低溫配制工藝對虎杖膏中總二苯乙烯和總蒽醌含量的影響

王玉和 趙萍 陳婷婷 孟翠 歐水平 黃珺 王森

摘 要 目的：了解低溫配制工藝對虎杖膏中總二苯乙烯和總蒽醌含量的影響。方法：采用將虎杖粉加入80 ℃麻油中的低溫配制工藝制備虎杖膏；以虎杖苷為對照品，采用一階導(dǎo)數(shù)光譜法在343 nm和345 nm波長處測定虎杖膏中總二苯乙烯的含量；以大黃素為對照品，采用分光光度法在437 nm波長處測定虎杖膏中總蒽醌的含量。計算虎杖膏制備過程中總二苯乙烯和總蒽醌的轉(zhuǎn)移率。結(jié)果：虎杖苷、大黃素檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為4.24～14.84 μg/mL（r=0.999 9）和3.96～13.86 μg/mL（r=0.999 5）；精密度、穩(wěn)定性（6 h）、重復(fù)性試驗的RSD均<3%（n=6或n=7）；平均回收率分別為99.43%、98.70%，RSD分別為0.94%、0.91%（n=6）；測得3批虎杖粉及制得的虎杖膏所含虎杖粉中總二苯乙烯（以虎杖苷計）的平均含量分別為（29.444±0.445）、（29.518±0.437）、（28.323±0.609）和（26.558±0.227）、（28.045±0.303）、（25.290±0.781） mg/g，總蒽醌（以大黃素計）的平均含量分別為（20.557±0.257）、（19.520±0.292）、（18.795±0.444）和（18.438±0.240）、（18.621±0.017）、（16.808±0.076） mg/g，3批虎杖加入80 ℃麻油調(diào)配成軟膏后，總二苯乙烯和總蒽醌轉(zhuǎn)移率分別為（90.22±2.13）%、（95.01±0.38）%、（89.28±0.84）%和（89.71±2.29）%、（95.41±1.52）%、（89.46±2.52）%。結(jié)論：采用較低油溫（80 ℃）中加入虎杖粉進(jìn)行調(diào)配虎杖膏，總二苯乙烯和總蒽醌的轉(zhuǎn)移率均在89%以上，表明該低溫配制工藝能較好地避免熱敏性成分受到破壞，具有合理性。

關(guān)鍵詞 虎杖膏；麻油；低溫配制；轉(zhuǎn)移率；分光光度法；一階導(dǎo)數(shù)光譜法；總二苯乙烯；總蒽醌；虎杖苷；大黃素

中圖分類號 R917；R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）21-2911-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.21.08

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effects of low-temperature preparation technology on the contents of total stilbenes and total anthraquinone in Polygonum cuspidatum ointment. METHODS： Using low-temperature preparation technology by adding P. cuspidatum powder into the sesame oil at lower oil temperature （80 ℃） to prepare Polygonum cuspidatum ointment. The content of total stilbene in P. cuspidatum ointment was determined by first-order derivative spectrophotometry at 343 nm and 345 nm using polydatin as control. The content of total anthraquinone in P. cuspidatum ointment was determined by spectrophotometry at 437 nm using emodin as control. The transfer rate of total stilbene and total anthraquinone in the preparation process of P. cuspidatum ointment were calculated. RESULTS： The linear ranges of polydatin and emodin were 4.24-14.84 μg/mL （r=0.999 9） and 3.96-13.86 μg/mL （r=0.999 5）， respectively. RSDs of precision， stability （6 h） and repeatability tests were all less than 3% （n=6 or n=7）. The average recoveries were 99.43% and 98.70%， and RSD were 0.94% and 0.91% （n=6）， respectively. The average contents of total stilbene （by polydatin） in 3 batches of P. cuspidatum and P. cuspidatum ointment were （29.444±0.445）， （29.518±0.437）， （28.323±0.609） and （26.558±0.227）， （28.045±0.303）， （25.290±0.781） mg/g， respectively. The average contents of total anthraquinone （by emodin） were （20.557±0.257）， （19.520±0.292）， （18.795±0.444）， （18.438±0.240）， （18.621±0.017）， （16.808±0.076） mg/g， respectively. The transfer rates of total stilbene and total anthraquinone were （90.22±2.13）%， （95.01±0.38）%， （89.28±0.84）% and （89.71±2.29）%， （95.41±1.52）% and （89.46±2.52）% after 3 batches of P. cuspidatum were added to 80 ℃ sesame oil to form ointment. CONCLUSIONS： The transfer rates of total stilbene and total anthraquinone are all over than 89% in add P. cuspidatum powder into the sesame oil at lower oil temperature （80 ℃）， which indicates that it is rational to using low temperature preparation technology， and it can avoid the destruction of heat sensitive component.

KEYWORDS Polygonum cuspidatum ointment； Sesame oil；Low-temperature preparation technology；Transfer rate；Spectrophotometry； First derivative spectrophotometry； Total stilbene； Total anthraquinone； Polydatin； Emodin

虎杖膏是遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院自制的一種傳統(tǒng)中藥軟膏制劑，由虎杖細(xì)粉、冰片，經(jīng)麻油和固體石蠟調(diào)制而成的油膏劑，具有清熱解毒、消腫止痛之功效，主要用于紅腫而未潰爛的瘡、癰、疔、癤及無名腫毒等癥，在院內(nèi)已使用多年，療效明顯[1-4]?；⒄葹樵撝苿┑木?，為蓼科植物虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc）的干燥根莖和根，性味苦寒，有清熱解毒、活血化瘀、散瘀止痛等功效，臨床主要應(yīng)用于癰腫瘡毒、毒蛇咬傷、血瘀經(jīng)閉、肺熱咳嗽、熱結(jié)便秘、關(guān)節(jié)痹痛、跌撲損傷等疾病[5-7]。虎杖中主要含二苯乙烯類、蒽醌類、黃酮類等化學(xué)成分，其中二苯乙烯類主要包括白藜蘆醇和白藜蘆醇苷（虎杖苷）等化合物，具有鎮(zhèn)咳、降脂、抗血栓、抗休克、防治腦缺血等作用；蒽醌類主要包括大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷等化合物，具有抑菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用[8-12]。中藥油膏通常采用油煎中藥工藝進(jìn)行制備，已有研究證實高溫油煎中藥工藝會使熱敏性成分分解，如大黃蒽醌類成分的分解程度隨著油溫升高和時間延長而增多[13-14]。虎杖膏的制備采用低溫配制工藝，即將虎杖粉加入較低油溫（80 ℃）的麻油中進(jìn)行調(diào)配[1]，但由于虎杖中蒽醌類和二苯乙烯類成分均屬熱敏性成分[15-17]，該配制工藝是否對其含量有影響尚未進(jìn)行研究。因此，本試驗選擇以總二苯乙烯（以虎杖苷計）、總蒽醌（以大黃素計）為測定指標(biāo)，采用分光光度法測定虎杖膏制備過程中總二苯乙烯和總蒽醌的含量變化，旨在為闡明其配制工藝合理性提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

T9系列雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；HH-S6雙列六孔電熱恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）； ME204E電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

虎杖粉（重慶慧遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司，批號：20171201、20180115、20180220）；冰片（四川青神康華制藥有限公司，批號：Z51022577）；麻油（貴陽市南明區(qū)陳章旗調(diào)味品廠，批號：2015111）；石蠟（南昌白云藥業(yè)有限公司，批號：20140809）；虎杖膏（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科自制，批號：20180118、20180213、20180320，規(guī)格：40 g/盒）；虎杖苷對照品（批號：AF8071101，純度：99.87%）、大黃素對照品（批號：AF7021741，純度：98.89%）均購自成都埃法生物科技有限公司；乙醇為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 虎杖膏的制備

按虎杖膏處方劑量稱取各原料藥物：虎杖細(xì)粉23 g、冰片3 g、麻油70 g和固體石蠟4 g，將麻油與固體石蠟放入搪瓷器皿內(nèi)，加熱至泛青煙，停止加熱；待青煙散盡，油、蠟混合液溫度降至約80 ℃，緩緩加入已經(jīng)研磨成細(xì)粉的冰片攪拌均勻，然后徐徐加入已稱取的虎杖粉，并同時同向攪拌，冷卻至50 ℃，即得虎杖膏100 g[1]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 虎杖苷、大黃素對照品溶液 分別精密稱取虎杖苷、大黃素各10.6、9.9 mg，分別置于250 mL量瓶中，加95%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得虎杖苷、大黃素對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 稱取虎杖膏約0.5 g或虎杖粉約0.11 g，加 95%乙醇30 mL，50 ℃回流2 h[4]，回流液2 000 r/min離心10 min。精密吸取上清液2.5 mL，置于10 mL量瓶中，加95%乙醇至刻度，定容，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按處方量稱取除虎杖以外的冰片和其他輔料，按“2.1”項下虎杖膏制備工藝制成陰性樣品。稱取陰性樣品約0.5 g，按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 測定波長的確定

2.3.1 光譜掃描 取“2.2”項下虎杖苷對照品溶液、大黃素對照品溶液、虎杖膏供試品溶液、陰性對照溶液適量，以95%乙醇為空白對照，在200～500 nm波長范圍[18]內(nèi)進(jìn)行掃描，紫外-可見吸收光譜圖見圖1。

2.3.2 分光光度法測定總蒽醌 由圖1可知，大黃素對照品及供試品溶液在437 nm波長附近有最大吸收，虎杖苷和陰性對照溶液在此處無吸收，表明二苯乙烯類成分、冰片和輔料對蒽醌類成分測定無干擾。因此，本試驗選擇以大黃素為對照，采用分光光度法測定總蒽醌，檢測波長確定為437 nm。

2.3.3 一階導(dǎo)數(shù)光譜法測定總二苯乙烯 由圖1可知，虎杖苷和大黃素在290～350 nm波長范圍內(nèi)紫外吸收峰較寬，相互重疊，如果直接采用分光光度法測二苯乙烯類成分，蒽醌類成分會產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾。導(dǎo)數(shù)光譜法可以分離重疊譜帶和排除共存物質(zhì)的干擾吸收[18]，采用UVwin 6軟件的導(dǎo)數(shù)光譜功能模塊，對圖1的紫外-可見吸收光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行一階求導(dǎo)處理，繪制虎杖苷對照品溶液和大黃素對照品溶液、虎杖膏供試品溶液、陰性對照溶液的一階導(dǎo)數(shù)光譜，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，虎杖苷對照品溶液和虎杖膏供試品溶液在344 nm波長處均有一波谷，而大黃素對照品溶液和陰性對照溶液在此波長處其一階導(dǎo)數(shù)光譜圖均接近于零，表明一階導(dǎo)數(shù)光譜可消除虎杖膏中蒽醌類、冰片和輔料對二苯乙烯類成分測定的干擾。因此，可以虎杖苷為對照，采用一階導(dǎo)數(shù)峰谷法測定虎杖膏中總二苯乙烯含量。以波長1 nm為間隔，以峰谷波長344 nm作為中間波長，測定波長選擇343、345 nm。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取“2.2.1”項下虎杖苷、大黃素對照品溶液1、1.5、2、2.5、3、3.5 mL，分別置于10 mL量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，搖勻，制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以95%乙醇為空白對照，分別在343、345 nm和437 nm波長處測定吸光度（A），分別以ΔA（A343-A345）、A437對質(zhì)量濃度（c）進(jìn)行回歸處理[18]，得虎杖苷和大黃素的回歸方程分別為ΔA=4.434 0c-0.000 5（r=0.999 9）、A=45.238 1c-0.046 6（r=0.999 5），虎杖苷和大黃素質(zhì)量濃度分別在4.24～14.84 μg/mL和3.96～13.86 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 精密稱取樣品（批號：20180118）約0.5 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，每日連續(xù)重復(fù)測定6次，連續(xù)測定3 d。計算總二苯乙烯（以虎杖苷計）、總蒽醌（以大黃素計）的日內(nèi)RSD分別為0.61%、0.15%（n=6），日間RSD分別為0.75%、0.35%（n=3），表明儀器的精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 精密稱取樣品（批號：20180118）約0.5 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、1、2、3、4、5、6 h，在343、345 nm和437 nm波長處測定其吸光度，計算總二苯乙烯（以虎杖苷計）、總蒽醌（以大黃素計）的RSD分別為2.14%、0.21%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗 精密稱取樣品（批號：20180118）約0.5 g，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在343、345 nm和437 nm波長處測定其吸光度，計算總二苯乙烯（以虎杖苷計）、總蒽醌（以大黃素計）的RSD分別為2.31%、1.57%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.4 加樣回收試驗 精密稱取樣品（批號：20180118）約0.25 g，共12份，其中6份加入“2.2.1”項下虎杖苷對照品溶液30 mL，另6份加入“2.2.1”項下大黃素對照品溶液30 mL，再按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在343、345 nm和437 nm波長處測定其吸光度，計算其平均回收率，結(jié)果見表1。

2.6 虎杖膏及虎杖粉中總二苯乙烯和總蒽醌含量測定

取3批虎杖膏樣品約0.5 g或虎杖粉約0.11 g，精密稱定，分別按“2.2.2”項下方法制備虎杖膏和虎杖粉供試品溶液，分別在343、345 nm和437 nm波長處測定其吸光度（A），并計算ΔA（A343-A345），分別將ΔA（A343-A345）、A437代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算虎杖膏和虎杖粉供試品溶液中總二苯乙烯（以虎杖苷計）和總蒽醌（以大黃素計）的質(zhì)量濃度，按式1、式2計算虎杖粉和虎杖膏中總二苯乙烯（以虎杖苷計）和總蒽醌（以大黃素計）的含量，式中m為虎杖粉取樣量，或虎杖膏所含虎杖粉的質(zhì)量（其中根據(jù)虎杖膏的處方，虎杖膏中虎杖粉的比例為23%計），測定結(jié)果見表2。

按式3、式4計算虎杖膏制備過程中總二苯乙烯和總蒽醌的轉(zhuǎn)移率[19]。結(jié)果，3批虎杖膏中總二苯乙烯的轉(zhuǎn)移率分別為（90.22±2.13）%、（95.01±0.38）%、（89.28±0.84）%，總蒽醌的轉(zhuǎn)移率分別為（89.71±2.29）%、（95.41±1.52）%、（89.46±2.52）%。

3 討論

3.1 檢測方法的選擇

目前測定虎杖中二苯乙烯類、蒽醌類主要有效成分含量的方法主要有高效液相色譜法[4，20]、分光光度法[21-22]等。筆者在前期研究中也建立了高效液相色譜法測定虎杖膏中白藜蘆醇、虎杖苷、大黃素、大黃素甲醚的含量[4]，但因虎杖膏中含有大量（70%，m/m）的麻油，且分析時間較長，供試品溶液制備時未能將麻油分離，而麻油對色譜柱柱效影響較大，采用脫脂分離麻油以避免對柱效的影響，但操作煩瑣。分光光度法可測定虎杖中總二苯乙烯類和總蒽醌類成分，但二苯乙烯類（虎杖苷）、蒽醌類（大黃素）成分在紫外區(qū)吸收光譜相互重疊，直接測定蒽醌時對二苯乙烯類的紫外吸收產(chǎn)生了干擾。筆者曾嘗試對二苯乙烯類進(jìn)行分離純化時，未能將蒽醌類成分完全除去，在測定二苯乙烯類時依然產(chǎn)生干擾現(xiàn)象。有文獻(xiàn)報道，采用調(diào)節(jié)虎杖乙醇提取液pH至堿性，改變pH可影響二苯乙烯和蒽醌類成分羥基存在形式，使其紫外吸收峰位移動，部分消除了譜峰重疊問題，能同時分析二苯乙烯和蒽醌類化合物[21]。因本制劑中含有麻油，堿化后會與麻油中脂肪酸產(chǎn)生皂化反應(yīng)，仍會干擾測定[23]。當(dāng)混合物中各組分吸收曲線重疊嚴(yán)重時，如改用各組分的導(dǎo)數(shù)光譜則往往可以區(qū)分開，因而選用大黃素為代表的蒽醌類成分以及陰性對照溶液作為干擾組分，對干擾組分、虎杖苷對照品、虎杖膏供試品溶液的吸收光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)處理。試驗結(jié)果表明，虎杖苷和虎杖膏的一階導(dǎo)數(shù)光譜在330～340 nm波長間均呈拋物線型二次曲線，于344 nm波長處有一峰谷，而大黃素對照品溶液和陰性對照溶液在此區(qū)間近似呈直線，且在344 nm波長處趨近于零，因此采用一階導(dǎo)數(shù)處理可消除蒽醌類成分對二苯乙烯類的干擾[22]。本試驗分別采用一階導(dǎo)數(shù)光譜峰谷法和分光光度法測定虎杖膏中測定二苯乙烯類和總蒽醌成分的含量，無需分離麻油、制樣簡便，結(jié)果可靠、重現(xiàn)性好，為虎杖膏制備工藝研究提供了簡便、實用的定量方法。

3.2 虎杖膏工藝合理性分析

虎杖膏中所含麻油具有“藥輔合一”功效。中醫(yī)理論認(rèn)為，麻油性寒，高溫炮制藥物后轉(zhuǎn)變?yōu)槠胶椭裕尚袣饣钛x，能解毒生肌、消腫止痛、潤澤肌膚，這與麻油中含有2-乙基-5-甲基吡嗪、乙酰呋喃、2-乙酰噻唑和5-乙基-4-甲基噻唑等香氣成分，以及脂溶性維生素E、芝麻素和芝麻酚等具有抗氧化、改善毛細(xì)血管通透性和微循環(huán)等作用有關(guān)[23]。麻油中含麻油和亞麻油分別約為39%和43%[24]，對脂溶性藥物有較好的溶解作用，在傳統(tǒng)中藥油膏中作為基質(zhì)載體和溶劑[13，24-25]。研究表明，油酸等可通過破壞角質(zhì)層類脂膜結(jié)構(gòu)及在角質(zhì)層細(xì)胞間形成腔隙，從而促進(jìn)藥物透皮吸收[26]。通常采用高溫油煎中藥進(jìn)行油膏配制，該工藝存在非油溶性成分不能被提取、揮發(fā)性成分的逸失、熱敏性成分分解等問題[13-14]。虎杖膏采用將虎杖粉加入80 ℃的麻油中進(jìn)行制備，結(jié)果表明該低溫配制工藝能較好地避免熱敏性成分總二苯乙烯和總蒽醌成分受到破壞，其轉(zhuǎn)移率均在89%以上，表明該制備工藝具有合理性。至于該配制工藝對具體的二苯乙烯類、蒽醌類以及其他成分的影響，有待進(jìn)一步采用HPLC法及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC/MS）法等方法進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-08-22 修回日期：2018-09-26）

（編輯：余慶華）