藏藥麻花秦艽醇提物對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型小鼠滑膜組織中NF—κBp65表達的影響

賈娜 崔佳 文愛東

摘 要 目的：考察藏藥麻花秦艽醇提物（GSM）對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（CIA）模型小鼠滑膜組織中核轉(zhuǎn)錄因子κB p65（NF-κB p65）表達的影響，為闡明其抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的作用機制提供參考。方法：將40只小鼠隨機分為正常組、模型組、地塞米松組（陽性對照，0.25 mg/kg）和GSM低、高劑量組（25、50 mg/kg，以生藥量計），每組8只。除正常組外，其余各組小鼠均于尾根部多點皮內(nèi)注射雞Ⅱ型膠原制備CIA模型。自造模當(dāng)日起，給藥組小鼠每天灌胃相應(yīng)藥物1次，正常組和模型組小鼠灌胃等量生理鹽水，連續(xù)給藥28 d。給藥后7、14、21、28、35 d，測定各組小鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）；給藥結(jié)束后，測定各組小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測小鼠血清中白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平，蘇木精-伊紅染色后觀察小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)變化，并采用Western blot法檢測小鼠滑膜組織中NF-κB p65蛋白表達。結(jié)果：與正常組比較，模型組小鼠在給藥不同時間后的AI值、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、血清中炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）以及滑膜組織中NF-κB p65蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）；小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織出現(xiàn)細胞排列密集且紊亂、滑膜細胞數(shù)量增加、充血等病理學(xué)變化。與模型組比較，除GSM低劑量組小鼠在給藥7、14 d的AI值降低不顯著外，各給藥組小鼠其余指標(biāo)水平均顯著降低（P<0.05）；各給藥組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織的充血程度減輕、炎性細胞數(shù)量減少。結(jié)論：GSM可能通過降低血清中炎癥因子水平，抑制滑膜組織中NF-κB p65蛋白表達，進一步減輕滑膜炎癥而發(fā)揮其抗RA的作用。

關(guān)鍵詞 藏藥；麻花秦艽醇提物；膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎；小鼠；核轉(zhuǎn)錄因子κB p65

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of the ethanol extract of Tibetan medicine Gentiana straminea （GSM） on the expression of NF-κB p65 in synovial tissue of collagen-induced arthritis （CIA） model mice， and to provide a reference for elucidating the action mechanism of its anti-rheumatoid arthritis （RA）. METHODS： Totally 40 mice were randomly divided into normal group， model group， dexamethasone group （positive drug， 0.25 mg/kg） and GSM low-dose and high-dose groups （25， 50 mg/kg， calculated by crude drug）， with 8 mice in each group. Except for normal group， other groups were given intradermal injection of Chicken type Ⅱ collagen intracutaneously via tail to induce CIA model. After modeling， medication group was given relevant medicine intragastrically once a day， and normal group and model group were given same amount of normal saline intragastrically for consecutive 28 d. The arthritis index （AI） of mice were determined 7， 14， 28， 35 d after medication. After last medication， the spleen index and thymus index of mice were determined； ELISA was used to measure the serum levels of IL-1β， IL-6 and TNF-α； Pathological change of synovial tissue in ankle joint of mice was observed by HE staining； Western blot was used to detect the protein expression of NF-κB p65 in synovial tissue of mice. RESULTS： Compared with normal group， the levels of AI value after different medication time， and spleen index， thymus index， serum inflammatory factors （IL-1β， IL-6， TNF-α） and protein expression of NF-κB p65 in synovial tissue were increased significantly in model group （P<0.05）. Pathological changes of synovial tissue in mice were observed， such as dense and disorder cell arrangement， the increase of synovial cells， hyperemia. Compared with model group， decrease of AI was not significant in GSM low-dose group 7， 14 d after medication， and other indexes of medication groups were all decreased significantly （P<0.05）. The inflammatory cell hyperplasia and the number of inflammatory cells were decreased in medication groups. CONCLUSIONS： GSM can inhibit the protein expression of NF-κB p65 in synovial tissue and relieve synovial inflammation and play its role on the anti RA by reducing the levels of serum inflammatory factors.

KEYWORDS Tibetan medicine； Ethanol extract of Gentiana stramine； Collagen-induced arthritis； Mice； NF-κB p65

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性、對稱性、關(guān)節(jié)滑膜炎為特點的全身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫痛、軟骨破壞和關(guān)節(jié)強直畸形，使關(guān)節(jié)功能嚴重受損，以致勞動力喪失。RA的致殘率較高，嚴重影響了患者的身體健康。藏藥麻花秦艽（Gentiana straminea Maxim.）屬龍膽科龍膽屬植物[1]，分布于我國西藏各地以及青海、甘肅等高海拔地區(qū)，藏醫(yī)稱之為“吉解嘎?！保曰ㄈ胨?，具有清熱、舒筋止痛之功效，主要用于RA的治療[2]。據(jù)文獻報道，麻花秦艽醇提物（GSM）可減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的足腫脹，并可降低其異常升高的臟器指數(shù)[3]。本研究在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠模型，觀察GSM對CIA模型小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）和踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)的影響，并通過對小鼠血清及關(guān)節(jié)組織中生化指標(biāo)的檢測進一步探討其抗RA的分子機制，為GSM的藥物研發(fā)及臨床應(yīng)用提供更充分的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

TE612-L型電子天平（德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；5810R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Multiskan MK3型全自動酶標(biāo)儀（美國Thermo科技公司）；BX43-12P01型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會社）。

1.2 藥品與試劑

麻花秦艽購自青海西寧，經(jīng)西北大學(xué)胡正海教授鑒定為麻花秦艽的花，樣品存放于西北大學(xué)陜西省生物醫(yī)藥重點實驗室；醋酸地塞米松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：140008，規(guī)格：每片0.75 mg）；雞Ⅱ型膠原（美國Sigma公司，批號：200202）；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑（美國Chondrex公司，批號：均為F5881，純度：均為99%）；兔抗核轉(zhuǎn)錄因子κB p65（NF-κB p65）抗體（英國Abcam公司，批號：ab131485）；羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的免疫球蛋白G（lgG）二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：ZDR-5306）；兔抗p84N5抗體（內(nèi)參物，美國GeneTex公司，批號：C1C3）；小鼠白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國R&D公司，批號分別為：M1000B、M6000B、MTA00B）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

健康清潔級C57BL/6J小鼠40只，♂，10～14周齡，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（陜）2007-0007。購入后將小鼠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度為20～25 ℃、濕度為40%～60%，飼養(yǎng)期間小鼠自由攝食飲水。本研究所涉及的動物相關(guān)操作均在西京醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)下進行（倫理批準(zhǔn)號：XJYYLL-2014302）。

2 方法

2.1 GSM的制備

將陰干的麻花秦艽200 g粉碎，過20目篩，用少量75%甲醇拌勻并浸泡12 h，待其潤脹后用75%乙醇進行滲漉提取，薄層色譜（TLC）下檢視，直至薄層板上幾乎看不到斑點時停止?jié)B漉。合并提取液，減壓回收溶劑至無醇味，最后將提取液濃縮成浸膏狀，即得GSM（經(jīng)高效液相色譜法測定，提取物中龍膽苦苷含量為48.09%、落苷酸含量為14.63%、獐牙菜苷含量為9.18%、獐牙菜苦苷含量為12.42%）。將所制GSM密封，滅菌，于4 ℃冰箱中冷藏，備用。

2.2 CIA模型的建立

將雞Ⅱ型膠原溶解于0.1 mol/L的冰醋酸中，制成質(zhì)量濃度為4 mg/mL的溶液，于4 ℃放置過夜。將溶解的雞Ⅱ型膠原與弗氏完全佐劑等體積混合，冰浴中使用勻漿器充分乳化制成乳劑（將乳化好的乳劑滴至放有水的燒杯中不會擴散），全程無菌操作。免疫動物時，在小鼠尾根部多點皮內(nèi)注射0.1 mL乳劑?；A(chǔ)免疫后第14天，取同樣量的乳劑再加強注射1次，避開初次免疫部位[4]；同時，正常組小鼠注射等體積生理鹽水。從造模當(dāng)天開始觀察并記錄小鼠AI，7 d觀察記錄1次，共觀察5次。

2.3 分組與給藥

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為5組，每組8只，分別為正常組、模型組、地塞米松組（陽性對照，0.25 mg/kg）[5]和GSM低、高劑量組（25、50 mg/kg，參考文獻[5]并結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果綜合確定給藥劑量）。除正常組外，其余各組小鼠均按照“2.2”項下方法建立CIA模型，并從造模當(dāng)天開始灌胃相應(yīng)藥物，正常組和模型組小鼠灌胃等量生理鹽水，每天給藥1次，連續(xù)給藥28 d。

2.4 AI評估

采用5級評分法進行AI評估[6]：無紅腫為0分；小趾關(guān)節(jié)紅腫為1分；趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹為2分；踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹為3分；含踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹為4分。

2.5 血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平測定

給藥結(jié)束1周后，小鼠腹主動脈取血，然后將血液以3 000 r/min離心15 min，取上清，備用。分別按照相應(yīng)ELISA試劑盒操作說明測定血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

2.6 胸腺指數(shù)和脾指數(shù)測定

取血完成后，小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（65 mg/kg）處死。解剖小鼠摘取胸腺和脾，稱濕質(zhì)量，按公式計算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)：胸腺指數(shù)（脾指數(shù)）=胸腺（脾）質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×10。

2.7 踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)觀察

取各組小鼠右后踝關(guān)節(jié)組織，以4%多聚甲醛固定，10%乙二胺四乙酸脫鈣，常規(guī)脫水、石蠟包埋后，行5 μm切片，蘇木精-伊紅常規(guī)染色，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)改變。

2.8 踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NF-κB p65蛋白表達水平檢測

采用Western blot法進行測定。將小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織置于勻漿器中，冰上研磨提取組織總蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。取50 μg蛋白上樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（5%的濃縮膠恒壓80 V、25 min，15%的分離膠恒壓120 V、40 min），恒流150 A轉(zhuǎn)膜2 h，脫脂奶粉封閉2 h；加入NF-κB p65、β-actin（內(nèi)參物）一抗（1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜；然后用TBST緩沖液洗膜15 min，共3次；加入二抗（1 ∶ 1 200），室溫條件下孵育2 h；TBST緩沖液洗膜15 min，共3次；加入顯影液1 mL（1 ∶ 1），放入化學(xué)發(fā)光儀檢測。采用Quantity One軟件對顯影出的條帶進行灰度值分析，以NF-κB p65與β-actin條帶灰度值的比值表示NF-κB p65的相對表達水平。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 AI評估結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠的AI值顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠的AI值均有所降低，且地塞米松組和GSM高劑量組小鼠從給藥14 d開始、GSM低劑量組小鼠從給藥21 d開始的AI值顯著降低（P<0.05）。給藥不同時間后各組小鼠AI值測定結(jié)果見表1。

3.2 血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α水平均顯著降低（P<0.05）。各組小鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α水平測定結(jié)果見表2。

3.3 胸腺指數(shù)和脾指數(shù)測定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均顯著降低（P<0.05）。各組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)測定結(jié)果見表3。

3.4 踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)觀察結(jié)果

在光學(xué)顯微鏡下可見正常組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織排列整齊，未見充血、水腫、炎性細胞浸潤等現(xiàn)象，未見滑膜細胞增生及血管翳形成。與正常組比較，模型組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中細胞排列密集且凌亂，滑膜組織細胞數(shù)量較多，出現(xiàn)充血及大量炎性細胞，可觀察到淋巴細胞。與模型組比較，地塞米松組和GSM高劑量組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織充血及炎性細胞數(shù)量明顯減少，但GSM低劑量組小鼠滑膜組織病理變化不明顯。各組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)觀察結(jié)果見圖1。

3.5 踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NF-κB p65蛋白水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NF-κB p65蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NF-κB p65蛋白水平均顯著降低（P<0.05）。各組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NF- κB p65蛋白表達電泳圖見圖2，測定結(jié)果見表4。

4 討論

RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性自身免疫疾病，滑膜炎持久反復(fù)發(fā)作引起關(guān)節(jié)軟骨破壞。地塞米松為治療RA的臨床常用藥物，故本研究以其為陽性對照。NF-κB是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要信號通路，在RA滑膜炎的病理過程中起關(guān)鍵作用[7]。而NF-κB主要由p65和p50兩個亞單位組成，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)的細胞因子、炎癥分子以及各種受體和蛋白的表達。其中p50很少有其他序列，而p65則有250個氨基酸殘基的C-末端，內(nèi)含2～3個獨立的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)，并且p65的另一個重要功能是可與NF-κB的上游調(diào)節(jié)信號分子NF-κB抑制劑結(jié)合[8]。當(dāng)NF-κB被其上游分子激活后將由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核中，與相應(yīng)位點結(jié)合后啟動基質(zhì)金屬蛋白酶的轉(zhuǎn)錄，同時參與許多前炎癥遞質(zhì)分子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，包括細胞因子、黏附分子、趨化因子、炎癥因子（TNF-α、IL-1、IL-6）等，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞，介導(dǎo)滑膜炎癥反應(yīng)的發(fā)生[9]。研究表明，NF-κB活化后可升高IL-1β、TNF-α、IL-6等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄水平，同時NF-κB的活化又是許多炎癥介質(zhì)（如TNF-α、IL-1β等）表達增強的正反饋結(jié)果，導(dǎo)致RA炎癥反應(yīng)和結(jié)構(gòu)破壞得以維持與進展[10]。

麻花秦艽是龍膽科龍膽屬植物，有效成分主要為環(huán)烯醚萜苷類及黃酮類化合物，有多種藥理作用，藏醫(yī)用其治關(guān)節(jié)炎、肺病發(fā)燒、黃疸及二便不通等[11-12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GSM能夠抑制二甲苯致大鼠耳腫脹，在3種經(jīng)典致痛實驗（熱板法、甩尾法和醋酸扭體法）中具有顯著的鎮(zhèn)痛作用[5]。本研究進一步研究了GSM對CIA模型小鼠的改善作用及其機制。實驗結(jié)果顯示，GSM能夠降低CIA小鼠的AI值，改善CIA小鼠的踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化，抑制血清中炎癥因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）水平，降低關(guān)節(jié)滑膜組織中NF-κB p65的蛋白表達水平，從而減輕滑膜炎癥，發(fā)揮抗RA的療效。但是麻花秦艽中發(fā)揮作用的具體藥效成分仍有待進一步考察。

參考文獻

[ 1 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：253-254.

[ 2 ] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草：藏藥卷[S].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002：312.

[ 3 ] 趙勤，王樂樂，魏立鵬，等.麻花秦艽醇提物對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的影響[J].中藥藥理與臨床，2015，31（1）：145-147.

[ 4 ] JULIA JI，EGLE S，F(xiàn)IONA EM，et al. Protocol for the induction of arthritis in C57BL/6 mice[J]. Nat Protoc，2008，3（4）：612-619.

[ 5 ] JIA N，LI Y，WU Y，et al. Comparison of the anti-inflammatory and analgesic effects of Gentiana macrophylla Pall.and Gentiana straminea Maxim，and identification of their active constituents[J]. J Ethnopharmacol，2012，144（3）：638-645.

[ 6 ] 張麗，張一云，符洪，等.黎藥除濕祛風(fēng)湯對雞Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型大鼠的保護作用研究[J].中國藥房，2016，27（22）：3088-3090.

[ 7 ] OKAMOTO T. NF-kappaB and rheumatic diseases[J]. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets，2006，6（4）：359-372.

[ 8 ] HAYDEN MS，WEST AP，GHOSH S.NF-κB and the immune response[J]. Oncogene，2006，25（51）：6758-6780.

[ 9 ] 王潔，王亞南，陸妍，等.藤莓湯對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜PPARγ/NF-κB信號途徑的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2017，37（4）：458-463.

[10] 汪永忠，鄧龍飛，韓燕全，等.成纖維樣滑膜細胞原代培養(yǎng)及其在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療機制研究中的應(yīng)用進展[J].中國藥房，2016，27（7）：966-969.

[11] 楊永昌.藏藥志[S].西寧：青海人民出版社，1991：820.

[12] 張莉，黨軍，梅麗娟，等.藏藥麻花秦艽化學(xué)成分研究[J].中草藥，2016，39（1）：103-106.

（收稿日期：2017-12-20 修回日期：2018-03-19）

（編輯：林 靜）