基于“成分—靶點—通路”網(wǎng)絡(luò)模式探討淫羊藿治療骨性關(guān)節(jié)炎的分子機制

駱帝 許波 李剛 梁學(xué)振 蓋帥帥 李嘉程 閻博昭 夏聰敏

摘 要 目的：基于“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)模式探討淫羊藿治療骨性關(guān)節(jié)炎可能的分子機制。方法：通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺，篩選和預(yù)測淫羊藿可能的入血活性成分[以藥物動力學(xué)參數(shù)中的口服藥物生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18進行篩選]和靶點，挖掘疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫中骨性關(guān)節(jié)炎的作用靶點，采用拓?fù)浞治龉ぞ吆Y選淫羊藿治療骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵靶點，采用ClueGo插件分析其可能的分子機制。結(jié)果：檢索出淫羊藿相關(guān)成分130個，根據(jù)OB和DL值篩選出23個活性成分，同時預(yù)測出102個可能的作用靶點，構(gòu)建了“入血活性成分-疾病靶點”相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖；通過疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫檢索出168個骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點，拓?fù)浞治龊Y選出185個關(guān)鍵節(jié)點；ClueGo分析結(jié)果顯示，淫羊藿作用于骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵節(jié)點涉及的信號通路主要被富集在細(xì)胞周期、炎癥及癌癥相關(guān)等68條信號通路中；其可能的控制疾病進展的作用機制不僅包括直接參與軟骨細(xì)胞的增殖、凋亡及分化，調(diào)節(jié)骨代謝平衡，還可以通過調(diào)節(jié)炎癥、免疫等干預(yù)和影響骨與軟骨微環(huán)境。結(jié)論：淫羊藿治療骨性關(guān)節(jié)炎具有多系統(tǒng)、多成分、多靶點的特點；預(yù)測、篩選出的機制與目前治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機制相符合。

關(guān)鍵詞 淫羊藿；骨性關(guān)節(jié)炎；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；靶點；分子機制；信號通路

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the potential molecular mechanism of Epimedium brevicornu in the treatment of osteoarthritis based on “ingredient-target-pathway” network mode. METHODS： The potential active components in blood [pharmacokinetic parameters as oral drug bioavailability （OB）≥30% and drug-likeness （DL）≥0.18] and target spots of E. brevicornu were screened and predicted by TCM system pharmacology database and analysis platform. The target spots of osteoarthritis were excavated from disease-related database， and key target spots of E. brevicornu in the treatment of osteoarthritis were screened by Topology analysis. The potential molecular mechanism of it was analyzed by using ClueGo analysis. RESULTS： A total of 130 corresponding compounds of E. brevicornu were retrieved in the study； 23 active compounds were screened according to OB and DL value， which predicted 102 potential target spots， the relationship networks of “the active components in blood-disease target” was structured. A total of 168 targets spots related to osteoarthritis were retrieved from disease-related database， and 185 key nodes were screened out by topological analysis. ClueGo analysis showed that signaling pathways involved in the action of E. brevicornu on osteoarthritis were mainly enriched in 68 signaling pathways such as cell cycle， inflammation and cancer related signaling pathways. The potential mechanism is that control the progress of disease to participate in the proliferation， apoptosis and differentiation of cartilage cells directly， regulate bone metabolism balance， and regulate the inflammation system， immune system and etc. to interfere with and influence bone and cartilage microenvironment. CONCLUSIONS： For osteoarthritis， E. brevicornu has the characteristics of multiple systems， multiple targets and multiple components. It is consistent with the current mechanism of osteoarthritis treatment.

KEYWORDS Epimedium brevicornu； Osteoarthritis； Network pharmacology； Target spot； Molecular mechanisms； Signaling pathway

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis）是一種由機械性和生物性等因素引起的，以關(guān)節(jié)軟骨變性、骨質(zhì)丟失、關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成及軟骨下骨質(zhì)增生為特征的慢性、漸進性、退行性關(guān)節(jié)疾病[1]。流行病學(xué)研究表明，全世界 50 歲以上人群約有50%患有骨性關(guān)節(jié)炎，而我國 75 歲以上人群的骨性關(guān)節(jié)炎患病率高達80%，其致殘率可達53%[2]。目前，骨性關(guān)節(jié)炎的非手術(shù)治療手段有很多[3]，包括藥物干預(yù)、飲食調(diào)控和運動療法等。采用化學(xué)藥治療時藥物通常分為非特異性藥物和特異性藥物兩類，可顯著緩解患者的臨床癥狀，但這些藥物的不良反應(yīng)和耐受性限制了其應(yīng)用，而且上述藥物靶向性過于單一，因此，亟需探尋新的思路解決上述問題。傳統(tǒng)中醫(yī)憑借其“簡、便、廉、效”的優(yōu)勢在防治骨性關(guān)節(jié)炎方面可能具有其獨有的優(yōu)勢和廣闊的發(fā)展前景。

淫羊藿始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歸肝、腎經(jīng)，可補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕，用于陽痿遺精、筋骨痿軟、風(fēng)濕痹痛及麻木拘攣等[4]。文獻研究表明[5]，淫羊藿對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞有增殖促進作用，在治療骨性關(guān)節(jié)炎方面可發(fā)揮重要作用，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機制至今尚不明確。因此，分析淫羊藿的有效活性成分，探討其可能的作用機制，對淫羊藿治療作用科學(xué)內(nèi)涵的闡述和臨床應(yīng)用的推廣具有重要意義。但考慮到中藥的多成分、多靶點、多通路特點，單純依靠現(xiàn)有的技術(shù)手段往往難以科學(xué)、有效、全面地闡釋中藥的作用機制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于藥物系統(tǒng)和生物系統(tǒng)的作用模式而提出的一種藥物設(shè)計新方法[6]，其為中藥潛在活性成分和作用靶點的進一步研究提供了有效的策略。本研究基于“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)模型，科學(xué)篩選和系統(tǒng)預(yù)測淫羊藿入血活性成分干預(yù)骨性關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點和信號通路，為深入探討淫羊藿治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape （3.2.1 版）（http：//www.cytoscape.org）；中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）；治療靶點數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database，TTD）（http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）；藥物銀行（DrugBank）（https：//www.drugbank.ca/）；在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（http：//www.omim.org/）；遺傳關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫（The Genetic Association Database，GAD）（https：//geneticassociationdb.nih.gov/）；藥物遺傳學(xué)和藥物基因組學(xué)知識庫（Pharmacogenetics and Pharmacogenomics Knowledge Base，PharmGKB）（https：//www.pharmgkb.org/）；蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（UniProt）（http：//www.uniprot.org/）；京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）（http：//www.genome.jp/kegg/）。

1.2 研究流程

本研究首先通過藥物動力學(xué)（Absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME）參數(shù)篩選出淫羊藿入血活性成分，隨后利用TCMSP數(shù)據(jù)庫的靶點預(yù)測模型預(yù)測出其可能作用的靶點；再由疾病靶點數(shù)據(jù)庫篩選出骨性關(guān)節(jié)炎相應(yīng)靶點；然后，使用相關(guān)軟件繪制出蛋白質(zhì)間相互作用關(guān)系，抽取交集并利用相關(guān)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)進行拓?fù)浞治?，并對最終得到的關(guān)鍵靶點進行通路富集分析，以嘗試分析淫羊藿治療骨性關(guān)節(jié)炎的分子機制，分析流程圖見圖1。

1.3 淫羊藿入血活性成分篩選與ADME參數(shù)分析

檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫中淫羊藿所有成分?jǐn)?shù)據(jù)，根據(jù)成分的ADME參數(shù)進行入血活性成分的篩選[7-9]，其中篩選條件[10]為藥物口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18。

1.4 淫羊藿作用靶點預(yù)測及“入血活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫靶點預(yù)測模型對上述入血活性成分的作用靶點進行預(yù)測，通過Cytoscape軟件構(gòu)建“入血活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，其中分子、靶蛋白用“節(jié)點”（Node）表示，成分與靶點之間的關(guān)系用“邊”（Edge）表示；采用Network analyzer軟件分析網(wǎng)絡(luò)特征，明確淫羊藿中起重要作用的入血活性成分和作用靶點，并查閱文獻分析其相互作用關(guān)系。

1.5 骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病靶點檢索分析

以“Osteoarthritis”作為關(guān)鍵詞檢索TTD、DrugBank、OMIM、GAD、PharmGKB等與疾病靶點相關(guān)的數(shù)據(jù)庫中與骨性關(guān)節(jié)炎疾病已知的相關(guān)靶點。

1.6 淫羊藿治療骨性關(guān)節(jié)炎的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點篩選分析

機體的內(nèi)在調(diào)控往往不是僅僅由單一信號通路支配的，而是由極其復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的；不同的靶點和信號通路之間會存在不同程度的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，故藥物作用機制除考慮與成分靶點的直接結(jié)合外，還應(yīng)考慮直接調(diào)控靶點與間接調(diào)控其他靶點相結(jié)合的調(diào)控方式。構(gòu)建與挖掘蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系（Protein-Protein Interaction，PPI）數(shù)據(jù)為尋找靶點的直接、間接調(diào)控作用關(guān)系提供了可能。

本研究采用的Cytoscape軟件中BisoGenet插件是由Biological General Repository for Interaction Datasets（BioGRID）、Biomolecular Interaction Network Database（BIND）、Molecular Inter-action Database（MINT）、Human Protein Reference Database（HPRD）、Database of Interacting Proteins（DIP）和Biological General Repository for Interaction Datasets（GRID）等6種蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫構(gòu)成的，用以繪制和分析上述獲得的入血活性成分及疾病靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)。

利用Cytoscape軟件抽取上述繪制的2個網(wǎng)絡(luò)圖的交集網(wǎng)絡(luò)，通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾寮﨏ytoNCA[11]，借助度中心性（Degree centrality，DC）、介度中心性（Betweenness centrality，BC）、接近中心性（Closeness centrality ，CC）、特征向量中心性（Eigenvector centrality，EC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（Network centrality，NC）和局部邊連通性（Local average connectivity，LAC）等指標(biāo)篩選網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因，以盡可能在網(wǎng)絡(luò)中獲得更多節(jié)點的傳遞信息和更高的節(jié)點信息傳遞效率，充分發(fā)揮其在網(wǎng)絡(luò)中重要的作用。其中，篩選標(biāo)準(zhǔn)為DC值大于所有節(jié)點DC值中位數(shù)2倍的節(jié)點和其他幾個指標(biāo)大于所有節(jié)點中位數(shù)的節(jié)點。

1.7 Pathway 富集分析

采用通路富集分析插件ClueGO[12]富集分析上述獲得的關(guān)鍵靶點，以節(jié)點和餅狀圖的形式展現(xiàn)信號通路富集結(jié)果，進一步分析淫羊藿治療骨性關(guān)節(jié)炎可能的作用機制。其中，同一類型的信號通路用同種圖形的節(jié)點代表，信號通路的顯著程度用節(jié)點的大小代表，信號通路顯著程度越高節(jié)點越大，說明該通路的重要性越高。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿入血活性成分篩選與ADME參數(shù)分析

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索出淫羊藿的相關(guān)成分130個，其中滿足OB≥30%的成分共有45個，滿足DL≥0.18的成分共有91個。根據(jù)ADME參數(shù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，即同時滿足OB≥30%與DL≥0.18的成分共有23個，即篩選出淫羊藿中23個入血活性成分。

2.2 淫羊藿作用靶點預(yù)測及“入血活性成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫靶點預(yù)測模型，預(yù)測獲得23個上述入血活性成分的作用靶點102個；利用Cytoscape軟件繪制入血活性成分與作用靶點關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淫羊藿的入血活性成分與作用靶點存在217個不同程度的相互關(guān)系；在上述23個成分中，最終得到與靶點存在相互作用關(guān)系的入血活性成分包括茯苓酯、槲皮素等9個化學(xué)成分，根據(jù)不同靶點與成分對應(yīng)關(guān)系數(shù)目分別進行分類展示。靶點對應(yīng)的成分越多，提示該靶點相對重要性越高。淫羊藿“入血活性成分-疾病靶點” 相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。

2.3 與骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)疾病靶點的檢索分析

通過檢索TTD、DrugBank、OMIM、GAD、PharmGKB 等數(shù)據(jù)庫分別獲得35、1、61、97、2個靶點，刪除重復(fù)靶點以納入168個與骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的靶點。

2.4 淫羊藿治療骨性關(guān)節(jié)炎的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點篩選分析

2.4.1 淫羊藿治療骨性關(guān)節(jié)炎的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 通過BisoGenet工具構(gòu)建淫羊藿入血活性成分的作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)有6 134個與其產(chǎn)生直接或間接作用的靶點和138 994條靶點與靶點之間的相互關(guān)系；與此同時，繪制與骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)有 4 101個與其直接或者間接相關(guān)的靶點和97 706條個靶點與靶點之間的相互關(guān)系。

2.4.2 淫羊藿治療骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵靶點篩選分析 通過Cytoscape軟件抽取上述繪制的2個PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的交集網(wǎng)絡(luò)，采用CytoNCA拓?fù)鋵傩院Y選獲得185個關(guān)鍵節(jié)點。篩選策略示意圖見圖3。

2.5 Pathway 富集分析

通過ClueGO插件對上述185個關(guān)鍵節(jié)點進行Pathway富集分析發(fā)現(xiàn)，淫羊藿作用于骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵節(jié)點涉及的信號通路主要與細(xì)胞周期、炎癥及癌癥等的68條信號通路相關(guān)，主要包括以下幾部分：（1）細(xì)胞周期相關(guān)通路23條：Wnt、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β、FoxO、低氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Notch、DNA復(fù)制、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、粘合連接及凋亡等；（2）炎癥相關(guān)通路18條：核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB信號通路、白細(xì)胞介素（IL）-17信號通路、B細(xì)胞抗原受體信號通路及T細(xì)胞抗原受體等；（3）癌癥相關(guān)信號通路14條：癌癥中轉(zhuǎn)錄失調(diào)、甲狀腺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌、胰腺癌及膀胱癌等；（4）其他相關(guān)信號通路13條：甲狀腺激素、神經(jīng)營養(yǎng)因子、乙型肝炎、丙型肝炎及甲型流感等。淫羊藿治療骨性關(guān)節(jié)炎信號通路富集分析情況見圖4。

3 討論

中醫(yī)學(xué)中沒有骨性關(guān)節(jié)炎病名，依據(jù)其臨床表現(xiàn)，屬于“骨痹”范疇，其基本病機為經(jīng)脈瘀阻、腎精虧虛。腎虛是發(fā)病之根本，加之氣滯、血瘀、痰凝等因素貫穿始終，腎虛為本，血瘀為標(biāo)，病程較長，遷延不愈[13]?！端貑枴の迮K生成篇》曰：“骨痹不已，復(fù)感于邪，內(nèi)舍于腎”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“痹者，閉也”，閉阻不通，則發(fā)疼痛，即“不通則痛”?！侗孀C錄》云：“內(nèi)治之法，必須活血祛瘀為先，血不活則瘀不能去”?！夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》言：“補腎之藥，實兼開瘀血之藥”。故治療本病應(yīng)以補腎為本，配合活血化瘀藥物，從而達到標(biāo)本兼治的目的[14]。

淫羊藿又稱“三枝九葉草”，屬《神農(nóng)本草經(jīng)》中品行列，具有補精壯體的作用，在治療骨性關(guān)節(jié)炎方面具有較好的療效[15]。本研究通過篩選獲得淫羊藿中入血的活性成分23個，并在此基礎(chǔ)上挖掘出102個可能的靶點和217個相互關(guān)系?！叭胙钚猿煞?疾病靶點”相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖分析顯示，木犀草素、槲皮素、谷甾醇、山奈酚等有效成分能同時作用于多個靶點，而過氧化物酶體增生因子激活受體（PPARG）、雌激素受體（ESR1）、細(xì)胞分裂蛋白激酶（CDK1）等靶點也能與多個成分形成對應(yīng)關(guān)系?；谏鲜鼋Y(jié)果可知，淫羊藿的有效成分之間存在協(xié)同關(guān)系，其調(diào)控的靶點也在疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

從通路富集結(jié)果分析可知，淫羊藿主要通過影響細(xì)胞周期、炎癥及癌癥相關(guān)等通路而發(fā)揮治療骨性關(guān)節(jié)炎作用。（1）細(xì)胞周期相關(guān)通路23條。如Wnt、TGF-β、FoxO、HIF-1α、MAPK等，其中Wnt信號通路和TGF-β信號通路均能促進間充質(zhì)干細(xì)胞的更新，在軟骨細(xì)胞的增殖、分化中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[16-17]；而MAPK信號通路可受到生長因子、細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素等多種信號分子刺激后發(fā)生磷酸化而影響細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡及應(yīng)激反應(yīng)等生理過程[18-19]。（2）炎癥相關(guān)通路18條。骨性關(guān)節(jié)炎是在多種因素共同作用下的具有炎癥特性的臨床疾病，關(guān)節(jié)軟骨的退變既是其啟動因素，又是其主要病理特征，可激活多種炎癥反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，故調(diào)控其病變周圍的炎癥環(huán)境對于疾病的轉(zhuǎn)歸有著重要意義。其中，NF-κB信號通路及IL-17信號通路與炎癥因子的產(chǎn)生密切相關(guān)，參與多種因子的調(diào)控作用，進而影響骨性關(guān)節(jié)炎的重要進程[20-21] ，B細(xì)胞抗原受體信號通路的激活往往通過復(fù)雜的信號傳遞級聯(lián)反應(yīng)影響細(xì)胞代謝、基因表達和細(xì)胞骨架組織等過程[22]。T細(xì)胞抗原受體信號通路直接調(diào)節(jié)機體免疫而發(fā)揮直接殺傷靶細(xì)胞、參加免疫應(yīng)答及產(chǎn)生細(xì)胞因子等多種生物學(xué)功能[23]。（3）癌癥相關(guān)信號通路14條。癌癥中轉(zhuǎn)錄失調(diào)、甲狀腺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌等癌癥相關(guān)信號通路也被顯著富集，說明疾病之間的調(diào)控機制存在相互聯(lián)系、相互影響和相互交叉的關(guān)系[24]。（4）其他相關(guān)信號通路13條。體內(nèi)代謝之間是相互作用、相互聯(lián)系的，通過全身其他系統(tǒng)，如內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多種代謝可以間接影響或干預(yù)骨微環(huán)境。所以，在淫羊藿作用靶點網(wǎng)絡(luò)集群中還覆蓋了甲狀腺激素、神經(jīng)營養(yǎng)因子、乙型肝炎、丙型肝炎及甲型流感等信號通路。

綜上所述，淫羊藿作用于骨性關(guān)節(jié)炎的各作用通路之間相互聯(lián)系，既存在相互協(xié)同的關(guān)系又存在相互拮抗的關(guān)系，故針對骨性關(guān)節(jié)炎的治療不僅要從局部關(guān)鍵通路入手，還應(yīng)考慮疾病病因、所處機體環(huán)境的差異進行多靶點、多系統(tǒng)干預(yù)，與傳統(tǒng)中醫(yī)“治病求本、標(biāo)本兼治”的治療特點相一致，也進一步說明了中藥多靶點、多方面及多系統(tǒng)干預(yù)的可行性和優(yōu)勢?；凇俺煞?靶點-通路”的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果能有效地揭示淫羊藿治療骨性關(guān)節(jié)炎可能的活性成分及作用機制，為后續(xù)實驗設(shè)計的優(yōu)化和機制的進一步探討等提供了強有力的理論依據(jù)；同時，也為中藥及其復(fù)方針對某種特定疾病的機制研究提供了思路和方法。

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（收稿日期：2017-11-15 修回日期：2018-02-09）

（編輯：劉 萍）