非小細胞肺癌表皮生長因子受體基因突變274例分析

王艷 吳如夢 夏曉冰 杜秀平 姬懷雪

中圖分類號 R734.2；R979.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）20-2817-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.20.18

摘 要 目的：研究非小細胞肺癌（NSCLC）患者表皮生長因子受體（EGFR）基因突變情況及其與臨床指標的相關(guān)性，為NSCLC患者表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）的個體化給藥提供參考。方法：選取2015年1月-2017年12月我院收治的蘇北地區(qū)NSCLC患者274例，采用擴增阻滯突變系統(tǒng)與TaqMan探針相結(jié)合的方法檢測其肺組織中EGFR基因的突變情況，回顧性分析突變情況與患者性別、年齡、吸煙狀態(tài)、臨床分期、腫瘤分化及病理類型等臨床指標的相關(guān)性；同時與相關(guān)文獻數(shù)據(jù)進行對比，分析EGFR基因突變的地區(qū)差異。結(jié)果：274例NSCLC患者中，發(fā)生EGFR基因突變的有112例，總突變率為40.88%；其中，外顯子19、21、20、19+21突變的分別有50、57、3、2例，突變類型包括delE746-A750、L858R、insH773-V774H等。非吸煙、早期、高分化、腺癌患者EGFR基因外顯子19、21的突變率分別為52.50%、47.24%、46.36%、45.00%，均分別顯著高于吸煙（28.57%）、晚期（27.03%）、低分化（31.71%）、鱗癌（27.66%）患者（P<0.05）；而男性與女性、≥65歲與<65歲患者EGFR基因外顯子19、21的突變率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。蘇北地區(qū)NSCLC患者EGFR基因的突變率顯著高于上海地區(qū)（P<0.05），與云南地區(qū)無顯著差異（P>0.05）但突變類型不同。結(jié)論：蘇北地區(qū)NSCLC患者EGFR基因突變類型以外顯子21突變最多，外顯子19突變次之，外顯子20突變和外顯子19+21雙突變少見，且存在明顯的地區(qū)差異。EGFR基因外顯子19、21的突變率與NSCLC患者的吸煙狀態(tài)、臨床分期、腫瘤分化及病理類型有關(guān)，非吸煙、早期、高分化、腺癌患者更可能在EGFR-TKI靶向治療中獲益。

關(guān)鍵詞 非小細胞肺癌；表皮生長因子受體；酪氨酸激酶抑制劑；外顯子；基因突變；臨床指標；地區(qū)差異

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the gene mutation status of epidermal growth factor receptor （EGFR） in non-small cell lung cancer （NSCLC） patients and its relationship with clinical indexes， and to provide reference for individualized administration of EGFR-TKI in NSCLC patients. METHODS： Totally of 274 NSCLC patients from the northern of Jiangsu area were selected from our hospital during Jan. 2015-Dec. 2017. Mutation status of EGFR gene in lung tissue was determined by amplification refractory mutation system （ARMS）-TaqMan PCR assay. The relationship of EGFR gene mutation with clinical indexes as gender， age， smoking status， staging， tumor differentiation and pathological type were analyzed retrospectively. Compared with related literatures， the regional differences of EGFR gene mutation were analyzed. RESULTS： Among 274 NSCLC patients， 112 patients suffered from EGFR gene mutation with total mutation rate of 40.88%. There were 50， 57， 3， 2 cases of exon 19， exon 21， exon 20 and exon 19+21 mutation， and the types of EGFR gene mutation were delE746-A750， L858R and insH773-V774H， etc. The mutation rates of EGFR gene exon 19， exon 21 in non-smoking， early， well-differentiated and adenocarcinoma patients were 52.50%， 47.24%， 46.36% and 45.00%， which were significantly higher than smoking （28.57%）， advanced （27.03%）， poor-differentiated （31.71%） and squamous cell carcinoma （27.66%） patients， with statistical significance （P<0.05）. There was no statistical significance in mutation rates of EGFR gene exon 19 and exon 21 between male and female， ≥65 year-old and <65 year-old patients （P>0.05）. EGFR mutation rate of NSCLC subjects from the northern of Jiangsu area was significantly higher than Shanghai area （P<0.05）； there was no statistical significance compared with Yunnan area （P>0.05） but mutation types were different. CONCLUSIONS： There is the highest EGFR gene mutation rate in its exon 21， lesser in exon 19， rare in exon 20 and exon 19+21 among NSCLC patients from the Northern of Jiangsu area. There are obvious regional differences. The mutation rate of EGFR gene mutation exon 19 and exon 21 are associated with smoking status， staging， tumor differentiation and pathological type of NSCLC patients. The non-smoking， early stage， well-differentiated and adenocarcinoma patients are more likely to benefit from EGFR-TKI targeted therapy.

KEYWORDS Non-small cell lung cancer； Epidermal growth factor receptor； EGFR-TKI； Exon； Gene mutation； Clinical indexes； Regional difference

肺癌是目前發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（NSCLC）患者占肺癌患者總數(shù)的80%～85%[1]。表皮生長因子受體（EGFR）由1 186個氨基酸殘基組成，屬于受體型酪氨酸激酶，是ErbB家族成員之一。EGFR作為一種重要的跨膜受體，在多種腫瘤組織/細胞中呈過表達和（或）發(fā)生突變，與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[1-2]。近年來有研究指出，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）等靶向藥物成為治療晚期NSCLC患者的重要方式，且對EGFR基因突變的NSCLC患者具有較好的臨床療效及安全性[3]。此外，現(xiàn)有國內(nèi)外指南均推薦NSCLC患者在一線治療前應進行EGFR基因檢測，并根據(jù)檢測結(jié)果制訂個體化給藥方案[4-6]。但由于不同地區(qū)、不同種族患者的基因分布有所不同，EGFR-TKI療效的個體差異較大；加之我國各地區(qū)醫(yī)療條件及水平參差不齊，蘇北地區(qū)NSCLC患者EGFR基因檢測剛剛起步，且檢測情況不一，故該地區(qū)尚缺乏EGFR基因檢測及EGFR-TKI個體化給藥的相關(guān)標準。為此，本研究回顧性分析了蘇北地區(qū)274例NSCLC患者EGFR基因的突變情況及其與性別、年齡、吸煙狀態(tài)、臨床分期、腫瘤分化、病理類型等臨床指標的相關(guān)性，并與文獻報道的其他地區(qū)EGFR基因的分布情況進行對比，以期為NSCLC患者的EGFR-TKI個體化給藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2015年1月-2017年12月我院收治的NSCLC患者。納入標準：①來自蘇北地區(qū)的經(jīng)病理學或細胞學診斷確診為NSCLC的患者；②不適合采用治療性手術(shù)或放療；③經(jīng)計算機斷層掃描（CT）或正電子發(fā)射計算機斷層顯像（PET-CT）證實具有可測量的病灶；④卡氏評分≥60分，預計生存期≥3個月。排除標準：①曾接受過放/化療者；②病理診斷不明確者；③繼發(fā)惡性腫瘤、全身性疾病或感染者[7]。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，所有患者均知情同意并簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA的提取 采用DNA石蠟組織提取試劑盒（德國Qiagen公司）并按其說明書方法提取患者肺組織DNA。取10 μm的肺組織石蠟切片3～5片置于Eppendorf離心管中，加入二甲苯1 mL，振蕩混勻，以14 000 r/min離心2 min，棄去上清液，在沉淀中加入試劑盒所含DNA抽提液10滴，充分混勻，于100 ℃下加熱10 min，以13 000 r/min離心10 min。吸取上清液，采用ZF-A型微量核酸定量儀（上海驥輝科學分析儀器有限公司）檢測DNA的質(zhì)量濃度。提取所得DNA樣品的光密度（OD）比值（OD260 nm/OD280 nm）宜控制在1.8～2.0，且質(zhì)量濃度宜大于10 ng/μL。

1.2.2 EGFR基因的檢測 DNA樣本經(jīng)熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）擴增后，采用擴增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS）與TaqMan探針相結(jié)合的方法檢測NSCLC患者肺組織中EGFR基因的突變及分型情況。熒光定量PCR反應體系：2×檢測反應混合液10 μL（含DNA聚合酶0.2 μL、純化水7.8 μL、DNA模板2 μL）。熒光定量PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸25 s，共50個循環(huán)。溶解過程：95 ℃預變性1 min，40 ℃變性1 min，65 ℃退火1 s，95 ℃維持20 s（檢測熒光強度25次）。冷卻階段：40 ℃延伸10 s。所有患者DNA樣本擴增、基因突變及分型檢測均由上海百傲科技股份有限公司完成。

1.2.3 EGFR基因外顯子19、21突變與患者臨床指標的相關(guān)性分析 匯總受試NSCLC患者的臨床資料，分析EGFR基因外顯子19、21突變與其性別、年齡、吸煙狀態(tài)、臨床分期、腫瘤分化、病理類型的相關(guān)性。

1.2.4 EGFR基因突變分布地區(qū)差異的分析 有文獻指出，NSCLC患者EGFR基因突變情況在不同地區(qū)有所差異，這是影響EGFR-TKI療效的重要因素之一[8]。故為進一步探討蘇北地區(qū)NSCLC患者EGFR基因突變情況與云南、上海地區(qū)的差異，筆者將本研究結(jié)果與文獻[8]的數(shù)據(jù)進行了比較和分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

本研究共納入蘇北地區(qū)NSCLC患者274例，其中男性160例，女性114例；年齡31～83歲，中位年齡為60歲；年齡≥65歲的114例，<65歲的160例；吸煙者154例，不吸煙者120例；參照美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）癌癥分期手冊（第7版）NSCLC分期標準[9]，肺癌早期（Ⅰ+Ⅱ期）163例、晚期（Ⅲ+Ⅳ期）111例；高分化者151例，低分化者123例；腺癌患者180例，鱗癌患者94例。所有患者均未曾接受放/化療。

2.2 EGFR基因突變檢出率及突變主要類型

274例NSCLC患者中，發(fā)生EGFR基因突變的有112例，總突變率為40.88%。112例基因突變患者中，外顯子19突變的有50例，占44.64%（50/112），均為delE746-A750型突變；外顯子21突變的有57例，占50.89%（57/112），均為L858R型突變；外顯子20突變的有3例，占2.68%（3/112），均為insH773-V774H型突變；外顯子19+21雙突變的有2例，占1.79%（2/112），均為delE746-A750型+L858R型突變。

2.3 EGFR基因外顯子19、21突變與患者臨床指標的相關(guān)性

EGFR基因外顯子19、21突變與患者吸煙狀態(tài)、臨床分期、腫瘤分化及病理類型有關(guān)（P<0.05）。其中，非吸煙者EGFR基因外顯子19、21的突變率為52.50%，顯著高于吸煙者的28.57%；肺癌早期（Ⅰ+Ⅱ期）患者EGFR基因外顯子19、21的突變率為47.24%，顯著高于肺癌晚期（Ⅲ+Ⅳ期）患者的27.03%；高分化肺癌患者EGFR基因外顯子19、21的突變率為46.36%，顯著高于低分化肺癌患者的31.71%；腺癌患者EGFR基因外顯子19、21的突變率為45.00%，顯著高于鱗癌患者的27.66%。以上差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。但本研究并未發(fā)現(xiàn)EGFR基因外顯子19、21突變與患者性別、年齡有關(guān)（P>0.05），詳見表1。

2.4 EGFR基因突變分布的地區(qū)差異

蘇北地區(qū)NSCLC患者EGFR基因的突變率顯著高于上海地區(qū)，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.035）；但蘇北地區(qū)NSCLC患者EGFR基因的突變率與云南地區(qū)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.678），詳見表2。同時值得注意的是，雖然蘇北地區(qū)與云南地區(qū)NSCLC患者EGFR基因的突變率無顯著差異，但突變類型有所不同：蘇北地區(qū)患者以外顯子19、21突變?yōu)橹鳎颇系貐^(qū)患者則以外顯子19突變?yōu)橹鳌?/p>

3 討論

EGFR的蛋白結(jié)構(gòu)包含3個區(qū)域，分別為胞外配體結(jié)合區(qū)、酪氨酸激酶功能區(qū)和跨膜區(qū)，其中酪氨酸激酶功能區(qū)由外顯子18～21編碼[10]，而位于該區(qū)域的腺苷三磷酸（ATP）結(jié)合位點是EGFR-TKI的競爭結(jié)合位點[11]。EGFR-TKI通過上述位點與ATP結(jié)合，進而阻止表皮生長因子（EGF）配體與受體結(jié)合，抑制EGFR激酶的激活及下游信號的轉(zhuǎn)導，從而導致細胞周期停滯、加速細胞凋亡[10-11]。因此，該蛋白編碼基因的突變，可能影響患者對EGFR-TKI的敏感性。

EGFR基因共包含28個外顯子，其中外顯子19的缺失突變（E19-del）和外顯子21的點突變（L858R）與NSCLC患者對EGFR-TKI的敏感性有關(guān)：（1）外顯子19第746～750位堿基缺失（如delE746-A750型突變?yōu)榈?46～750位谷氨酸、丙氨酸缺失）可能導致EGFR蛋白中氨基酸序列發(fā)生缺損，使得ATP結(jié)合部位變窄，可明顯增強腫瘤細胞對小分子EGFR-TKI的敏感性[12]。（2）外顯子21 L858R點突變，即位于該外顯子第858位的亮氨酸被半胱氨酸替換，導致ATP結(jié)合囊的角度和位置改變，可明顯提高腫瘤細胞對EGFR-TKI的敏感性[13]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，給予EGFR-TKI（如厄洛替尼或吉非替尼）后，EGFR基因外顯子19缺失突變的NSCLC患者的治療有效率明顯提高，且生存時間明顯延長[14]；給予第二代EGFR-TKI（如阿法替尼）后，EGFR基因外顯子21 L858R點突變的NSCLC患者的治療有效率亦明顯提高[15]。

EGFR基因外顯子20的點突變或堿基插入突變與EGFR-TKI的耐藥有關(guān)：（1）外顯子20的點突變是指位于外顯子20第790位密碼子出現(xiàn)T/M轉(zhuǎn)換，導致該位點的蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)轶w積更大的甲硫氨酸，由此產(chǎn)生的位阻效應減弱了EGFR-TKI與酪氨酸激酶功能區(qū)的親和力，從而造成腫瘤細胞對EGFR-TKI耐藥[16]。（2）堿基插入突變是指在外顯子20第770～775位密碼子的序列中插入3～9個堿基片段，包括8種不同的插入方式。其中，insH773-V774H型堿基片段的插入減少了EGFR-TKI與ATP的結(jié)合，從而導致耐藥的發(fā)生[17]。此外有研究指出，在對耐藥的EGFR基因突變患者中，T790M的突變率高達50%，當患者被檢測出T790M突變時，其可能對厄洛替尼等EGFR-TKI耐藥[18]。

本研究結(jié)果顯示，274例NSCLC患者中，有112例發(fā)生EGFR基因突變，且以外顯子19和21突變?yōu)橹鳌Ｆ渲校?0例外顯子19突變者均為delE746-A750型，57例外顯子21突變者均為L858R型，提示該部分患者可能成為EGFR-TKI靶向治療的獲益人群。有3例患者為少見的外顯子20 insH773-V774H型突變，該類患者應避免選用EGFR-TKI方案，以免產(chǎn)生耐藥。此外，有2例患者發(fā)生外顯子19+21雙突變，可能會增加其對EGFR-TKI的敏感性，但仍需進一步證實。

本研究發(fā)現(xiàn)，EGFR基因外顯子19、21突變與NSCLC患者吸煙狀態(tài)、臨床分期、腫瘤分化及病理類型有關(guān)。諸多研究顯示，亞裔、非吸煙、女性、肺腺癌患者是EGFR-TKI靶向治療的優(yōu)勢人群[6，19-20]。Toyooka S等[21]運用多變量分析發(fā)現(xiàn)，非吸煙、腺癌等臨床指標與NSCLC患者EGFR基因突變存在重要關(guān)聯(lián)。張靜等[22]研究結(jié)果表明，EGFR基因在肺腺癌、非吸煙、高分化患者中具有更高的突變率。這與本研究結(jié)果基本一致。但本研究并未發(fā)現(xiàn)EGFR基因外顯子19、21突變與NSCLC患者性別、年齡有關(guān)，推測可能是由于樣本量偏小所致，故仍需擴大樣本量進一步探討。

EGFR基因突變分布存在顯著的地區(qū)差異[8]。Sekine I等[19]研究發(fā)現(xiàn)，亞洲NSCLC患者EGFR基因外顯子19的突變率接近30%，而歐洲患者僅約7%。相關(guān)研究指出，我國EGFR基因突變存在明顯的地區(qū)差異：廣東地區(qū)以外顯子19為主，臺灣地區(qū)以外顯子21居多，而北京地區(qū)二者無明顯差異[9，20]。但關(guān)于蘇北地區(qū)NSCLC患者EGFR基因突變情況與其他地區(qū)的差異尚未見報道。為此，本研究將蘇北地區(qū)NSCLC患者EGFR基因突變情況與文獻[8]的數(shù)據(jù)進行了比較，結(jié)果顯示，蘇北地區(qū)患者的突變率與上海地區(qū)差異顯著；與云南地區(qū)差異雖不大，但兩個地區(qū)的突變類型有所不同。這初步提示EGFR基因突變分布存在地區(qū)差異，蘇北地區(qū)患者更有望從EGFR-TKI靶向治療中獲益。此外，由于我國地域遼闊，各地區(qū)NSCLC患者EGFR基因突變類型及突變率有所不同，故在治療前進行EGFR基因檢測，將有助于實現(xiàn)EGFR-TKI的個體化給藥。

綜上所述，蘇北地區(qū)NSCLC患者EGFR基因的總突變率為40.88%，突變類型以外顯子21突變最多，外顯子19突變次之，外顯子20突變和外顯子19+21雙突變少見。EGFR基因外顯子19、21的突變率在非吸煙、早期、高分化及腺癌患者中較高，該部分人群更可能在EGFR-TKI靶向治療中獲益。蘇北地區(qū)NSCLC患者EGFR基因的突變率與上海地區(qū)存在顯著差異；雖與云南地區(qū)差異不大，但突變類型有所不同。本研究可為蘇北地區(qū)NSCLC患者EGFR-TKI的個體化給藥提供理論依據(jù)。但由于本研究樣本量有限、地區(qū)差異分析的數(shù)據(jù)來源于文獻，故所得結(jié)論仍有待擴大樣本量進一步驗證。

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（收稿日期：2018-01-10 修回日期：2018-08-10）

（編輯：張元媛）