田薊苷對腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織的保護(hù)作用研究

馬麗月 曾誠 鄭瑞芳 姜雯 何承輝 邢建國

中圖分類號 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）20-2805-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.20.15

摘 要 目的：研究田薊苷（TIL）對腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織的保護(hù)作用。方法：120只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（0.9%氯化鈉溶液）、模型組（0.9%氯化鈉溶液）、尼莫地平組（32 mg/kg）和TIL低、中、高劑量組（4、8、16 mg/kg），每組20只。灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)7 d，末次給藥15 min后，以改良線栓法建立腦缺血再灌注損傷模型。進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能缺損評分；計算大鼠腦梗死體積百分比；采用蘇木精-伊紅染色法觀察大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)；檢測大鼠腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、乳酸脫氫酶（LDH）活性和丙二醛（MDA）含量；采用Western blot法檢測大鼠腦組織中降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（VEGFR2）蛋白表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著升高（P<0.01）；腦組織梗死體積百分比顯著升高（P<0.01）；腦組織神經(jīng)細(xì)胞明顯縮小變形，細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯；腦組織中SOD、CAT活性均顯著減弱，LDH活性顯著增強(qiáng)，MDA含量顯著增加，CGRP、VEGFR2蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，尼莫地平組和TIL中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均顯著降低（P<0.05或P<0.01）；腦組織梗死體積百分比均顯著降低（P<0.05或P<0.01）；腦組織上述病理改變均明顯減輕；腦組織中SOD、CAT活性均顯著增強(qiáng)，LDH活性均顯著減弱，MDA含量均顯著減少，CGRP、VEGFR2蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：TIL對腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織具有一定保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)CGRP和VEGFR2表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 田薊苷；腦缺血再灌注損傷；降鈣素基因相關(guān)肽；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2；保護(hù)作用

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of tilianin（TIL） on brain tissue in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury. METHODS： Totally 120 male SD rats were randomly divided into sham operation group （0.9% sodium chloride solution）， model group （0.9% sodium chloride solution）， nimodipine group （32 mg/kg） and TIL low-dose and medium-dose， high-dose groups （4， 8， 16 mg/kg）， with 20 rats in each group. The rats were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 7 d. 15 min after last medication， cerebral ischemia-reperfusion injury model was established by reforming suture-occluded method. The neurological deficit score in rats were evaluated， and percentage of cerebral infarction volume of rats was determined. Histopathological changes of brain tissue were observed by HE staining. The activities of SOD， CAT and LDH， MDA content in cerebral tissue of rats were determined. The expression of calcitonin gene-related peptide （CGRP） and peripheral vascular endothelial growth factor receptor 2 （VEGFR2） protein were determined by Western blot assay. RESULTS： Compared with sham operation group， neurological deficit score and percentage of cerebral infarction volume of model group were increased significantly （P<0.01）； the nerve cells in brain tissue were significantly reduced and the interstitial edema was obvious. SOD and CAT activities were decreased significantly， LDH activity was increased significantly， MDA content was decreased significantly，protein expression of CGRP and VEGFR2 were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， neurological deficit score of nimodipine group， TIL medium-dose and high-dose groups were decreased significantly； percentage of cerebral infarction volume was decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）； above pathological conditions of cerebral tissue in rats were relieved significantly； SOD and CAT activities were strengthened significantly， MDA content and LDH activities were decreased significantly， protein expression of CGRP and VEGFR2 were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： TIL has certain protective effects on cerebral ischemia-reperfusion injury model rats， and its mechanism may be related to the up-regulation of CGRP and VEGFR2 expression.

KEYWORDS Tilianin； Cerebral ischemia-reperfusion injury； CGRP； VEGFR2； Protection

田薊苷（Tilianin，TIL）是新疆維吾爾藥香青蘭（Dracocephalum moldavica L.）的主要活性成分，屬黃酮類化合物[1]。研究表明，TIL對模型大鼠高血壓、高血脂、動脈粥樣硬化等病理狀態(tài)均有顯著改善作用，并對模型大鼠心肌缺血再灌注損傷有顯著保護(hù)作用[2-4]，在心腦血管疾病的防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

腦缺血再灌注損傷是腦卒中溶栓并發(fā)癥之一，是指腦組織經(jīng)過一定時間的缺血缺氧，待血液供應(yīng)恢復(fù)后，過量的自由基攻擊該部分重新獲得血液供應(yīng)的腦組織內(nèi)的細(xì)胞造成的損傷[5]。其過程是一個快速的級聯(lián)反應(yīng)，包括諸多環(huán)節(jié)，如炎性細(xì)胞浸潤、能量代謝障礙、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞水腫、自由基生成等[6-7]。

本實驗通過建立腦缺血再灌注損傷模型，考察不同劑量的TIL對模型大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積、腦組織病理形態(tài)學(xué)、腦組織中相關(guān)實驗指標(biāo)及降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（VEGFR2）蛋白表達(dá)的影響，從促進(jìn)血管新生的角度探討TIL在模型大鼠腦缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮的作用，為其進(jìn)一步研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

FluorChem HD2型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國Alpha Innotech公司）；Mini-protean 3型十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）儀（美國Bio-Rad公司）；BS210S型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；Microfuge 22R型臺式微量冷凍離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）；HP Scanjet F2410型掃描儀（美國HP公司）；JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SG-200型塑料薄膜封口機(jī)（上海凱鳴電子機(jī)械有限公司）；620E型冰凍切片機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；CHK213型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；HY-2A型水浴恒溫振蕩器（金壇市醫(yī)療儀器廠）；UV-2501PC型紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司）；BCD-206STPA型冰箱（青島海爾股份有限公司）；Image Pro Plus 6圖像分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）。

1.2 藥品與試劑

TIL（新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所自制，批號：20170805，純度：95%）；尼莫地平（黑龍江天宏藥業(yè)股份有限公司，批號：20160823，規(guī)格：60 mg/片）；二喹啉甲酸法（BCA）蛋白定量試劑盒（批號：P1511）、放射免疫沉淀試驗（RIPA）裂解緩沖液（批號：P0013B）；5×蛋白上樣緩沖液均購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色液（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：170609）；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（批號：20171205）、過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒（批號：20171127）、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（批號：20171105）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（批號：20171211）均購自南京建成生物工程研究所；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：STY102）；CGRP一抗（批號：ab47027）、VEGFR2一抗（批號：ab461）均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；β-actin一抗（批號：TA-09）、山羊抗兔二抗（批號：ZB-23011）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；電化學(xué)發(fā)光法（ECL）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0018）；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量220～260 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0036。所有大鼠實驗期間自由進(jìn)食飲水。

2 方法

2.1 分組與給藥

將120只大鼠隨機(jī)分成6組，即假手術(shù)組（等體積0.9%氯化鈉溶液）、模型組（等體積0.9%氯化鈉溶液）、尼莫地平組（32 mg/kg）[8]和TIL低、中、高劑量組（4、8、16 mg/kg）[9]，每組20只。各組大鼠均灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)7 d，灌胃體積為1 mL/100 g。

2.2 造模

采用改良線栓法[10]并略加改進(jìn)以建立大腦中動脈阻斷（MCAO）模型。末次給藥15 min后，模型組、尼莫地平組和TIL低、中、高劑量組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/kg）進(jìn)行麻醉，仰臥位固定于鼠板上，頸部正中切口，鈍性分離右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA）。永久性結(jié)扎ECA和CCA的近心端，動脈夾臨時夾閉ICA，CCA遠(yuǎn)心端結(jié)扎一道縫合線，勿扎緊。CCA接近ECA和ICA分叉處用眼科剪作一斜行細(xì)切口，插入頂端涂有硅膠的線栓，稍扎緊縫合線，松開動脈夾，推動線栓進(jìn)入ICA，插入約0.8 cm時注意調(diào)整線栓方向，避免誤入翼腭動脈，插入約1.8 cm時減慢插線速度，遇輕微阻力時即停止插線，此時MCAO 模型建立。記錄栓塞開始時間，縫合肌肉、皮膚，栓塞30 min后拔出線栓。假手術(shù)組大鼠除不插入線栓外，其余操作與各組相同。

2.3 大鼠神經(jīng)功能缺損評分

大鼠清醒后進(jìn)行第1次神經(jīng)功能缺損評分，以評價模型是否建立成功，評價標(biāo)準(zhǔn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[8，11]，總分共21分。以>7～<13分為模型建立成功；剔除<7分或>13分者，并隨機(jī)補(bǔ)充各組設(shè)計所需的大鼠數(shù)量。本實驗建模成功率為50.73%。大鼠給藥7 d后，進(jìn)行第2次神經(jīng)功能缺損評分。神經(jīng)功能缺損評分細(xì)則見表1。

2.4 大鼠腦梗死體積百分比的計算

造模成功24 h后，大鼠腹腔注射1%水合氯醛（0.35 mL/kg）進(jìn)行麻醉，而后處死，剝離腦組織，置于-20 ℃冰箱內(nèi)急凍5 min后取出，放入腦槽中沿冠狀面水平切7刀，取中間6片，每片厚約2 mm。將切片放入2%TTC染色液中，嚴(yán)格避光，置于37 ℃水浴箱中，每隔10 min搖動1次，30 min后取出。正常腦組織呈紅色，梗死組織呈白色。將腦組織切片置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后取出，用圖像分析系統(tǒng)計算大鼠腦組織的梗死體積、總體積并計算大鼠腦梗死體積百分比[11-12]（大鼠腦梗死體積百分比=腦組織切片總梗死體積/腦組織切片總體積×100%）。

2.5 大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)的觀察

造模成功24 h后，按“2.4”項下方法取腦組織，以10%中性甲醛溶液固定24 h后依次經(jīng)水洗、脫水、透明、包埋。由切片機(jī)連續(xù)切取6 μm的冠狀腦組織切片，經(jīng)脫蠟、水化、染色（HE）、脫水、封片后，置于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)。

2.6 大鼠腦組織中SOD、CAT、LDH活性和MDA含量的檢測

造模成功24 h后，按“2.4”項下方法取腦組織，于冰上剪碎后加入適量冷RIPA裂解緩沖液后研磨勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液，按試劑盒說明書，以紫外-可見分光光度計檢測大鼠腦組織中SOD、CAT、LDH活性和MDA含量。

2.7 大鼠腦組織中CGRP和VEGFR2蛋白表達(dá)的檢測

采用Wester blot法檢測CGRP和VEGFR2蛋白表達(dá)。造模成功24 h后，按“2.4”項下方法取腦組織，分離右側(cè)腦皮質(zhì)，于冰上充分剝離白色梗死組織周邊的組織，放入標(biāo)識好的離心管中。加入RIPA裂解緩沖液（腦組織質(zhì)量與裂解液體積比為1 ∶ 7），勻漿，超聲（功率：250 W，頻率：50 kHz，下同）處理5 s，靜置5 s ，再超聲處理1 min后以12 000 r/min離心30 min。取上清液，加入5×蛋白上樣緩沖液以體積比1 ∶ 4稀釋，95 ℃變性10 min，電泳，轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉封閉2 h。加入一抗（CGRP：1 ∶ 1 000；VEGFR2：1 ∶ 500；β-actin：1∶ 1 000），4 ℃放置過夜，加入山羊抗兔二抗（1 ∶ 1 000），室溫放置2 h。以ECL法顯色，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光，拍照。以目的條帶與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示蛋白表達(dá)強(qiáng)弱，進(jìn)行半定量分析。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，尼莫地平組和TIL中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

3.2 各組大鼠腦梗死體積百分比比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死體積百分比顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，尼莫地平組和TIL中、高劑量組大鼠腦梗死體積百分比均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見表3。

3.3 各組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)比較

假手術(shù)組大鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，可見神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量多，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核大而圓，未見病理性損傷。模型組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞明顯縮小變形，細(xì)胞核固縮深染，核固縮呈三角形或不規(guī)則形狀，部分胞核和胞質(zhì)界限不清；細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯，組織結(jié)構(gòu)被破壞（疏松呈網(wǎng)狀），染色淺淡，甚至在部分紅染區(qū)域僅見到無明顯結(jié)構(gòu)的壞死組織。TIL低劑量組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂無序，細(xì)胞核形態(tài)較模糊，有部分細(xì)胞體積變小，出現(xiàn)皺縮，部分細(xì)胞變性、壞死，細(xì)胞間質(zhì)較疏松。尼莫地平組和TIL中、高劑量組大鼠腦組織病理改變均明顯減輕，細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞形態(tài)較正常，細(xì)胞層數(shù)略少，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞質(zhì)較飽滿，僅可見少量不同程度被破壞的細(xì)胞，詳見圖1。

3.4 各組大鼠腦組織中SOD、CAT、LDH活性和MDA含量比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中SOD、CAT活性均顯著減弱，LDH活性顯著增強(qiáng)，MDA含量顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，尼莫地平組和TIL中、高劑量組大鼠腦組織中SOD、CAT活性均顯著增強(qiáng)，LDH活性均顯著減弱，MDA含量均顯著減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見表4。

3.5 各組大鼠腦組織中CGRP和VEGFR2蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中CGRP、VEGFR2蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，尼莫地平組和TIL中、高劑量組大鼠腦組織中CGRP、VEGFR2蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、圖3。

4 討論

腦缺血再灌注損傷模型動物腦部血液再灌注后，相關(guān)細(xì)胞損害和形態(tài)學(xué)改變程度較再灌注前更加明顯[13-15]。本研究結(jié)果顯示，8、16 mg/kg的TIL可有效改善模型大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)。

神經(jīng)功能缺損評分是評價大鼠神經(jīng)功能的指標(biāo)，分值越低表明其神經(jīng)功能越好。本研究結(jié)果顯示，8、16 mg/kg的TIL可顯著降低模型大鼠神經(jīng)功能缺損評分，表明TIL有助于大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。腦梗死體積百分比直觀地反映了大鼠的梗死灶大小。本研究結(jié)果顯示，8、16 mg/kg的TIL可顯著降低模型大鼠腦梗死體積百分比，表明TIL有助于腦缺血后的康復(fù)。LDH是一種糖酵解酶，當(dāng)組織細(xì)胞受損時，LDH活性會顯著增強(qiáng)，這使得LDH成為評價組織損傷程度的有效指標(biāo)[13]。本研究結(jié)果顯示，8、16 mg/kg的TIL可顯著減弱模型大鼠腦組織中LDH的活性，表明TIL可以減輕腦組織損傷。CAT為一種過氧化氫分解酶，可保護(hù)細(xì)胞免受H2O2的傷害[13]。本研究結(jié)果顯示，8、16 mg/kg的TIL可顯著增強(qiáng)模型大鼠腦組織中CAT的活性，避免腦組織損傷。SOD是機(jī)體內(nèi)氧自由基的頭號“殺手”，能將機(jī)體中有害的超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫，進(jìn)而在其他酶的作用下轉(zhuǎn)化成水和氧氣[14]。生物膜被攻擊引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，會產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化物，MDA是其中最典型的產(chǎn)物之一，其含量通?？勺鳛闄C(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度的一個指標(biāo)，也能間接反映機(jī)體的受損程度[14]。MDA的含量檢測和SOD的活性檢測通常同時進(jìn)行，以便更好地評估組織的脂質(zhì)過氧化損傷程度。本研究結(jié)果顯示，8、16 mg/kg的TIL可顯著增強(qiáng)模型大鼠腦組織中SOD的活性，減少MDA的含量，提示TIL具有抗氧化的腦保護(hù)作用。

目前研究表明，CGRP是一種廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的辣椒素敏感感覺神經(jīng)的重要肽類遞質(zhì)，具有增加腦血流量和神經(jīng)保護(hù)雙重功能，可促進(jìn)血管生成[16-18]。同時，促進(jìn)血管新生最主要的體液因子為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF），其在體外可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生，在體內(nèi)可誘導(dǎo)血管生成，同時還可促進(jìn)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的遷移，并參與腦缺血性損傷的炎癥反應(yīng)[19]。VEGF受體主要包括VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3等，其中VEGFR2是血管內(nèi)皮細(xì)胞上的主要受體類型，是血管形成的主要調(diào)控因子，與血管形成和生長密切相關(guān)[20]。因此，推測CGRP和VEGFR2可能在血管新生的早期發(fā)揮關(guān)鍵性作用，是整個腦缺血后血管新生調(diào)控的中心環(huán)節(jié)。大鼠腦缺血再灌注損傷發(fā)生時，機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激性反應(yīng)，CGRP和VEGFR2蛋白表達(dá)均增強(qiáng)，但這種自我修復(fù)能力有限，不足以改善腦缺血預(yù)后。本研究結(jié)果顯示，8、16 mg/kg的TIL可顯著增強(qiáng)模型大鼠腦組織中CGRP和VEGFR2蛋白表達(dá)，說明TIL具有促進(jìn)內(nèi)源性血管新生的作用。

綜上所述，TIL對腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織具有一定保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)CGRP和VEGFR2表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2018-01-08 修回日期：2018-03-06）

（編輯：張 靜）