膠體金免疫層析法快速定量檢測糙米中重金屬離子鉛

劉美辰　路宏博　趙小旭等

[摘要]本研究建立了快速定量檢測糙米中重金屬離子鉛的膠體金免疫層析試紙條分析方法。通過一系列的實驗研究了該方法的靈敏度、重復(fù)性和特異性。結(jié)果表明用免疫膠體金法測定糙米中鉛的檢出限為0.041mg/kg，定量限為0.097mg/kg，方法重現(xiàn)性較好，使用膠體金免疫層析法和原子吸收光譜法同時檢測加標(biāo)樣品，結(jié)果一致。因此，該方法適用于糙米中重金屬離子鉛的快速定量檢測。

[關(guān)鍵詞]鉛；膠體金免疫層析法；乳制品

中圖分類號：S511 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20180213

在自然情況下，土壤中重金屬含量較低，一般情況下不會對人體及生態(tài)環(huán)境造成很大的危害。但是，隨著我國工業(yè)的發(fā)展，固體廢棄物不斷增加，河流污染嚴(yán)重，同時農(nóng)業(yè)化肥和農(nóng)藥的大量使用也加劇了重金屬在土壤中的大量累積。目前我國耕地重金屬污染嚴(yán)重，被污染的耕地面積也在不斷增加。鉛是受污染糧食中的有毒重金屬之一，對人的神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓造血機能、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等都有明顯毒害作用且具有積累性，重金屬鉛能與人體中多種酶結(jié)合進而干擾人體多方面的生理活動。當(dāng)人體中鉛含量升高時，會破壞血紅蛋白的合成，造成貧血、血壓增高、腎損傷，造成孕婦流產(chǎn)和墮胎，破壞神經(jīng)中樞，影響腦發(fā)育、影響生育能力，造成小孩發(fā)育遲緩和行為沖動。糧食作為人們飲食的主要食物來源，其安全性對于國民的健康至關(guān)重要。

目前常見的重金屬離子鉛的檢測方法主要是石墨爐原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法等，這些方法需要費用高昂的大型儀器設(shè)備、專門的實驗室、專業(yè)的操作技術(shù)人員和復(fù)雜的樣品前處理過程，不適合現(xiàn)場快速篩選檢測。

目前檢測重金屬鉛的方法多為儀器法，利用膠體金免疫層析法檢測重金屬離子鉛較少，因此本文基于膠體金免疫層析技術(shù)，檢測主要的糧食類別之一：糙米中重金屬鉛的含量具有必要性，并且對于糧庫等機構(gòu)來說具有實際意義。

1材料與方法

1.1主要儀器

干式加熱器（HMG-GS北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）、膠體金讀數(shù)儀（BMZ 6000北京美正生物科技有限公司）、200μL移液器（賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司）、計時器（北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）、離心管（50mL，20mL，潔特）、槍頭（BIOFIL）、一次性手套（麥迪康）、離心機（DM0412大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司）、原子吸收光譜儀（PinAAcle 900T perkinelmer公司）、渦旋混合器（TZL-5013蘇州珀西瓦爾實驗設(shè)備有限公司）、分析天平（PL-602E梅特勒一托利多分析天平），20目篩網(wǎng)。

1.2主要試劑

超純水、硝酸、硫酸、EDTA、乙酸乙酯、甲醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉等。

1.3方法

1.3.1檢測原理

重金屬鉛檢測試紙條應(yīng)用了競爭抑制膠體金免疫層析的原理（結(jié)構(gòu)如圖1所示）。將金標(biāo)抗體結(jié)合在金標(biāo)墊/微孔中，將抗原（T線）和二抗（C線）固定于NC膜上，當(dāng)待測樣品加到樣品墊/微孔中后，樣本中抗原與金標(biāo)抗體結(jié)合，通過層析作用向前移動。當(dāng)移至（T線）區(qū)域時，偶聯(lián)抗原和未結(jié)合金標(biāo)抗體結(jié)合而被截留，聚集在檢測線（T線）上，剩余金標(biāo)抗體越過檢測線（T線），在質(zhì)控線（C線）處與二抗結(jié)合顯色。配合儀器讀取結(jié)果如圖1所示。

1.3.2檢測方法

1.3.2.1樣品前處理

稱取2.0g±0.02g均質(zhì)（過20目篩網(wǎng)）樣本于50mL離心管中，加入6mL硝酸溶液（0.5M）和4mL乙酸乙酯，具塞，充分振蕩5min后，4 000rpm離心5min；取1mL上清，加入2mL硫酸溶液（1M），振蕩3min，4 000rpm離心3min；棄上清，取500μL下清，立即加入0.5M PBS溶液（5min內(nèi)），振蕩混勻；取250μL該混合液，加入200μL EDTA-水溶液（0.5M），振蕩均勻，1min內(nèi)待檢。

1.3.2.2檢測步驟

（1）在進行檢測前先完整閱讀使用說明書，從原包裝中取出試劑桶，打開后取出所需數(shù)量的微孔試劑和試紙條，并做好標(biāo)記；微孔試劑取出后，請立即蓋好試劑桶蓋。

（2）使用前將試紙條、微孔試劑和待檢樣品恢復(fù)至室溫25℃；將所需微孔試劑置于加熱器上的微孔中。一次檢測樣品數(shù)量不要超過4個；如果一次檢測樣品數(shù)量超過4個，請按照4個一組，分批檢測。

（3）用微量移液器移取200μL回溫后的樣品于微孔試中，緩慢抽吸至檢測樣品與微孔試劑充分混勻；使用計時器，開始計時。

（4）40℃條件下孵育5min；孵育結(jié)束后，停止計時；從試劑桶中取出所需數(shù)量的試紙條并插入微孔試劑中，使印有LOGO手柄端向上，另一端向下并充分浸入溶液中；再次按下計時器，開始第二次5min孵育。

（5）第二次5min孵育結(jié)束后，停止計時；取出試紙條，擦除下端樣品墊，立即使用讀數(shù)儀讀取檢測結(jié)果。注意不要接觸或損壞測試條中部檢測區(qū)域，并在1min內(nèi)讀取結(jié)果。

（6）檢驗完畢，剩余試紙條和微孔試劑放回試劑桶并蓋緊桶蓋，剩余所有的試劑蓋緊瓶蓋，一起放回試劑盒中，2～8℃保存。

1.3.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

稱取陰性樣品，每份2g，然后加入重金屬鉛標(biāo)準(zhǔn)品，添加鉛含量在0μg/kg，20μg/kg，50μg/kg，100μg/kg，200μg/kg，400μg/kg。每個濃度三份平行。然后其余步驟同1.3.2.2，以T線灰度值作為縱坐標(biāo)，以對應(yīng)的樣品中鉛添加濃度值為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.4方法檢出限及定量限

稱取20份陰性樣本，每份2g，根據(jù)步驟1.3.2.1和1.3.2.2進行檢測，該方法檢出限LOD以陰性樣品20次測定結(jié)果的均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計算，定量限LOQ以空白樣品20次測定結(jié)果的均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計算。

1.3.2.5準(zhǔn)確性

利用膠體金分析法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法分別對8個糙米樣品進行雙試驗檢測，采用配對t檢驗法比較兩種方法的檢測結(jié)果是否存在顯著性差異。

1.3.2.6重復(fù)性

選取中等水平糙米樣品，重復(fù)測定8次，按照GB/T 4889-2008《數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理和解釋正態(tài)分布均值和方差的估計與檢驗》中7.1單總體方差或標(biāo)準(zhǔn)差檢驗實施x2分布檢驗，判斷該方法重復(fù)性測定標(biāo)準(zhǔn)差是否超過標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的重復(fù)性要求，同時采用8次測定極差與現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的8次測定重復(fù)性臨界極差進行對照，考察該方法的重復(fù)性。

2結(jié)果分析

2.1結(jié)果判定

（1）打開樣品卡殼，將定量試紙條插入樣品卡殼槽內(nèi)，保證白色NC膜表面的兩條色帶在卡殼視窗中間。

（2）將樣品卡殼插入讀數(shù)儀樣品卡槽中，按照儀器操作程序，點擊觸屏“檢測”鍵或“TEST”按鈕，讀取結(jié)果。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將糙米的前處理液按照1.3.2.2用膠體金試紙條進行檢測并用膠體金讀數(shù)儀掃描，以掃描檢測線的灰度值為縱坐標(biāo)，以添加后的鉛濃度值（mg/kg）為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示。

2.3方法的檢出限和定量限

通過對20個獨立的陰性樣品進行測定，該方法的檢出限LOD結(jié)果為0.041mg/kg，定量限LOQ結(jié)果為0.097mg/kg，具體的檢測結(jié)果如表1所示。

2.4準(zhǔn)確性實驗

分別采用膠體金試紙法和儀器法對8個已知濃度的樣品進行檢測，檢測結(jié)果如表2所示。根據(jù)檢測結(jié)果可知，膠體金試紙法和儀器法的檢測結(jié)果不存在顯著性差異。

2.5重復(fù)性實驗

按照步驟1.3.2.1和1.3.2.2進行檢測，檢測結(jié)果如表3所示，通過檢測結(jié)果計算得出，檢測結(jié)果平均值為0.125mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差s=0.013mg/kg，極差=0.043mg/kg；根據(jù)GB 5009.12-2017規(guī)定：在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算數(shù)平均值的20%，則兩次測定絕對差（即重復(fù)性限r(nóng)）≤0.025，8次測定的重復(fù)性臨界極差ERR95（8）=F（8）*r/2.8=0.038，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差Sr=r/2.8=0.008 9。顯著性水平a=0.05情況下，查表得x20.95（7）=14.067，x2=（n-1）s2/sr2=15.86>x20.95（7），極差0.043>重復(fù)性臨界極差ERR95（8），檢測結(jié)果表明該方法測定的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差和極差均超過標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的重復(fù)性要求。

2.6注意事項

（1）檢測試紙條請在有效期內(nèi)使用，使用前將試紙條和待檢樣本恢復(fù)至室溫。

（2）樣本大米和糙米可共用一條曲線，即糙米樣本也可用大米的曲線進行檢測。

（3）所有溶液使用前需搖勻，試劑C會有沉淀出現(xiàn)，但不影響結(jié)果。

（4）試劑A具有微弱的揮發(fā)性，建議佩戴口罩或在通風(fēng)櫥中操作。

（5）樣本在振蕩完，移取1.8mL上清時，偶爾會有顆粒物堵塞槍頭的情況發(fā)生，可吹出、重新吸取。

（6）偶有樣本因顆粒度過細等出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，造成上清取液量不足，則“方法二”中第一步振蕩5min后，可以靜置10min后再離心，也可適當(dāng)增加離心時間至8～10min。

（7）檢測過程中請勿觸摸試紙條中央的白色膜面，如不小心接觸后請遺棄。

（8）槍頭與離心管等耗材不可混用，以免交叉污染。

（9）樣品要與微孔中試劑充分混合均勻，避免產(chǎn)生泡沫。

（10）第二次孵育后，務(wù)必立即去掉測試條下端的樣品墊，并在1min內(nèi)讀取結(jié)果，因為試紙條干燥后顏色深度會產(chǎn)生一定變化，影響最后的結(jié)果。

（11）儀器讀取結(jié)果必須使用配套讀數(shù)儀和樣品卡槽。

（12）試劑從試劑桶取出后，請立即蓋好試劑桶蓋。用完一桶試劑再打開另外一桶，如果一次用不完8個微孔，可取用所需數(shù)量的微孔，將剩余微孔立即放回到裝有干燥劑的試劑桶中密封保存。請小心開啟微孔蓋，以保證全部試劑保留在微孔中。

（13）如發(fā)現(xiàn)陽性，檢測結(jié)果需要使用法定的確證方法進行確證。

（14）試驗遇到的任何問題，請與供應(yīng)商聯(lián)系。

3結(jié)論

通過一系列性能評價實驗，重金屬離子鉛膠體金免疫層析試紙條檢測時間在15min內(nèi)，檢出限為0.041mg/kg，定量限為0.097mg/kg。該方法重復(fù)性良好，檢測結(jié)果與儀器法檢測結(jié)果一致，方法簡便，對人員專業(yè)技能要求較低，并且其靈敏度、穩(wěn)定性和特異性等均達到了食品中有毒有害物質(zhì)快速檢測的要求，非常適用于糧庫收購環(huán)節(jié)的篩選工作。