛、IL-6和IL-10ELISA試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

2 方法

2.1? 動物分組、造模及干預(yù)

將48只C57BL小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，按隨機數(shù)字表法分為正常組（Sham）12只和造模組36只。模型制備方法為：小鼠在吸入乙醚輕度麻醉的狀態(tài)下，用1 mL注射器抽吸流感病毒液0.15 mL行鼻腔接種。正常組于相同條件下隔離飼養(yǎng)，并按同樣方法鼻腔接種生理鹽水0.15 mL。造模后隨機分為模型組（Model）、五倍子酯提物組（Wbz）、奧司他韋組（Oseltamivir）各12只。造模當(dāng)天為第0天，第1天開始第1次給藥，每天1次，每次0.4 mL，共給藥6 d。五倍子酯提物組予五倍子酯提物水溶液（0.092 g/kg），奧司他韋組予奧司他韋水溶液（21.63 mg/kg），正常組與模型組予等容量生理鹽水。

2.2? 檢測指標(biāo)及鑒定模型

各組分別于第2、4、6天給藥后隨機處理動物，每次4只，取肺泡灌洗液及肺組織進行指標(biāo)檢測。觀察小鼠感染病毒后日?；顒訝顟B(tài)、肺解剖標(biāo)本、肺病理切片并檢測肺泡灌洗液內(nèi)炎性因子含量及TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表達情況。

2.2.1? 小鼠活動狀態(tài)及肺組織解剖學(xué)觀察? 每天觀察各組小鼠活動狀態(tài)，對小鼠肺進行大體解剖學(xué)觀察并拍照記錄。

2.2.2? ELISA法檢測肺泡灌洗液中炎性因子的含量? 用10%水合氯醛麻醉小鼠，切開頸部皮膚，暴露氣管，在第2～3氣管環(huán)處用手術(shù)刀片挑開一小“一”字形切口，插入清潔灌胃針頭，結(jié)扎固定，連續(xù)2次用PBS緩沖液1.5 mL灌洗肺部，收集支氣管肺泡灌洗液約2 mL，1 000 r/min離心15 min，取上清液保存于-20 ℃冰箱。用ELISA法檢測各組肺泡灌洗液中IL-6、IL-10的含量。檢測程序及方法按照ELISA試劑盒說明書進行。

2.2.3? HE檢測小鼠肺部炎癥情況? 超凈工作臺上摘取肺組織，切成0.5 cm3大小，4%多聚甲醛固定、脫水、透明、石蠟包埋切片，5 μm厚切片，經(jīng)蘇木精和伊紅染色、中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

2.2.4? Westren blot法定量檢測肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表達情況? 分別提取各組小鼠肺組織總蛋白。取50 μg總蛋白100 ℃水浴10 min變性后，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉處理1 h，加入一抗（TLR4、MyD88、TRAF6兔多克隆抗體，1∶1 000），4 ℃孵育過夜，PBS清洗5 min×3次，加二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔，1∶3 000）室溫孵育1 h，PBS清洗5 min×3次，暗室加ECL化學(xué)發(fā)光劑壓片，顯影、定影后掃描X膠片。采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)，目的蛋白的表達水平以目的蛋白條帶灰度值比β-actin條帶灰度值反映。

2.3? 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，所有資料以“x±s”表示。顯著性比較用ANOVA分析，組間比較應(yīng)用LSD多重分析法。顯著性以P<0.05判定。

3 結(jié)果

3.1? 各組小鼠一般情況和大體解剖學(xué)觀察

與正常組相比，模型組小鼠在第2天后逐漸表現(xiàn)出精神沉郁，活動減少，食欲下降，聳毛，毛發(fā)雜亂，呼吸急促，鼻部流出有少許水樣分泌物，個別出現(xiàn)異常興奮，狂躁，攻擊性增強等狀態(tài)。與模型組比較，五倍子酯提物組小鼠精神較好，毛發(fā)光澤，活動、呼吸及飲食情況基本正常。第6天小鼠剖檢，從大體解剖學(xué)上見，除正常組外，其余各組小鼠肺組織可見明顯水腫、出血、瘀血等現(xiàn)象（箭頭所示），其中五倍子酯提物組小鼠肺組織的水腫、出血明顯輕于模型組;說明五倍子酯提物在一定程度上減輕了ALI嚴(yán)重程度。見圖1。

3.2? 各組小鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-10水平比較

由表1-2可知：模型組小鼠肺泡灌洗液中IL-6和IL-10含量明顯升高，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），第4天達到炎癥高峰。第4天藥物組小鼠肺組織中IL-6和IL-10表達水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

3.3? 各組小鼠肺組織病理觀察

由圖2可知：正常組小鼠第2、4、6天小鼠肺組織未見明顯變化。模型組小鼠第2天后可見支氣管上皮部分脫落，管壁水腫，管壁有以淋巴細胞、漿細胞為主的炎細胞浸潤，管腔內(nèi)可見大量脫落的組織、細胞及滲出物;第4天后，肺泡間質(zhì)水腫、增厚、肺泡腔變小，內(nèi)有大量炎細胞浸潤，出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎病變，支氣管壁擴張充血;第6天后，大量的炎細胞浸潤，病變擴大，炎癥進一步發(fā)展（圖2箭頭所示）。五倍子酯提組與模型組相比，表現(xiàn)為相同的病理學(xué)變化，間質(zhì)水腫、炎細胞浸潤、間質(zhì)性肺炎等變化，但相應(yīng)損傷程度較小。

3.4? 各組小鼠TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表達情況

由圖3可知：正常組可以檢測到少量的TLR4、MyD88、TRAF6的蛋白表達。模型組TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表達最強，提示流感病毒感染后TLR4-MyD88-TRAF6信號通路被激活。五倍子酯提物組和奧司他韋組TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表達均低于模型組。其中奧司他韋組TLR4、MyD88、TRAF6蛋白表達最低。

4 討論

TLR4信號通路是炎癥反應(yīng)過程中的關(guān)鍵，也是流感病毒感染時機體時被激活的重要信號通路之一。其基本過程是[5，12-13]：流感病毒感染時，Toll樣受體識別并結(jié)合病毒蛋白或核酸，受體發(fā)生構(gòu)象變化形成異源或同源二聚體，與MyD88結(jié)合，依次激活下游信號分子，如白介素受體相關(guān)激酶、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF6），TRAF6可使NF-？資B活化，促進基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控產(chǎn)生眾多細胞因子（如IL-6、IL-10、 TNF-α、IL-1β等），啟動促炎與抗炎性反應(yīng)，同時也造成了組織損傷。臨床研究發(fā)現(xiàn)[14]，ALI患者血清中的IL-6水平增高，且與多器官功能衰竭的發(fā)病機制密切相關(guān)。在肺損傷的動物模型中，L-10的含量升高，抑制某些炎性因子的產(chǎn)生。

本研究結(jié)果表明，流感病毒感染模型組小鼠后，小鼠肺組織嚴(yán)重?fù)p傷，肺泡灌洗液中炎性因子IL-6和IL-10含量升高，肺組織中TLR4、MyD88、TRAF6的蛋白表達水平顯著升高，且成時間相關(guān)性。本研究結(jié)果證實TLR4在流感病毒誘導(dǎo)的ALI發(fā)病機制中有著重要的作用，其可能的機制是流感病毒激活TLR4下游的MyD88依賴的信號通路，激活TRAF6，促進基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控IL-6、IL-10等炎性因子釋放，因子與因子、因子與組織之間相互作用造成肺部炎癥，推動ALI發(fā)生。與模型組相比，五倍子酯提物組小鼠肺組織受損較輕，肺泡灌洗液中IL-6和IL-10的釋放減少，TLR4、MyD88、TRAF6的蛋白表達水平下調(diào)。提示五倍子酯提物可通過抑制TLR4的活化及下游MyD88依賴的轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，減少炎性因子的轉(zhuǎn)錄生成，減輕肺部炎癥，減緩ALI進程。綜上所述，TLR4在A型流感病毒誘導(dǎo)的ALI起了重要作用。五倍子酯提物能降低TLR4的活化，抑制下游MyD88依賴的轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，減少炎性因子的釋放，減緩ALI進程，發(fā)揮抗病毒作用。

值得注意的是，奧司他韋對流感病毒感染小鼠后導(dǎo)致的急性肺損傷在第2、3天干預(yù)效果明顯，可能是奧司他韋對流感病毒神經(jīng)氨酸酶特異性靶點治療發(fā)揮了重要作用。而五倍子酯提物在第5、6天效果明顯，是否是五倍子酯提物在時效關(guān)系的作用下發(fā)揮對機體有宏觀調(diào)控或多靶點治療作用，值得進一步探究。

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