土壤因子對(duì)裸花紫珠有效成分含量的影響研究

黃梅 于福來 陳振夏 龐玉新 譚湘杰 謝小麗 李偉

摘 要 目的：研究裸花紫珠有效成分含量與土壤因子的相關(guān)性，為裸花紫珠的栽培及適宜生長(zhǎng)區(qū)的確定提供參考。方法：以海南、廣東和廣西等地的92份裸花紫珠和對(duì)應(yīng)的土壤為研究對(duì)象。采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定裸花紫珠中7種有效成分[咖啡酸、連翹酯苷B、木犀草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷（簡(jiǎn)稱“芹菜素糖苷”）和木犀草素]的含量，理化分析法測(cè)定土壤pH值及有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效鉀、有效磷、交換性鈣、交換性鎂、有效硫含量等8項(xiàng)因子，應(yīng)用相關(guān)分析、逐步回歸分析與灰色關(guān)聯(lián)度分析法對(duì)土壤因子和裸花紫珠中有效成分含量的相關(guān)性進(jìn)行綜合分析。結(jié)果：92份裸花紫珠中7種有效成分含量的變異系數(shù)為36.22%～77.42%，92份土壤中8種土壤因子測(cè)定值的變異系數(shù)為13.70%～87.53%。經(jīng)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，咖啡酸、毛蕊花糖苷含量與速效鉀含量呈顯著性正相關(guān)（P<0.05），連翹酯苷B含量與有機(jī)質(zhì)含量呈顯著性負(fù)相關(guān)（P<0.05），木犀草苷、異毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷、芹菜素糖苷與交換性鈣含量呈顯著性負(fù)相關(guān)（P<0.05），木犀草苷、異毛蕊花糖苷含量與有效硫含量呈極顯著性負(fù)相關(guān)（P<0.01），芹菜素糖苷、木犀草素與有效硫含量呈顯著性負(fù)相關(guān)（P<0.05）；經(jīng)逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)，速效鉀含量為影響咖啡酸和毛蕊花糖苷含量的主導(dǎo)因子，有效磷含量為影響木犀草素含量的主導(dǎo)因子，有效硫含量為影響木犀草苷、異毛蕊花糖苷含量的主導(dǎo)因子；經(jīng)灰色關(guān)聯(lián)度分析發(fā)現(xiàn)，影響裸花紫珠有效成分含量的主要土壤因子為pH值和速效鉀、有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷含量。結(jié)論：各土壤因子對(duì)裸花紫珠中不同有效成分含量的影響不同，速效鉀含量為影響裸花紫珠7種有效成分含量的主導(dǎo)因子，其次為有效硫、有效磷和有機(jī)質(zhì)含量。

關(guān)鍵詞 裸花紫珠；有效成分；土壤因子；相關(guān)性

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the correlation between the active ingredient content of Callicarpa nudiflora and soil factors， and to provide reference for confirming the cultivation and suitable growth area of C. nudiflora. METHODS： Totally 92 samples of C. nudiflora and corresponding soil from Hainan， Guangdong， Guangxi and other places were selected as research subjects. The contents of 7 active ingredients [caffeic acid， forsythoside B， galuteolin， acteoside， isoacanthoside， apigenin-7- O-β-D-glycoside （shorted for apigenin glycoside） and luteolin] in C. nudiflora were determined by HPLC. pH， organic matter， alkaline nitrogen， available potassium， available phosphorus， exchangeable calcium， exchangeable magnesium and available sulfur of soil were determined by physical and chemical analysis. Correlation analysis， stepwise regression analysis and gray relational analysis were used to analyze the relationship between soil factors and active ingredients content of C. nudiflora. RESULTS： The variation coefficient of 7 active ingredients content in 92 C. nudiflora was 36.22%-77.42%， and variation coefficient of 8 soil factors in 92 soil was 13.70%-87.53%， i.e. active ingredients content and soil factor of C. nudiflora from different producing areas were different greatly. Through correlation analysis， the contents of caffeic acid and acteoside were positively related with the content of available potassium significantly （P<0.05）； the content of forsythiaside B was negatively related with the content of organic matter significantly （P<0.05）； the contents of galuteolin， isoacanthoside， acteoside and apigenin glycoside were negatively correlated with the contents of exchangeable calcium significantly （P<0.05）； the contents of galuteolin and isoacanthoside were very negatively correlated with the content of available sulfur significantly （P<0.01）； the content of luteolin was negatively correlated with the content of available sulfur significantly （P<0.05）. Through stepwise regression analysis， the content of caffeic acid and acteoside were dominantly affected by the available potassium； luteolin was dominantly affected by available phosphorus， while galuteolin and isoacteoside were dominantly affected by the available sulfur. Through grey relational analysis， the main influential factors for effective ingredients content of C. nudiflora were pH， available potassium， organic matter， alkaline nitrogen and available phosphorus. CONCLUSIONS： Each soil factor has different effect on the different active ingredients content. The main soil factor that affects the effective ingredient content of C. nudiflora is available potassium， followed by available sulfur， available phosphorus and organic matter.

KEYWORDS Callicarpa nudiflora； Active ingredients； Soil factors； Correlation

裸花紫珠為馬鞭草科紫珠屬植物，藥用部位為干燥葉和帶葉的嫩枝，為海南省道地藥材，也是黎醫(yī)常用藥材之一，主產(chǎn)于海南、廣西、廣東等省，在東南亞地區(qū)的印度、越南和新加坡等地也有分布[1-4]。裸花紫珠含有黃酮類、苯丙素類與有機(jī)酸類等多種化學(xué)成分[5-6]，具有止血[7]、消炎[8]、抑菌[9]等功效，主治外傷出血、跌打腫痛、胃腸出血等癥[10]，臨床應(yīng)用較為廣泛，是海南省重要民族藥裸花紫珠分散片、裸花紫珠片、裸花紫珠膠囊等多種中成藥的主要原料。

植物中有效成分的形成與積累受環(huán)境因素的影響較大，除了隨氣候季節(jié)變化外，亦受土壤中的礦物質(zhì)種類和土壤肥力等因素的影響。土壤肥力及礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)直接影響藥用植物品質(zhì)。于福來[11]、鄭東昆等[12]對(duì)不同地區(qū)的裸花紫珠化學(xué)成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的裸花紫珠中有效成分含量差異較大。劉式超等[13]發(fā)現(xiàn)氮、磷對(duì)裸花紫珠中有效成分及生物量均有一定影響。而目前對(duì)于裸花紫珠的研究多集中在含量測(cè)定[14]、成分分析及藥理[15]等方面，尚未見到有關(guān)裸花紫珠植株有效成分含量與土壤因子間相關(guān)性的研究報(bào)道?；诖耍狙芯恐荚谕ㄟ^對(duì)海南、廣東、廣西等不同產(chǎn)地92份裸花紫珠的有效成分及其生長(zhǎng)的土壤因子進(jìn)行相關(guān)性研究，揭示影響裸花紫珠有效成分含量的主導(dǎo)土壤因子，為裸花紫珠的規(guī)范化栽培及適宜生長(zhǎng)區(qū)的確定提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜（HPLC）儀（包括G1311C四元泵、G1316A 柱溫箱、G1329B 全自動(dòng)進(jìn)樣器和G1315D 二極管陣列檢測(cè)器）購(gòu)自美國(guó)安捷倫科技公司；CPA225D型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；KQ-500DB型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；PHS-25型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（上海今邁儀器儀表公司）；AA-7000型原子吸收分光光度計(jì)（日本島津公司）；FP6410型火焰分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；722S型可見分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.2 藥品、土壤與試劑

裸花紫珠藥材樣品于2016年5月-2017年9月采自海南11市（縣）、廣東3市（縣）、廣西2市（縣），共計(jì)92份，經(jīng)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所龐玉新研究員鑒定均為裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook. et Arn）的干燥葉；土壤樣品采集于相應(yīng)藥材下0～20 cm的耕作層，將同一份藥材下采集的土壤樣品充分混勻，用四分法縮分后放置在實(shí)驗(yàn)室中自然風(fēng)干，磨細(xì)備用；對(duì)照品咖啡酸（批號(hào)：Y17D6C7672）、連翹酯苷B（批號(hào)：20140120）、木犀草苷（批號(hào)：Y23S7H21785）、毛蕊花糖苷（批號(hào)：PMO321SA14）、異毛蕊花糖苷（批號(hào)：HA0820KA29）、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷（以下簡(jiǎn)稱“芹菜素糖苷”，批號(hào)：P20N6F6297）、木犀草素（批號(hào)：YO1D6S6815）均購(gòu)自上海源葉生物制藥公司，純度均≥98%；乙腈為色譜純，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，水為超純水。藥材來源信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 裸花紫珠中7種有效成分含量的測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent-TC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4%磷酸（B）（梯度洗脫：0～30 min，8%→16%A；30～45 min，16%→21%A；45～55 min，21%→24%A；55～65 min，24%→35%A；65～70 min，35%→100%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 溶液的制備 （1）混合對(duì)照品母液：分別精密稱取適量咖啡酸、木犀草素對(duì)照品置于不同的10 mL量瓶中，分別加入70%甲醇溶解并定容；分別精密稱取適量連翹酯苷B、木犀草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、芹菜素糖苷對(duì)照品適量，置于同一10 mL量瓶中，加入適量70%甲醇溶解后再加入上述咖啡酸和木犀草素對(duì)照品溶液各1 mL，然后用70%甲醇定容，即制備成含咖啡酸0.001 64 mg/mL、連翹酯苷B 0.225 mg/mL、木犀草苷0.062 mg/mL、毛蕊花糖苷2.01 mg/mL、異毛蕊花糖苷0.251 mg/mL、芹菜素糖苷0.155 mg/mL、木犀草素0.001 95 mg/mL的混合對(duì)照品母液。（2）供試品溶液：將陰干后的裸花紫珠的功能葉片打粉，過20目篩。稱取1 g裸花紫珠粉末置于100 mL離心管中，加入70%甲醇50 mL，在40 kHz、400 W條件下超聲提取20 min，吸取上層清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。（3）空白溶液：取70%甲醇作為空白溶液。

2.1.3 系統(tǒng)適用性考察 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品母液、供試品溶液（海南白沙產(chǎn)樣品）和空白溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。結(jié)果表明，在該色譜條件下，理論板數(shù)以毛蕊花糖苷峰計(jì)大于200 000，各待測(cè)成分間、待測(cè)成分與雜質(zhì)峰間基線分離良好，分離度均大于1.5，其他成分對(duì)待測(cè)成分的測(cè)定無干擾，色譜圖見圖1。

2.1.4 方法學(xué)考察 按本課題組前期建立方法[16]進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果，各成分在進(jìn)樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好（R2≥0.999 0），精密度、穩(wěn)定性、方法回收率、重復(fù)性等結(jié)果均符合相關(guān)要求。

2.1.5 樣品含量測(cè)定 取表1中各樣品適量，分別按“2.1.2（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并計(jì)算樣品中各成分含量。92份裸花紫珠中有效成分的基本統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表2。

由表2可見，各樣品中有效成分含量的變異系數(shù)為36.22%～57.59%。其中含量差異最大的為異毛蕊花糖苷，最大值為7.79 mg/g，最小值僅為0.04 mg/g，變異系數(shù)為77.42%；其次為連翹酯苷，其最大值為4.23 mg/g，最小值僅為0.05 mg/g，變異系數(shù)為75.93%；咖啡酸最大值為0.49 mg/g，最小值僅0.01mg/g，變異系數(shù)為66.14%，位居第3；其余4種成分（木犀草苷、毛蕊花糖苷、芹菜素糖苷和木犀草素）的含量差異也較為顯著。說明不同產(chǎn)地的裸花紫珠中各有效成分含量差異較大。

2.2 土壤因子測(cè)定

土壤因子測(cè)定主要參考《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[17-18]和《土壤調(diào)查實(shí)驗(yàn)室分析方法》[19]，其中土壤有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容量法測(cè)定，堿解氮含量采用堿解氮擴(kuò)散法測(cè)定，速效鉀含量采用1 mol/L的NH4OAc浸提-火焰分光光度計(jì)法測(cè)定，有效磷含量采用0.03 mol/L NH4F-0.025 mol/L HCl浸提-鉬銻抗顯色法測(cè)定，交換性鈣、交換性鎂含量采用1 mol/L的 NH4OAc浸提-原子吸收分光光度法測(cè)定，有效硫含量采用硫酸鋇比濁法測(cè)定，土壤pH值采用PHS-25實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)測(cè)定。92份土壤中土壤因子含量的基本統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表3。

由表3可見，不同土壤樣品中8種土壤因子的變異系數(shù)為13.70%～87.53%，除pH值的差異稍小外，其余7種土壤因子間均有較大差異，差異最大的為有效磷，最大值為91.19 mg/kg，最小值僅為1.78 mg/kg，變異系數(shù)達(dá)87.53%；其次為交換性鎂，最大值為716.48 mg/kg，最小值僅為7.50 mg/kg，變異系數(shù)達(dá)85.80%；再者為有效硫，最大值為37.90 mg/kg，最小值僅為0.67 mg/kg，變異系數(shù)為85.40%。

2.3 裸花紫珠有效成分含量與土壤因子的相關(guān)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)裸花紫珠有效成分含量與土壤因子進(jìn)行簡(jiǎn)單雙變量相關(guān)分析，P<0.05表示呈顯著相關(guān)性，P<0.01表示呈極顯著相關(guān)性。每個(gè)樣品測(cè)定2次，取2次平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。92份裸花紫珠樣品中有效成分含量與土壤因子的相關(guān)系數(shù)測(cè)定結(jié)果見表4。

由表4可見，咖啡酸含量與速效鉀含量呈極顯著性正相關(guān)（P<0.01）；連翹酯苷B含量與有機(jī)質(zhì)含量呈顯著性負(fù)相關(guān)（P<0.05）；木犀草苷和異毛蕊花糖苷含量均與交換性鈣含量呈顯著性負(fù)相關(guān)（P<0.05），與有效硫含量呈極顯著性負(fù)相關(guān)（P<0.01）；毛蕊花糖苷含量與速效鉀含量呈顯著性正相關(guān)（P<0.05），與交換性鈣含量呈顯著性負(fù)相關(guān)（P<0.05）；芹菜素糖苷含量與交換性鈣、有效硫含量呈顯著性負(fù)相關(guān)（P<0.05）；木犀草素含量與有效硫含量呈顯著性負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

2.4 裸花紫珠有效成分含量與土壤因子的逐步回歸分析

由于各土壤因子并非單獨(dú)影響裸花紫珠中各有效成分的含量，為了篩選影響裸花紫珠中7種有效成分含量的土壤主導(dǎo)因子，在“2.3”項(xiàng)簡(jiǎn)單雙變量相關(guān)分析的基礎(chǔ)上，以咖啡酸（Y1）、連翹酯苷B（Y2）、木犀草苷（Y3）、毛蕊花糖苷（Y4）、異毛蕊花糖苷（Y5）、芹菜素糖苷（Y6）和木犀草素（Y7）含量為因變量，以土壤 pH值（X1）、有機(jī)質(zhì)含量（X2）、堿解氮含量（X3）、速效鉀含量（X4）、有效磷含量（X5）、交換性鈣含量（X6）、交換性鎂含量（X7）和有效硫含量（X8）為自變量，應(yīng)用多變量逐步回歸剔除對(duì)裸花紫珠各有效成分含量影響較小的土壤因子。裸花紫珠各有效成分含量與主導(dǎo)因子的逐步回歸方程統(tǒng)計(jì)模型見表5（表中“-”表示逐步回歸分析時(shí)，各土壤因子與該成分均無顯著相關(guān)性，在計(jì)算回歸方程時(shí)自變量均被剔除，無逐步回歸方程）。

結(jié)合表5中的回歸方程可知，速效鉀含量為影響咖啡酸和毛蕊花糖苷含量的主導(dǎo)因子，且均呈顯著性正相關(guān)（P<0.05）；有效磷含量為影響木犀草素含量的主導(dǎo)因子，但呈顯著性負(fù)相關(guān)（P<0.05）；有效硫含量為影響木犀草苷和異毛蕊花糖苷含量的主導(dǎo)因子，且均呈顯著性負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

2.5 裸花紫珠有效成分含量與土壤因子的灰色關(guān)聯(lián)度分析

為進(jìn)一步探究土壤因子與裸花紫珠有效成分含量之間的關(guān)系，按照灰色系統(tǒng)理論，分別以有效成分含量作為母序列，各土壤因子作為子序列，經(jīng)灰色關(guān)聯(lián)度分析得出各土壤因子與裸花紫珠有效成分含量的關(guān)聯(lián)度系數(shù)，詳見表6。

由表6可知，影響咖啡酸含量的主要土壤因子為pH值和速效鉀、有機(jī)質(zhì)、有效磷含量；影響連翹酯苷B含量的主要土壤因子為pH值和堿解氮、交換性鈣、有效磷含量；影響木犀草苷含量的主要土壤因子為pH值和速效鉀、有機(jī)質(zhì)、堿解氮含量；影響毛蕊花糖苷含量的主要因子為pH值和速效鉀、有機(jī)質(zhì)、堿解氮含量；影響異毛蕊花糖苷含量的主要土壤因子為pH值和速效鉀、有效磷、堿解氮含量；影響芹菜素糖苷含量的主要土壤因子為pH值和速效鉀、有機(jī)質(zhì)、堿解氮含量；影響木犀草素含量的主要因子土壤為pH值和有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效鉀含量。綜上分析可知，影響裸花紫珠有效成分含量的主要土壤因子為pH值和速效鉀、有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷含量。

3 討論

3.1 相關(guān)性分析研究中方法的選擇

目前研究相關(guān)性較為常用的統(tǒng)計(jì)方法為簡(jiǎn)單雙變量相關(guān)分析、多元線性回歸及典型相關(guān)分析等，不同的方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。本研究除了采用傳統(tǒng)的相關(guān)分析方法外，還采用了灰色關(guān)聯(lián)度分析，其主要目的是通過一定的方法理清各因素間的主要關(guān)系，找出影響最大的因素?；疑P(guān)聯(lián)度分析與相關(guān)分析中針對(duì)因素間數(shù)組的靜態(tài)分析不同，其主要是進(jìn)行時(shí)間序列的動(dòng)態(tài)比較，同時(shí)分析時(shí)并不要求太多數(shù)據(jù)，彌補(bǔ)了相關(guān)分析中存在的不足。將相關(guān)分析、逐步回歸分析及灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)合起來，能較為全面地說明土壤因子對(duì)裸花紫珠中有效成分含量的影響情況。

3.2 影響裸花紫珠有效成分含量主導(dǎo)因子的探討

在植物生長(zhǎng)過程中主要是從土壤中獲取自身生長(zhǎng)所需的物質(zhì)，那么藥材的質(zhì)量與土壤因子必然存在密切的聯(lián)系。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，氮肥、磷肥和鉀肥合理配施有利于增產(chǎn)。劉式超[13]研究發(fā)現(xiàn)，低氮有利于裸花紫珠葉、枝中黃酮物質(zhì)的合成，低氮或高磷有利于總酚酸含量的提高，高氮或低磷有利于總糖含量的提高。本研究通過對(duì)裸花紫珠中7種有效成分與土壤pH值等8個(gè)因子進(jìn)行相關(guān)分析、逐步回歸分析及灰色關(guān)聯(lián)度分析，發(fā)現(xiàn)影響裸花紫珠中不同有效成分含量的主導(dǎo)因子各不相同，綜合本研究3種統(tǒng)計(jì)分析方法的結(jié)果得出速效鉀為影響裸花紫珠有效成分含量的主導(dǎo)因子，而有效硫、有效磷及有機(jī)質(zhì)在其中兩種分析方法中均顯示對(duì)裸花紫珠有效成分的含量影響較大。因此，栽培施肥時(shí)，可根據(jù)實(shí)際情況，適當(dāng)增加鉀肥的量，同時(shí)注意控制硫、磷元素及有機(jī)質(zhì)的用量。

裸花紫珠有效成分的含量除了受到土壤因子的影響外，還與植物的自身遺傳和產(chǎn)地的光照、降水量、溫度等氣象因子及地形因子密切相關(guān)，綜合考慮包含氣象因子、地形因子及土壤因子對(duì)裸花紫珠的產(chǎn)量及有效成分含量的影響，才能更好地為確定裸花紫珠的適宜產(chǎn)地及裸花紫珠的種植提供依據(jù)，這將是筆者進(jìn)一步研究的方向。

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（收稿日期：2018-03-22 修回日期：2018-05-15）

（編輯：林 靜）