適配體生物傳感器快速檢測鼠傷寒沙門氏菌的初探

張海韻 嚴(yán)禮 肖穩(wěn)

摘要：沙門氏菌是一種食源性致病菌，能夠引起腸胃炎、腹瀉以及疼痛。傳統(tǒng)的檢測技術(shù)需經(jīng)過預(yù)增菌以及生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)等一系列復(fù)雜繁瑣的操作，檢驗(yàn)周期長、檢驗(yàn)效率較低。本研究通過合成一種羧甲基殼聚糖一分子信標(biāo)一金納米材料，采用一種新的基于分子信標(biāo)共價(jià)功能化的殼聚糖技術(shù)和金納米團(tuán)聚比色的方法對含SSeC基因的鼠傷寒沙門氏菌沙門氏菌進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示：這種方法具有較好的靈敏度和特異度。

關(guān)鍵詞：鼠傷寒沙門氏菌;適配體;生物傳感器

一、實(shí)驗(yàn)方法

1.生物傳感器的合成。

向30mg/mL的羧甲基殼聚糖溶液中加入NHS 0.17g，攪拌15min，然后在2℃冰水浴攪拌器中，緩慢滴入1-乙基-3-（二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC）的水溶液。lOmin滴加完成后，仍在冰水浴下繼續(xù)攪拌反應(yīng)th，使羧甲基殼聚糖的羧基充分活化。取1mL自制納米金溶液于EP管中，4℃、10000r/mm離心10min，棄上清，重懸。向納米金溶液中加入配好的羧甲基殼聚糖一適配體復(fù)合物100 μL，混勻，置于37℃搖床中孵育30h。為除去可能過量的適配體，將上述混合液在4℃、10000r/min離心10min，棄上清，最終得到羧甲基殼聚糖一適配體一納米金材料，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.靶標(biāo)DNA的檢測。

羧甲基殼聚糖一分子信標(biāo)一金納米復(fù)合物100 μL，加入靶標(biāo)DNA，使靶標(biāo)DNA終濃度為0.5 0nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L、400nmol/L、500nmol/L，于37℃孵育30min。加入1.5mol/L的NaCl溶液使釋放出的金納米顆粒團(tuán)聚，觀察溶液，若有顏色變化（紅變藍(lán)），則實(shí)驗(yàn)可行。用紫外可見分光光度計(jì)檢測最大吸收波長（520nm左右）的吸光度A值，進(jìn)行定量測定。

3.特異性試驗(yàn)。

將鼠傷寒沙門氏菌在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基于95℃水浴15min，置冰上10min以獲取相應(yīng)的ssDNA，加入100 μ L配好的羧甲基殼聚糖一分子信標(biāo)一金納米復(fù)合物，于37℃搖床孵育1h。加入1.50mol/L的氯化鈉溶液，混勻，觀察溶液顏色變化，用紫外分光光度計(jì)檢測520nm的吸光度A值。另外取金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌（5×107CFU/mL）的DNA，在相同的條件下進(jìn)行樣品檢測以證明該方法對于鼠傷寒沙門氏菌的特異性。

二、結(jié)果

1.靶標(biāo)DNA的檢測。

不同濃度的靶標(biāo)DNA檢測結(jié)果如圖1所示，隨著靶標(biāo)DNA濃度的增加，溶液的吸光度值也不斷增加，在靶標(biāo)DNA濃度為0.05μmol/L-0.5μmol/L的范圍內(nèi)與吸光度值呈線性關(guān)系，表明該方法在一定范圍內(nèi)可以對靶標(biāo)DNA進(jìn)行定量檢測，按照3 S/K計(jì)算出該方法對靶標(biāo)DNA的檢測下限為50nmol/L。

取不同類別的細(xì)菌在相同的條件下進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如圖2所示，加入鼠傷寒沙門氏菌的吸光度值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他三種細(xì)菌，因此表明了只有含有SSeC基因的鼠傷寒沙門氏菌才能使靶標(biāo)DNA分子信標(biāo)解崩釋放出金納米粒子，從而產(chǎn)生顯色反應(yīng)，從而說明該檢測方法對于鼠傷寒沙門氏菌具有較強(qiáng)的特異性。

本研究設(shè)計(jì)了一種新穎的、快速的基于分子信標(biāo)共價(jià)功能化的殼聚糖技術(shù)和金納米團(tuán)聚比色的生物傳感器用于檢測鼠傷寒沙門氏菌，該傳感器用于檢測含有SSeC基因的鼠傷寒沙門氏菌，其檢測下限可以達(dá)到50nmol/L，并且在DNA濃度為0.05μmol/L-0.5μmol/L的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，并且該種檢測方法具有較好的選擇性和特異性。