柴苓護(hù)肝顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

莫國(guó)棟 楊瑾 林麗 譚芳廷

中圖分類號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）20-2796-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.20.13

摘 要 目的：建立柴苓護(hù)肝顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 方法：采用薄層色譜法（TLC）對(duì)制劑中柴胡、白術(shù)、甘草藥材進(jìn)行定性鑒別，采用紫外-可見分光光度法測(cè)定制劑中總黃酮（以蘆丁計(jì)）的含量，并對(duì)制劑的水分、溶化性、粒度進(jìn)行檢查。 結(jié)果：柴胡、白術(shù)、甘草的TLC圖斑點(diǎn)清晰，分離度好，陰性對(duì)照無干擾。蘆丁檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為 0.050～0.300 mg/mL（r=0.999 8）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2%；加樣回收率為97.89%～100.01%（RSD=0.68%，n=9）；樣品含量為1.920～2.018 mg/g。3批樣品的水分含量分別為1.54%、1.62%、1.57%，均在5 min內(nèi)溶化，不能通過一號(hào)篩且能通過五號(hào)篩的總和分別為2.13%、2.51%、2.38%，均符合2015年版《中國(guó)藥典》（四部）的規(guī)定。結(jié)論：初步擬定柴苓護(hù)肝顆粒中總黃酮的含量應(yīng)不得低于1.57 mg/g（以蘆丁計(jì)）；所建質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于柴苓護(hù)肝顆粒的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 柴苓護(hù)肝顆粒；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；紫外-可見分光光度法；蘆丁；總黃酮；柴胡；白術(shù)；甘草

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the quality standard of Chailing hugan granules. METHODS： TLC was used for qualitative identification of Radix bupleuri， Atractylodes macrocephala and Glycyrrhiza uralensis. The content of total flavonoids （by rutin） in preparation was determined by UV-visible spectrophotometry. The moisture， dissolubility and granularity of preparation were determined. RESULTS： TLC spots of R. bupleuri， A. macrocephala and G. uralensis were clear and well-separated without interference from negative control. The linear range of rutin was 0.050-0.300 mg/mL （r=0.999 8）. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2%. The recoveries were 97.89%-100.01% （RSD=0.68%， n=9）. The content of samples were 1.920-2.018 mg/g. The contents of moisture in 3 batches of samples were 1.54%， 1.62% and 1.57%； all samples dissolved within 5 min. The sum of granules not passing through No.1 sieve and passing through No.5 sieve were 2.13%， 2.51%， 2.38%， which were all in line with the requirements of Chinese Pharmacopeia （2015 edition，Vol Ⅳ）. CONCLUSIONS： The content of total flavonoicle in Chailing hugan granules should be no less than 1.57 mg/g （by rutin）. Established quality standard is simple， rapid， accurate and reproducible， and can be used for quality control of Chailing hugan granules.

KEYWORDS Chailing hugan granules； Quality standard； TLC； UV-visible spectrophotometry； Rutin； Total flavonoids； Radix bupleuri； Atractylodes macrocephala； Glycyrrhiza uralensis

柴苓護(hù)肝方為逍遙散方[1]在結(jié)合臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)上加減藥味形成的經(jīng)驗(yàn)方，由柴胡、白術(shù)、甘草（炙）8味中藥材組成，具有疏肝利膽、解酒瀉毒的功效，可用于酒精肝、脂肪肝、急慢性病毒性肝炎等病的治療[2]。柴苓護(hù)肝顆粒由處方藥材飲片經(jīng)水提、醇沉、濃縮、干燥、成型等工序制成，具有體積小、便于攜帶和保存、質(zhì)量穩(wěn)定可控等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。為更好地控制其質(zhì)量，筆者根據(jù)藥材所含化學(xué)成分及其理化性質(zhì)，結(jié)合“君、臣、佐、使”的中醫(yī)藥理論[5]，采用薄層色譜法（TLC）對(duì)該制劑中柴胡、白術(shù)、甘草藥材進(jìn)行定性鑒別，采用紫外-可見分光光度法測(cè)定該制劑中總黃酮的含量，并對(duì)其水分、溶化性、粒度進(jìn)行檢查，旨在為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ZF-8型紫外分析成像儀（上海嘉鵬科技有限公司）；AS20500A型超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；XP26型百萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；UV-6100S型紫外-可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；DGX-9073型烘箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；定量點(diǎn)樣毛細(xì)管（華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

柴胡對(duì)照藥材（批號(hào)：120992-201509）、白術(shù)對(duì)照藥材（批號(hào)：120925-201611）、甘草對(duì)照藥材（批號(hào)：120904-201519）、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-201409，純度：92.6%）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；柴苓護(hù)肝顆粒（我院制劑室自制，批號(hào)：20170611、20170613、20170615，規(guī)格：15 g/袋）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠，批號(hào)：20150921）；其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 柴胡 取樣品10 g，加水40 mL，攪拌溶解，用水飽和正丁醇萃取2次，每次20 mL，棄去水層；合并正丁醇層，用40%氨試液洗滌2次，每次20 mL，棄去氨試液；取正丁醇層揮干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，搖勻，作為供試品溶液。取柴胡對(duì)照藥材0.5 g，加水40 mL，回流提取30 min，濾過，濾液按供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。取按柴苓護(hù)肝顆粒處方和工藝制備的缺柴胡的陰性樣品10 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）TLC法[6]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-乙醇-水（1 ∶ 9 ∶ 2.5 ∶ 1，V/V/V/V）[7]為展開劑，展開，取出，晾干；以含1%對(duì)二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液顯色，于105 ℃烘箱中加熱5 min，置紫外光燈（302 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖1。

2.1.2 白術(shù) 取樣品10 g，加水30 mL，攪拌溶解，用石油醚（60～90 ℃）提取3次，每次30 mL，棄去水層；合并提取液，石油醚層揮干，殘?jiān)蛹状?.5 mL溶解，搖勻，作為供試品溶液。取白術(shù)對(duì)照藥材0.5 g，加水30 mL，煮沸30 min，放冷，濾過，濾液按供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。取按柴苓護(hù)肝顆粒處方和工藝制備的缺白術(shù)的陰性樣品10 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）TLC法[6]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯（7 ∶ 3，V/V）[8]為展開劑，展開，取出，晾干；以含5%對(duì)二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液顯色，于105 ℃烘箱中加熱5 min，置紫外光燈（302 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖2。

2.1.3 甘草 取樣品5 g，加水40 mL，攪拌溶解，用水飽和正丁醇提取3次，每次20 mL，棄去水層；合并正丁醇層，用水洗滌3次，每次20 mL，棄去水層；取正丁醇層揮干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，搖勻，作為供試品溶液。取甘草對(duì)照藥材0.1 g，加水40 mL，煮沸30 min，放冷，濾過，濾液按供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。取按柴苓護(hù)肝顆粒處方和工藝制備的缺甘草的陰性樣品5 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）TLC法[6]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 2，V/V/V/V）[9]為展開劑，展開，取出，晾干；以10%硫酸乙醇溶液顯色，于105 ℃烘箱中加熱5 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖3。

2.2 水分檢查

取3批樣品（批號(hào)：20170611、20170613、20170615）各適量，精密稱定，按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“0832水分測(cè)定法”第二法烘干法[6]測(cè)定水分，平行測(cè)定3次。結(jié)果顯示，3批樣品的平均水分含量分別為1.54%、1.62%、1.57%，均符合2015年版《中國(guó)藥典》（四部）規(guī)定的限度標(biāo)準(zhǔn)（不得超過8%）[6]。

2.3 溶化性檢查

取3批樣品（批號(hào)：20170611、20170613、20170615）各適量，精密稱定，按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“0104顆粒劑”項(xiàng)下有關(guān)溶化性的可溶顆粒檢查[6]測(cè)定溶化性，平行測(cè)定 3 次。結(jié)果顯示，3批樣品均在5 min內(nèi)溶化，均符合2015年版《中國(guó)藥典》（四部）規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)[6]。

2.4 粒度檢查

取3批樣品（批號(hào)：20170611、20170613、20170615）各適量，精密稱定，按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“0982粒度測(cè)定法”第二法雙篩法[6]測(cè)定粒度，平行測(cè)定 3 次。結(jié)果顯示，3批樣品不能通過一號(hào)篩且能通過五號(hào)篩的總和分別為 2.13%、2.51%、2.38%，均符合2015年版《中國(guó)藥典》（四部）規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)（不得超過15%）[6]。

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品0.1 g，置于100 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.5.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品0.5 g，加70%乙醇至10 mL，超聲（功率：500 W，頻率：25 kHz）處理5 min，以3 000 r/min離心4 min，取上清液，即得供試品溶液。

2.5.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 精密吸取“2.5.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液2 mL，置于具塞玻璃試管中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，于20～30 ℃下反應(yīng)6 min；加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，于20～30 ℃下反應(yīng)6 min；加氫氧化鈉溶液（4.3 g氫氧化鈉加水定容至100 mL）4 mL，搖勻，于20～30 ℃下反應(yīng)15 min。于200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描[9]，測(cè)得其最大吸收波長(zhǎng)為500 nm，詳見圖4。

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.5.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL，分別置于10 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，取2 mL置于具塞試管中，按“2.5.3”項(xiàng)下方法處理后于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=4.039 4x-0.021 5（r=0.999 8）。結(jié)果表明，蘆丁檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.050～0.300 mg/mL。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.5.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.5.3”項(xiàng)下方法處理后于500 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定6次。結(jié)果，吸光度的RSD為1.76%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.5.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20170611）適量，分別于室溫下放置0、30、60、90、120、150 min時(shí)按“2.5.3”項(xiàng)下方法處理后于500 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，吸光度的RSD為1.35%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置150 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品（批號(hào)：20170611）適量，共6份，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.3”項(xiàng)下方法處理后于500 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，吸光度的RSD為1.67%（n=6），表明本方法重復(fù)性較好。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)：20170611）適量，共9份，每3份分別加入一定量的蘆丁對(duì)照品溶液，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.3”項(xiàng)下方法處理后于500 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.5.9 樣品含量測(cè)定 取3批樣品各0.5 g，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.3”項(xiàng)下方法處理后于500 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄吸光度并計(jì)算樣品中總黃酮（以蘆丁計(jì)）的含量，結(jié)果見表 2。

3 討論

TLC法是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種重要的試驗(yàn)方法，也是中藥材定性鑒別的主要方法，常用于中藥成方制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，在中藥分析與檢驗(yàn)中具有重要的地位[10-11]。筆者在預(yù)試驗(yàn)中參考2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[12]及相關(guān)文獻(xiàn)[7-9，12-15]對(duì)柴苓護(hù)肝顆粒中8味藥材的主要活性成分進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除柴胡、白術(shù)、甘草的TLC鑒別專屬性強(qiáng)、色譜斑點(diǎn)清晰、分離度好、無拖尾現(xiàn)象，可用于定性鑒別外，其余藥材不宜作為該制劑的定性鑒別指標(biāo)。

柴苓護(hù)肝顆粒中含有多種中藥材，成分復(fù)雜，主要有效成分為皂苷類、黃酮類和多糖類化合物，因此應(yīng)建立多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)體系對(duì)制劑的質(zhì)量進(jìn)行控制。柴胡皂苷為君藥柴胡的主要活性成分之一，對(duì)肝臟具有一定的保護(hù)作用，其含量本應(yīng)作為質(zhì)量控制指標(biāo)。但筆者采用對(duì)二甲胺基苯甲醛比色法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，經(jīng)反復(fù)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)回收率達(dá)不到2015年版《中國(guó)藥典》（一部）的要求；進(jìn)一步檢索2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中收載的以柴胡為君藥的成方制劑[12]，如柴胡口服液、柴黃片、逍遙丸、柴銀口服液等，發(fā)現(xiàn)均未建立柴胡皂苷的含量測(cè)定方法。而目前已報(bào)道的柴胡皂苷含量測(cè)定方法差異較大，多為溶劑提取法[16]和大孔樹脂法[17]，步驟復(fù)雜煩瑣、重復(fù)性差、提取效率低，因此本研究未選擇總皂苷為控制該制劑質(zhì)量的指標(biāo)。而經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[18-21]，發(fā)現(xiàn)該制劑中柴胡、豬苓、白術(shù)、甘草等藥材中均富含黃酮類化合物，其對(duì)肝病亦有不同程度的防治作用，故本研究以總黃酮（以蘆丁計(jì)）含量為質(zhì)量控制指標(biāo)。

筆者對(duì) 3批樣品中的總黃酮進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其平均含量為1.97 mg/g?？紤]到企業(yè)生產(chǎn)中中藥材飲片的有效成分含量具有一定的波動(dòng)性，因此基于實(shí)際生產(chǎn)加工過程中的損耗和保存期等不穩(wěn)定因素，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[22]，將樣品中總黃酮含量的平均值下調(diào)20%，初步擬定柴苓護(hù)肝顆粒中總黃酮的含量應(yīng)不得低于 1.57 mg/g（以蘆丁計(jì)）。

綜上所述，所建質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于柴苓護(hù)肝顆粒的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2017-12-13 修回日期：2018-08-27）

（編輯：陳 宏）