壯藥戰(zhàn)骨總黃酮提取物經(jīng)皮給藥對大鼠/小鼠的抗炎、鎮(zhèn)痛作用研究

葉勇 覃妮 庾茜 鄧俊宇 黃秋潔

摘 要 目的：研究壯藥戰(zhàn)骨總黃酮提取物經(jīng)皮給藥的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，為戰(zhàn)骨經(jīng)皮給藥新制劑的研發(fā)提供參考。方法：分別將小鼠和大鼠分為空白組（40%乙醇溶液）、陽性對照組（雙氯酚酸二乙胺，小鼠的給藥劑量為0.390 g/kg、大鼠為0.280 g/kg）和戰(zhàn)骨總黃酮提取物低、中、高劑量組（以生藥計小鼠的給藥劑量為0.400、0.791、6.330 g/kg，大鼠為0.136、0.275、2.200 g/kg）。腹部經(jīng)皮給藥，每天給藥1次。分別采用二甲苯致炎法測定小鼠耳腫脹率（給藥5 d）和弗氏完全佐劑致炎法測定致炎2、4、9、15 d后大鼠的足趾腫脹度（給藥18 d），以考察戰(zhàn)骨總黃酮提取物的抗炎作用。采用乙酸扭體法測定小鼠注射1%乙酸后20 min內(nèi)的扭體次數(shù)（給藥5 d），末次給藥后30、60、90 min采用熱板致痛法測定小鼠的疼痛抑制率（給藥5 d），光熱甩尾法測定大鼠的可能最大鎮(zhèn)痛百分率（給藥18 d）以及鼠尾壓痛法測定小鼠的痛閾提高值（給藥5 d），以綜合評價戰(zhàn)骨總黃酮提取物的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果：與空白組比較，戰(zhàn)骨總黃酮提取物高劑量組小鼠耳腫脹率和致炎不同時間后大鼠的足趾腫脹度顯著降低（P<0.05或P<0.01），小鼠扭體次數(shù)顯著減少（P<0.01），給藥不同時間后小鼠的疼痛抑制率以及可能最大鎮(zhèn)痛百分率和痛閾提高值均顯著升高（P<0.05或P<0.01）；戰(zhàn)骨總黃酮提取物中劑量組大鼠在致炎2、4、9 d的足趾腫脹度顯著降低（P<0.05或P<0.01），小鼠扭體次數(shù)顯著減少（P<0.01），末次給藥后60、90 min的小鼠疼痛抑制率和痛閾提高值顯著升高（P<0.05或P<0.01）；戰(zhàn)骨總黃酮提取物低劑量組大鼠在致炎2、4、9 d的足趾腫脹度顯著降低（P<0.05或P<0.01），給藥后90 min的疼痛抑制率顯著升高（P<0.01）。結(jié)論：戰(zhàn)骨總黃酮提取物經(jīng)皮給藥具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，且呈現(xiàn)一定的量效關系。

關鍵詞 壯藥；戰(zhàn)骨總黃酮提取物；抗炎；鎮(zhèn)痛；經(jīng)皮給藥；小鼠；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study anti-inflammatory and analgesic effects of total flavonoids extract of Zhuang medicine Premna fulva for rats/mice by transdermal administration， and to provide reference for R&D of new preparation extract of P. fulva by transdermal administration. METHODS： Mice and rats were divided into blank group （40% Ethanol solution）， positive control group （diclofenac diethylamine， 0.390 g/kg for mice， 0.280 g/kg for rats）， total flavonoids extract of P. fulva low-dose， medium-dose and high-dose groups （0.400， 0.791， 6.330 g/kg for mice， 0.136， 0.275， 2.200 g/kg for rats， calculated by crude drug） respectively. They were given medicine by transdermal administration， once a day. Ear swelling rate of mice was determined by xylene-induced inflammation method （5 d after administration）. The inflammation method with Freunds complete adjuvant was used to determine the degree of paw edema in rats 2， 4， 9， 15 d after inducing inflammation （18 d after medication） so as to investigate anti-inflammatory effects of total flavonoids extract of P. fulva. The times of twisting in mice was determined by acetic acid-induced writhing method after injection of acetic acid in 20 min （5 d after medication） after. Inhibitory rate of pain in mice was determined by hot plate-induced pain method 30， 60， 90 min after last administration （5 d after medication）. Potential maximal analgesia percentage of rats was determined by light tail-flick method （18 d after medication）， and the improvement of pain threshold was determined in by mice tail tenderness method （5 d after medication）. Analgesic effects of total flavonoids extract of P. fulva were evaluated comprehensively. RESULTS： Compared with blank group， the ear swelling rate in mice and paw edema of rats at different time points of inflammation were decreased significantly in total flavonoids extract of P. fulva high-dose group （P<0.05 or P<0.01）， while the writhing times of mice was decreased significantly （P<0.01）； inhibitory rate of pain at different times， potential maximal analgesia percentage and the improvement of pain threshold in mice were improved significantly （P<0.05 or P<0.01）. The degree of paw edema in rats was decreased significantly 2， 4， 9 d after inducing inflammation in total flavonoids extract of P. fulva medium-dose group （P<0.05 or P<0.01）； the writhing times of mice was decreased significantly （P<0.01）； inhibitory rate of pain and the improvement of pain threshold in mice were both increased significantly 60， 90 min after last administration （P<0.05 or P<0.01）. The degree of paw edema in rats was decreased significantly 2， 4， 9 d after inducing inflammation in total flavonoids of P. fulva low-dose group （P<0.05 or P<0.01）， while inhibitory rate of pain was increased significantly 90 min after medication （P<0.01）. CONCLUSIONS： The total flavonoids extract of P. fulva by transdermal administration have significant anti-inflammatory and analgesic effect， with a dose-response relationship.

KEYWORDS Zhuang medicine； Total flavonoids extract of Premna fulva； Anti-inflammation； Analgesis； Transdermal administration； Mice； Rats

戰(zhàn)骨為馬鞭草科植物黃毛豆腐柴Premna fulva Craib的干燥莖，又名土霸王、穿云箭，壯語為“猛夢”，主產(chǎn)于廣西西南部、貴州南部及云南南部至東南部等地，在泰國北部、老撾、越南北部至中部也有分布，全年可采。壯醫(yī)認為戰(zhàn)骨性淡、平，可祛風毒、除濕毒、通龍路、散瘀止痛、強筋健骨，多用于肥大性脊髓炎、發(fā)旺（風濕骨痛）等病癥的治療[1]。廣西壯族民間常用其治療腰腿痛、跌打損傷、風濕性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎及感冒身痛、淋巴結(jié)炎、肝區(qū)痛等癥，為廣西道地藥材，現(xiàn)收載于《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標準》第一卷[1]。目前，對于戰(zhàn)骨的研究主要集中在種質(zhì)資源[2]、化學成分[3-5]、質(zhì)量控制[6]、藥理作用[7-10]等方面。本課題組前期研究表明，柚皮素、芹菜素等黃酮類物質(zhì)可能是戰(zhàn)骨提取物中的主要活性成分[6]，并初步探討了其中黃酮類物質(zhì)透皮吸收的可行性[11]。本研究通過經(jīng)皮給藥的途徑對廣西特色壯藥戰(zhàn)骨有效部位——總黃酮的抗炎、鎮(zhèn)痛活性進行初步探討，以期對戰(zhàn)骨經(jīng)皮給藥新制劑的研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

YLS-3E型電子壓痛儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）；R-1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；BS2245型分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）； SW-200型光熱尾痛儀、RB-200型智能熱板儀（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

戰(zhàn)骨藥材購于廣西壯族自治區(qū)宜州市，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學傅鵬副教授鑒定為馬鞭草科豆腐柴屬植物黃毛豆腐柴的莖；戰(zhàn)骨總黃酮提取物為廣西醫(yī)科大學藥劑學實驗室提供（批號：20150926），其中總黃酮含量約為35%；雙氯酚酸二乙胺乳膠劑[北京諾華制藥有限公司，批號：X1511，規(guī)格：20 g ∶ 0.2 g（以雙氯芬酸鈉計）]；弗氏完全佐劑（美國Sigma公司）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

清潔級KM小鼠230只[♀♂兼用，體質(zhì)量（20±2） g]和Wistar大鼠80只[♂，體質(zhì)量（200±20） g]均購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2014-0002。實驗前24 h，給大、小鼠腹部脫毛，大鼠脫毛面積為3 cm×3 cm、小鼠為2 cm×2 cm，作為給藥部位。

2 方法

2.1 戰(zhàn)骨總黃酮提取物的制備

精密稱取戰(zhàn)骨藥材細粉250 g， 加入10倍量80%乙醇回流提取2次， 每次1 h， 提取液濃縮至膏狀，經(jīng)D101大孔樹脂柱上樣， 先用蒸餾水洗脫至無色， 再用3倍柱體積40%乙醇洗脫， 收集合并乙醇洗脫液，調(diào)整洗脫液pH為5左右，減壓回收乙醇，真空干燥，即得。

2.2 戰(zhàn)骨總黃酮提取物溶液的制備

大鼠用藥：分別稱取戰(zhàn)骨總黃酮提取物適量，置于50 mL量瓶中，用40%乙醇溶液溶解并稀釋至刻度，作為中劑量（以生藥量計為0.275 g/kg），高、低劑量分別為中劑量的8、0.5倍（即以生藥量計分別為2.200、0.136 g/kg）。小鼠用藥：分別稱取戰(zhàn)骨總黃酮提取物適量，置于50 mL量瓶中，用40%乙醇溶液溶解并稀釋至刻度，作為中劑量（以生藥量計為0.791 g/kg），高、低劑量分別為中劑量的8、0.5倍（以生藥量計分別為6.330、0.400 g/kg）。

2.3 抗炎作用實驗

2.3.1 戰(zhàn)骨總黃酮提取物對二甲苯致炎小鼠耳腫脹的影響 取小鼠50只（♂）隨機分為空白組、陽性對照組和戰(zhàn)骨總黃酮提取物低、中、高劑量組，每組10只。陽性對照組小鼠按0.390 g/kg涂抹雙氯酚酸二乙胺乳膠劑[12]，戰(zhàn)骨總黃酮提取物組小鼠按“2.2”項下劑量涂抹相應藥液0.01 mL/g，空白組小鼠涂抹40%乙醇溶液0.01 mL/g。每日給藥1次，連續(xù)給藥5 d。末次給藥30 min后，于小鼠右耳前后兩面各涂抹二甲苯20 μL，30 min后脫臼處死小鼠，剪下雙耳，用打孔器（直徑8 mm）在剪下的雙耳中央處打孔，立即稱定耳片質(zhì)量（mg），并計算耳腫脹度[耳腫脹度（mg）=右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量]，進一步計算耳腫脹率[（耳腫脹率（%）=右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量）/右耳質(zhì)量×100%]和耳腫脹抑制率[耳腫脹抑制率（%）=空白組耳腫脹度-給藥組耳腫脹度）/空白組耳腫脹度×100%]。

2.3.2 戰(zhàn)骨總黃酮提取物對大鼠佐劑性關節(jié)炎的影響 取大鼠30只（♂）隨機分為空白組、陽性對照組和戰(zhàn)骨總黃酮提取物高、中、低劑量組，每組6只。陽性對照組大鼠于脫毛區(qū)涂抹雙氯酚酸二乙胺乳膠劑0.280 g/kg[12]，戰(zhàn)骨總黃酮提取物組大鼠按“2.2”項下劑量涂抹相應藥液0.002 mL/g，空白組大鼠涂抹40%乙醇溶液0.002 mL/g。每日給藥1次，連續(xù)給藥18 d。第3天給藥30 min后，于每鼠右后足跖內(nèi)注射弗氏完全佐劑0.05 mL致炎。在致炎前24 h和致炎后第2、4、9、15天分別測量大鼠右后足跖的體積（mL），計算各組大鼠的足趾腫脹度[足趾腫脹度（mL）=（致炎后足趾體積-致炎前足趾體積）/致炎前足趾體積×100%]。并從致炎后第9天開始，觀察各組大鼠前肢、耳和尾部病變情況。

2.4 鎮(zhèn)痛實驗

2.4.1 戰(zhàn)骨總黃酮提取物對乙酸引起小鼠扭體反應的影響 取小鼠50只（♂）按“2.3.1”項下方法分組、給藥。末次給藥后30 min，腹腔注射1%乙酸溶液0.02 mL/g，觀察并記錄注射乙酸后20 min內(nèi)各組小鼠的扭體次數(shù)。

2.4.2 戰(zhàn)骨總黃酮提取物對熱板刺激引起小鼠疼痛反應的影響 調(diào)熱板儀控制溫度在（55.0±0.5） ℃，將80只小鼠置于智能熱板儀中，啟動電子計時器，以小鼠舔后足為疼痛反應指標，觀察小鼠出現(xiàn)舔后足所需時間（s）作為該鼠痛閾值，凡舔足時間小于5 s或大于30 s者棄之不用。將篩選出的50只小鼠按“2.3.1”項下方法分組、給藥。于末次給藥后30、60、90 min，分別以熱板法測量各組小鼠的痛閾值，如60 s后仍無反應，將小鼠取出，以免燙傷，其痛閾值以60 s計。根據(jù)公式計算給藥不同時間后各組小鼠的疼痛抑制率[疼痛抑制率（%）=（給藥后痛閾值-給藥前痛閾值）/給藥前痛閾值×100%]。

2.4.3 戰(zhàn)骨總黃酮提取物對大鼠光熱甩尾反應的影響 取50只大鼠，將大鼠尾部距尖端1.5 cm處內(nèi)側(cè)皮膚置于熱輻射測痛儀輻射點上，以大鼠尾端皮膚接受熱輻射刺激到其自動從刺激點甩開的時間（s）為基礎痛閾，選擇基礎痛閾大于2 s并小于10 s的大鼠用于實驗。將篩選合格的30只大鼠（♂）按 “2.3.2”項下方法分組、給藥。末次給藥30 min后，按上述方法測定各組大鼠的痛閾值，以60 s不甩開輻射點為鎮(zhèn)痛百分之百，以給藥前、后自身比較計算可能最大鎮(zhèn)痛百分率[可能最大鎮(zhèn)痛百分率（%）=（給藥后痛閾值-給藥前痛閾值）/給藥前痛閾值×100%]。

2.4.4 戰(zhàn)骨總黃酮提取物對小鼠鼠尾壓痛反應的影響 將50只小鼠（♀）按“2.3.1”項下方法分組、給藥。末次給藥30 min后，將小鼠置于固定器內(nèi)，尾部暴露在固定器外，待小鼠安靜后進行實驗。測定前在小鼠尾部1/3處作為施壓點進行標記，施壓時以小鼠出現(xiàn)掙扎或嘶叫作為疼痛反應指標，記錄此壓力值（g），即為該鼠痛閾值。重復測定時，支撐點可稍作移動，以免壓傷組織。以給藥后的痛閾提高值（給藥后痛閾值-給藥前痛閾值）為測定指標。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，再以LSD法進行組間兩兩比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 抗炎實驗結(jié)果

3.1.1 戰(zhàn)骨總黃酮提取物對二甲苯致炎小鼠耳腫脹的影響結(jié)果 與空白組比較，戰(zhàn)骨總黃酮提取物高劑量組和陽性對照組小鼠耳腫脹率顯著降低（P<0.01），其余各組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與陽性對照組比較，戰(zhàn)骨總黃酮提取物高劑量組小鼠耳腫脹率顯著降低、耳腫脹抑制率顯著升高（P<0.05）。各組小鼠耳腫脹率和耳腫脹抑制率測定結(jié)果見表1。

3.1.2 戰(zhàn)骨總黃酮提取物對大鼠佐劑性關節(jié)炎的影響結(jié)果 致炎后24 h，空白組大鼠右后足跖明顯腫脹，其后4 d內(nèi)足腫脹無明顯變化；致炎9 d后足跖腫脹度有升高趨勢，但在致炎15 d后明顯好轉(zhuǎn)。在致炎后2、4 d，陽性對照組和戰(zhàn)骨總黃酮提取物各劑量組大鼠的足跖腫脹程度顯著低于空白組（P<0.05或P<0.01），且戰(zhàn)骨總黃酮提取物高劑量組大鼠在致炎后2、4 d的足跖腫脹度均顯著低于陽性對照組（P<0.05或P<0.01）；在致炎后9 d，各組大鼠的足跖再度明顯腫脹，并因遲發(fā)型超敏反應引起繼發(fā)性病變，表現(xiàn)為耳和尾部出現(xiàn)“關節(jié)炎”小結(jié)節(jié)等，但各給藥組大鼠的足跖腫脹度仍顯著低于空白組（P<0.05或P<0.01），且戰(zhàn)骨總黃酮提取物各劑量組大鼠的足跖腫脹度均顯著低于陽性對照組（P<0.05或P<0.01）。在致炎后15 d，戰(zhàn)骨總黃酮提取物高劑量組和陽性對照組大鼠足跖腫脹度顯著低于空白組（P<0.05），同時其他繼發(fā)性癥狀也明顯減輕，但戰(zhàn)骨總黃酮提取物中、低劑量組大鼠足跖腫脹度顯著高于陽性對照組（P<0.05）。各組大鼠致炎不同時間后的足跖腫脹度測定結(jié)果見表2。

3.2 鎮(zhèn)痛實驗結(jié)果

3.2.1 戰(zhàn)骨總黃酮提取物對乙酸引起小鼠扭體反應的影響結(jié)果 空白組小鼠在末次腹腔注射乙酸后，20 min內(nèi)的扭體次數(shù)為（38.00±3.27）次，陽性對照組和戰(zhàn)骨總黃酮提取物高、中劑量組小鼠20 min內(nèi)的扭體次數(shù)分別為（23.80±7.67）、（18.30±9.06）、（23.00±5.48）次，與空白組比較顯著減少（P<0.01）；戰(zhàn)骨總黃酮提取物低劑量組小鼠20 min的扭體次數(shù)為（34.40±6.13）次，與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。戰(zhàn)骨總黃酮提取物各劑量組小鼠20 min內(nèi)的扭體次數(shù)較陽性對照組差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3.2.2 戰(zhàn)骨總黃酮提取物對熱板刺激引起小鼠疼痛反應的影響結(jié)果 在給藥后30、60、90 min，各給藥組小鼠的疼痛抑制率較空白組均不同程度升高，其中戰(zhàn)骨總黃酮提取物高劑量組和陽性對照組小鼠在給藥后30 min的疼痛抑制率顯著升高（P<0.05或P<0.01），且戰(zhàn)骨總黃酮提取物高劑量組顯著高于陽性對照組（P<0.01）；戰(zhàn)骨總黃酮提取物高、中劑量組和陽性對照組小鼠在給藥后60 min的疼痛抑制率顯著升高（P<0.05或P<0.01），且戰(zhàn)骨總黃酮提取物高劑量組顯著高于陽性對照組（P<0.05）；各給藥組小鼠在給藥90 min的疼痛抑制率均顯著高于空白組（P<0.01），且戰(zhàn)骨總黃酮提取物高劑量組顯著高于陽性對照組（P<0.01）。給藥不同時間后各組小鼠的疼痛抑制率測定結(jié)果見表3。

3.2.3 戰(zhàn)骨總黃酮提取物對大鼠光熱甩尾反應的影響結(jié)果 各給藥組大鼠的可能最大鎮(zhèn)痛百分率較空白組均不同程度升高，其中戰(zhàn)骨總黃酮提取物高劑量組和陽性對照組大鼠差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）?？傸S酮提取物各劑量組大鼠的可能鎮(zhèn)痛百分率較陽性對照組差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠的可能最大鎮(zhèn)痛百分率測定結(jié)果見表4。

3.2.4 戰(zhàn)骨總黃酮提取物對小鼠鼠尾壓痛反應的影響結(jié)果 與空白組比較[痛閾提高值為（18.89±4.40） g]，戰(zhàn)骨總黃酮提取物高、中劑量組和陽性對照組小鼠的痛閾提高值[分別為（26.61±8.85）、（20.01±2.11）、（24.11±4.37） g]顯著升高（P<0.05），戰(zhàn)骨總黃酮提取物低劑量組小鼠的痛閾提高值[（19.47±3.96） g]差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。戰(zhàn)骨總黃酮提取物各劑量組小鼠的痛閾提高值與陽性對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

4 討論

戰(zhàn)骨的臨床用量約為15 g[1]，依據(jù)人體與動物給藥劑量換算方法，計算得出大鼠戰(zhàn)骨總黃酮提取物的給藥劑量應為 0.275 g/kg、小鼠為0.391 g/kg[13]。通常情況下，經(jīng)皮給藥制劑需要加入一定量的透皮吸收促進劑以提高藥物的透皮吸收，如果處方中不含有吸收促進劑，藥物則很難透過皮膚的角質(zhì)層進入皮下毛細血管。因此，考慮到無吸收促進劑時藥物的透皮吸收效果，本課題組將該劑量設為中劑量。

大多數(shù)中藥口服制劑均存在服用后溶出度低，吸收差，肝、腸首關效應以及生物利用度較低等問題，從而影響其治療的效果。經(jīng)皮給藥制劑相對來說存在一定的劑型優(yōu)勢，故本課題通過經(jīng)皮給藥的方式，設計2種經(jīng)典的抗炎實驗（二甲苯致炎實驗和弗氏完全佐劑致炎實驗）以及3種經(jīng)典的鎮(zhèn)痛實驗（乙酸致痛實驗、熱板致痛實驗和光熱甩尾實驗）[12，14-15]對廣西特色壯藥戰(zhàn)骨總黃酮提取物的抗炎、鎮(zhèn)痛活性進行研究，探討其經(jīng)皮給藥的可行性，以期能更好地發(fā)揮其臨床療效。經(jīng)皮給藥的藥效與皮膚透藥量有關。本研究結(jié)果顯示，中、低劑量戰(zhàn)骨總黃酮提取物在部分實驗中未表現(xiàn)出顯著活性，推測其在無吸收促進劑的情況下由于藥物量較小，使得有效成分難以透過皮膚，最終造成藥效不明顯；相比之下，高劑量戰(zhàn)骨總黃酮提取物的皮膚透過量明顯增加，這可能是其表現(xiàn)顯著抗炎、鎮(zhèn)痛活性的原因，這也說明了必要時經(jīng)皮給藥制劑應使用吸收促進劑來提高藥物的藥效。

本研究結(jié)果表明，戰(zhàn)骨總黃酮提取物經(jīng)皮給藥具有一定的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。因本研究是初步探討戰(zhàn)骨總黃酮提取物經(jīng)皮給藥的可行性，本課題組后期將對加入吸收促進劑后戰(zhàn)骨提取物的透皮效果進行進一步研究，比如加入戰(zhàn)骨提取的揮發(fā)油、氮酮、丙二醇、二甲基亞砜等，或常見的中藥促滲劑冰片、薄荷腦等[11]。

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（收稿日期：2017-12-01 修回日期：2018-05-11）

（編輯：林 靜）