Mindin蛋白在經(jīng)聚乙二醇干擾素α-2b治療的慢性乙型肝炎中的動態(tài)變化及意義

王怡愷，吳鳳萍，劉晨瑞，郝 苗，呂莎莎，張苗苗，黨雙鎖，張 欣

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院感染科，西安 710004

Mindin是一種名為Mindin/F-spondin的細胞外基質(zhì)蛋白家族成員［1］，其與胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育［2-3］、卵巢癌［4］、前列腺癌［5-6］、消化系統(tǒng)腫瘤［7-9］、糖尿病腎?。?0-11］、心肌?。?2-13］、腸炎［14］、動脈粥樣硬化［13，15］等多種疾病有一定相關(guān)性。作為一種模式識別分子，Mindin 可直接與細菌結(jié)合并促進清除病毒和細菌［16］。大量研究［17-23］證明細胞外基質(zhì)蛋白，如層粘連蛋白、血小板反應(yīng)素和纖維連接蛋白，作為整合素配體在體外和體內(nèi)促進中性粒細胞和巨噬細胞的黏附和遷移。Sun等［1］開展的體內(nèi)及體外實驗中顯示，經(jīng)缺血/再灌注誘導(dǎo)后Mindin 均能夠引起炎癥細胞因子及趨化因子的釋放，從而促進炎癥反應(yīng)。筆者前期通過測量CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠模型中的Mindin 蛋白表達，推測可能是損傷因素CCl4誘發(fā)某些危險信號介導(dǎo)了Mindin 的下調(diào)，從而誘發(fā)急性肝損傷的進展［24］。此外在小鼠肝臟缺血/再灌注［1］、非酒精性脂肪肝模型［25］中，Mindin的表達均有顯著變化。所以Mindin蛋白在肝病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程可能存在關(guān)鍵作用。因此，本實驗旨在通過觀測Mindin 蛋白在慢性乙型肝炎（CHB）應(yīng)用聚乙二醇干擾素α-2b（PEG-IFNα-2b）抗病毒治療過程中的動態(tài)表達，以探求Mindin蛋白在CHB病情發(fā)展中所起的作用，為CHB的治療和預(yù)后改善提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取于本院行PEG-IFNα-2b 治療的CHB患者29例，男性15例，女性14例；年齡20～60歲，平均（37.7±9.8）歲。診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》［26］診斷標準。納入標準：（1）年齡18～65歲；（2）HBsAg 陽性超過6 個月。排除標準：（1）合并嚴重心、腦、肺、腎、血液系統(tǒng)等原發(fā)性疾病；（2）伴有甲狀腺疾病、視網(wǎng)膜病、銀屑病、神經(jīng)性耳聾、精神病或有精神疾病史；（3）失代償期肝硬化或腫瘤患者；（4）有酗酒、吸毒史或未能控制的癲癇、糖尿病、高血壓和自身免疫性疾病；（5）合并其他嗜肝病毒感染和/或HIV 感染；（6）妊娠或哺乳期婦女?；颊咧斡臉藴剩海?）血清HBsAg 和HBV DNA 持續(xù)檢測不到；（2）HBeAg 陰轉(zhuǎn)；（3）伴或不伴HBsAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換［27］；不滿足上述標準的患者被納入未治愈組。

1.2 研究方法 入組的CHB 患者接受PEG-IFNα-2b（180 μg/次，皮下注射，1 次/周；廈門特寶生物工程股份有限公司）治療。入組患者于治療基線、12周、24周檢測血常規(guī)、肝功能、乙型肝炎標志物定量和Mindin 蛋白含量。使用美國雅培公司生產(chǎn)的Architecti2000 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑檢測血清HBV標志物；使用上海科華生物工程股份有限公司生產(chǎn)的奧林巴斯AU2700生化儀檢測肝功能。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，兩組間比較采用成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，同組內(nèi)不同時間段間的比較采用重復(fù)測量資料的方差分析；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25～P75）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。采用Spearman 相關(guān)性分析對Mindin蛋白與HBsAg、ALT、AST的相關(guān)性進行分析。多元線性回歸分析探討HBsAg、ALT 水平對Mindin蛋白的影響。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 29 例患者中治愈12 例，未治愈17 例。未治愈組與治愈組間HBsAg、抗-HBe、Alb和白蛋白/球蛋白比值比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）（表1）。治愈組、未治愈組和對照組（以11 名健康人基線Mindin蛋白含量作為對照，男性5例，女性6例）所測基線Mindin水平分別為（223.7±68.8）pg/mL、（222.4±66.5）pg/mL和（235.2±54.4）pg/mL，三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.87）（圖1）。

表1 患者基線和人口統(tǒng)計學(xué)資料Table 1 Baseline and demographic data of the patients

圖1 三組間基線Mindin水平比較Figure 1 Comparison of baseline Mindin levels among cured，uncured，and healthy controls

2.2 治愈組和未治愈組不同時間點Mindin 與轉(zhuǎn)氨酶、HBsAg 的動態(tài)變化 HBsAg：治愈組HBsAg 水平逐漸下降，組內(nèi)各時間點與基線時比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.01）；兩組間基線、12 周和24 周比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）。ALT：治愈組ALT 水平先升后降，12 周時與基線比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；未治愈組ALT水平則逐步上升，24周時與基線比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩組間24 周時比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.012）。AST：治愈組AST 水平先升后降，組內(nèi)各時間點與基線比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.01）；未治愈組組內(nèi)各時間點與基線時比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）。兩組間24 周時比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.006）。Mindin 蛋白：治愈組Mindin 蛋白水平呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，24周時與基線時比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；24 周時治愈組Mindin 蛋白水平顯著高于未治愈組（P=0.019）（圖2，表2）。

表2 HBsAg、轉(zhuǎn)氨酶和Mindin基線、12周和24周的動態(tài)變化Table 2 Dynamic changes in HBsAg，transaminase，and Mindin at baseline，12 weeks，and 24 weeks

圖2 HBsAg、轉(zhuǎn)氨酶和Mindin的動態(tài)變化Figure 2 Dynamic changes in HBsAg，transaminase，and Mindin

2.3 血清Mindin 蛋白與HBsAg、ALT 和AST 水平的相關(guān)性分析 治愈組各時間點CHB 患者血清Mindin 蛋白水平與HBsAg、ALT 和AST 水平均未有顯著相關(guān)性（P值均＞0.05）。未治愈組12周時血清Mindin蛋白水平與ALT呈現(xiàn)出較強的直線相關(guān)性（r=0.760 8，P＜0.05）。

2.4 血清Mindin 蛋白與HBsAg、ALT 和AST 水平的回歸分析 采用多元線性回歸分析探討未治愈組12 周HBsAg、ALT 和AST 水平對Mindin 蛋白的影響，結(jié)果顯示多元線性回歸方程具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.695，P=0.027），各個自變量的偏回歸系數(shù)及95%CI如表3所示。

表3 多元線性回歸分析Table 3 Multiple linear regression analysis

3 討論

乙型肝炎的治療過程中要克服高水平的病毒復(fù)制，通常需要強有力的細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［28］。目前，IFN和PEG-IFN 已經(jīng)廣泛應(yīng)用于乙型肝炎的治療過程中。IFN 可與免疫細胞結(jié)合，從而觸發(fā)包括主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類抗原表達，效應(yīng)細胞激活以及與細胞因子級聯(lián)的復(fù)雜相互作用［29-30］；作為其免疫調(diào)節(jié)活性的一部分，IFN 還刺激輔助性T 淋巴細胞（Th1 型細胞）的產(chǎn)生，并減少Th2 抑制細胞的產(chǎn)生。這些協(xié)同作用的結(jié)果是誘導(dǎo)感染細胞中的抗病毒狀態(tài)，從而直接抑制病毒復(fù)制并通過IFN 相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)刺激增強宿主的特異性抗病毒免疫反應(yīng)（例如激活巨噬細胞和自然殺傷細胞等效應(yīng)細胞）［31］。另外，IFN 可以抑制病毒RNA 前基因組包裝到核心顆粒中，并且增強了HBsAg 在肝細胞上的表達［32］。最近的研究同樣表明，PEG-IFN 還可能通過抗病毒細胞因子對核cccDNA 小染色體的表觀遺傳調(diào)控［33］或誘導(dǎo)核HBV cccDNA 的特異性非肝毒性降解而發(fā)揮相應(yīng)的功效［34］。因此，IFN 主要通過誘導(dǎo)機體發(fā)生抗病毒免疫反應(yīng)，從而清除病毒，而且抗病毒免疫應(yīng)答主要由細胞毒性T淋巴細胞介導(dǎo)［35-36］。故T淋巴細胞的啟動對于機體的抗病毒免疫反應(yīng)尤為重要。Mindin 蛋白作為模式識別分子和整合素配體可以啟動T 淋巴細胞，Li 等［37］研究表明T 淋巴細胞的有效啟動依賴于Mindin蛋白。因此可進一步推斷，高水平的Mindin 蛋白對于促進HBV的清除和疾病的康復(fù)發(fā)揮著重要作用。

本研究通過對治愈組與未治愈組Mindin蛋白水平的變化進行觀察，發(fā)現(xiàn)治愈組24周Mindin蛋白含量與基線相比顯著提高（P＜0.05）。然而未治愈組各時間點與基線相比，Mindin 蛋白水平均無顯著性差異（P值均＞0.05）。組間比較同樣發(fā)現(xiàn)，24周時治愈組Mindin 蛋白水平顯著高于未治愈組（P=0.019）。因此，兩組間Mindin 蛋白水平變化的差異，尤其是24 周Mindin 蛋白水平的變化可能是預(yù)測患者臨床治愈的重要因素，Mindin 蛋白對于促進HBV的清除起到了重要作用。

進一步分析Mindin 蛋白與其他指標的相關(guān)性，結(jié)果顯示，治愈組患者Mindin 蛋白水平與其他指標均無相關(guān)性，而未治愈組Mindin蛋白水平與ALT 水平呈現(xiàn)出較強的直線相關(guān)性。ALT 水平可反映肝臟的炎癥水平，因此Mindin蛋白與其存在的正相關(guān)性也反映了其與肝臟炎癥程度密切相關(guān)。線性回歸模型結(jié)果支持ALT 水平與Mindin 蛋白水平存在線性關(guān)系（P=0.027）。T 淋巴細胞的啟動與聚集同時也促進了肝臟的免疫病理學(xué)損傷［38］。乙型肝炎發(fā)生的肝損傷并不是HBV 直接對肝細胞產(chǎn)生破壞，而是機體自身的免疫系統(tǒng)在清除潛伏在肝細胞內(nèi)的HBV時，對自身肝細胞產(chǎn)生損傷的結(jié)果［39］。肝細胞的損傷可以導(dǎo)致血清轉(zhuǎn)氨酶的升高，這一病毒學(xué)反應(yīng)十分重要［28］。在IFN或PEG-IFN治療乙型肝炎的過程中可發(fā)生轉(zhuǎn)氨酶水平的明顯升高。本研究中，治愈組ALT 水平先升后降，而未治愈組ALT 水平呈逐步上升趨勢。治愈組12 周ALT 水平較基線顯著上升（P＜0.05）；未治愈組12 周ALT 水平與基線相比并無顯著差異（P=0.295），而24周時較基線顯著提高（P＜0.05）。因此，ALT 高峰的推遲也從一定程度上解釋了患者療效不佳。一部分原因可能是因為該部分患者的免疫系統(tǒng)并未在早期激活，從而導(dǎo)致了應(yīng)答不佳。

綜上所述，Mindin 蛋白作為免疫系統(tǒng)的重要增強因子，通過啟動T 淋巴細胞在PEG-IFNα-2b 治療CHB 的過程中起到了重要作用。目前，對于Mindin 蛋白的作用機制和主要的生化反應(yīng)途徑仍不清楚，希望本研究可以拋磚引玉，期待未來對于Mindin 蛋白有更加深入的研究，為CHB的治療和預(yù)后判斷提供新的指標。

倫理學(xué)聲明：本研究方案由西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會審批，批號為2018033。所有研究對象入組前均簽署了書面知情同意書。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：王怡愷、張欣負責(zé)課題設(shè)計，資料匯總分析，撰寫論文；吳鳳萍、劉晨瑞、郝苗參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；呂莎莎、張苗苗負責(zé)數(shù)據(jù)分析和整理；黨雙鎖、張欣負責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。