銹毛草莓積雪草合劑對(duì)STZ小鼠降血糖作用研究

高良才 王欣怡 陸詩韻 周夢(mèng)璇 陳清 林青楠

摘 要：采用75%乙醇萃取銹毛草莓及積雪草，制備成合劑，通過STZ誘導(dǎo)建立糖尿病小鼠模型，隨機(jī)分為模型組、低劑量組及高劑量組，分別以蒸餾水、4及8 g·kg-1銹毛草莓積雪草合劑灌胃，1次·d-1，持續(xù)4周，另設(shè)正常組作為對(duì)照。探究繡毛草莓積雪草合劑對(duì)糖尿病小鼠的降血糖效果及作用機(jī)制。結(jié)果表明：（1）不同劑量的銹毛草莓積雪草合劑均能顯著降低糖尿小鼠血糖值，提高糖耐量并減輕其多食、多飲、多尿的癥狀。（2）低劑量組小鼠血清TC、TG含量較模型組有顯著提高（P<0.01或P<0.05），肝臟SOD、CAT活性顯著提高（P<0.05），MDA含量明顯降低。（3）低劑量黃毛草莓積雪草合劑效果優(yōu)于二甲雙胍，毒性實(shí)驗(yàn)顯示銹毛草莓積雪草合劑實(shí)屬無毒。該研究結(jié)果表明銹毛草莓積雪草合劑具有降血糖作用，同時(shí)能夠降低糖尿病小鼠的血脂水平，其作用機(jī)制可能與提高肝臟抗氧化能力有關(guān)。

關(guān)鍵詞：銹毛草莓， STZ， 糖尿病， 降血糖， 抗氧化

中圖分類號(hào)：Q946.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2018）04-0451-06

Abstract：We extracted medicine compound （FN-MC） by 75% ethanol. STZ-induced diabetic mice were randomly divided into model， low-dose and high-dose groups， respectively， and treated with distilled water and FN-MC at doses of 4 and 8 g·kg-1 for 4 weeks. Control group was treated with distilled water. The results showed that FN-MC could significantly lower the fasting blood glucose， reduced food and water intake， and improved the level of OGGT. Low-dose FN-MC could obviously increase the levels of TC and TG （P<0.01 or P<0.05）， decrease the level of MDA， enhance the activities of SOD and CAT （P<0.05）. Besides， Low-dose FN-MC was more effective than metformin. Toxicity test showed that FN-MC was non-toxic. In conclusion， FN-MC could decrease blood glucose in STZ-induced diabetic mice by mechanisms of enhancing the activity of antioxidant in liver.

Key words：Fragaria nilgerrensis， streptozotocin， diabetic， hypoglycemic， antioxidation

糖尿病是一種由遺傳或后天胰島素分泌缺陷引起的以糖代謝紊亂及高血糖為特征的代謝性疾病?；颊叨嗍芷洳l(fā)癥的影響，如心血管病變、糖尿病腎病、眼部病變、糖尿病足等（劉明山，2015）。糖尿病的治療手段中，西藥存在靶點(diǎn)單一的問題，很難在控制血糖的同時(shí)對(duì)糖尿病并發(fā)癥有兼顧作用（孔令敏，2012），中草藥在這方面有很大優(yōu)勢(shì)，其多靶點(diǎn)綜合作用、副作用較小的潛在優(yōu)勢(shì)使其在糖尿病治療中成為研究熱點(diǎn)（陳吉生和鄭聰，2011）。

銹毛草莓（Fragaria nilgerrensis）為薔薇科草莓屬植物，別名黃毛草莓、白草莓，生長(zhǎng)在海拔700～3 000 m的山坡草地或溝邊林下，分布于我國云南、廣西、四川、貴州等地（傅立國，2004），有清熱解毒、活血祛瘀的功效，具有較好的藥用價(jià)值且資源豐富（王麗等，2011）。積雪草（Centella asiatica）為傘形科積雪草屬植物，別名落得打、連錢草，分布于云南、福建、浙江、江蘇、湖南等地，具有鎮(zhèn)定、安定的作用（賀惠娟，2010）。云南地區(qū)常將銹毛草莓制成合劑用于糖尿病患者輔助治療，但目前尚未有銹毛草莓積雪草合劑藥理作用的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探究銹毛草莓積雪草合劑對(duì)STZ誘導(dǎo)（楊巍等，2006）的糖尿病小鼠的降血糖作用，研究其對(duì)糖尿病小鼠的血脂、糖代謝影響，為探究銹毛草莓積雪草合劑的降血糖機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

昆明種小鼠120只，成年雄性，體重（20±2）g，由華東師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑

鏈脲佐菌素（購自上海源聚生物科技有限公司，批號(hào)140817、140329），檸檬酸，檸檬酸鈉，乙醇，氯化鈉，冰醋酸（購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司），甘油三酯（TC）、總膽固醇（TG）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵（上海申勝生物技術(shù)有限公司），穩(wěn)豪型血糖儀（強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司），血糖試紙（Life Scan， Inc.），酶標(biāo)儀（ELX800 Universal Microplate Reader），T6新悅型分光光度計(jì)，臺(tái)式低速離心機(jī)，臺(tái)式高速離心機(jī)（無錫市瑞江分析儀器有限公司），常用手術(shù)器械。

2 方法

2.1 STZ糖尿病小鼠模型建立

小鼠120只適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)選擇10只作為空白對(duì)照組。剩余小鼠以STZ誘導(dǎo)1型糖尿病模型，按40 mg·kg-1劑量腹腔注射0.4% STZ-枸櫞酸鈉溶液，正常組腹腔注射等量檸檬酸鈉緩沖液。建模1周，小鼠禁食6 h，通過血糖儀測(cè)定空腹血糖值，棄去低于15 mmol·L-1或大于30 mmol·L-1的小鼠，選取高于15 mmol·L-1作為STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠。將建模成功的小鼠按血糖值平均分為模型組、低劑量組和高劑量組。

2.2 銹毛草莓積雪草合劑制備

銹毛草莓與積雪草干燥后剪碎，各稱取12 g，75%乙醇500 mL室溫下浸提3 h，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中真空蒸煮后過濾取上清，制成生藥濃度0.8 g·mL-1的合劑。

2.3 小鼠灌胃給藥及血糖值測(cè)定

各組均按10 mL·kg-1體積，正常組和模型組灌胃蒸餾水，低劑量組和高劑量組分別灌胃0.4 g·kg-1和0.8 g·kg-1銹毛草莓積雪草合劑，陽性組灌胃0.15 g·kg-1二甲雙胍。1次·d-1，共4周。每周測(cè)定小鼠血糖，禁食6 h后尾靜脈采血，測(cè)定空腹血糖。每周記錄小鼠體重、攝食量及飲水量變化。

2.4 口服葡萄糖耐量及生化指標(biāo)測(cè)定

末次給藥后1 d，進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）。小鼠禁食5 h， 正常飲食1 h后，給予2 g·kg-1葡萄糖溶液灌胃，分別于葡糖糖處理后0、30、60、120 min測(cè)定血糖值。小鼠眼球采血，處死后立即取出肝組織，制成肝勻漿。全血于冰浴中靜置15 min，2 000 r·min-1離心20 min，測(cè)定血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）含量，肝臟中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量，均按試劑盒說明書操作。

2.5 急性毒性試驗(yàn)

昆明種雄性小鼠，每組10只，給藥前禁食不禁水12 h，分別以梯度濃度銹毛草莓積雪草合劑灌胃，24 h后觀察小鼠狀態(tài)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，檢驗(yàn)用單因素方差分析（ANOVA），P<0.05有顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 銹毛草莓積雪草合劑對(duì)STZ糖尿病小鼠血糖的影響

與正常組相比，模型組血糖值顯著升高（P<0.01），與模型組相比，二甲雙胍及銹毛草莓積雪草合劑均可顯著降低小鼠空腹血糖值（P<0.01）。8 g·kg-1銹毛草莓積雪草合劑降血糖作用不如4 g·kg-1明顯，表明銹毛草莓積雪草合劑對(duì)STZ小鼠具有明顯的降血糖作用， 4 g·kg-1是銹毛草莓積雪草合劑的有效降糖濃度（表1）。

3.2 銹毛草莓積雪草合劑對(duì)STZ糖尿病小鼠體重、飲食量的影響

各組小鼠體重?zé)o顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）（表2）。與正常組相比較，模型組小鼠出現(xiàn)了多飲、多食、多尿的情況。二甲雙胍及4 g·kg-1銹毛草莓積雪草合劑可以顯著降低小鼠的攝食量和飲水量（P<0.01），有效改善糖尿病小鼠“三多”的狀況。8 g·kg-1銹毛草莓積雪草合劑對(duì)STZ小鼠飲食量影響不穩(wěn)定（圖1，圖2）。表明銹毛草莓積雪草合劑能改善糖尿病小鼠的代謝水平， 4 g·kg-1是銹毛草莓積雪草合劑的有效作用濃度。

3.3 銹毛草莓積雪草合劑對(duì)STZ糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量的影響

與正常組相比，模型組血糖值持續(xù)升高。與模型組相比，陽性組及低劑量組小鼠血糖值明顯下降，接近自身正常水平。高劑量組小鼠血糖值不穩(wěn)定（圖3）。圖3結(jié)果表明，二甲雙胍及銹毛草莓積雪草合劑對(duì)STZ糖尿病小鼠的OGTT有明顯修復(fù)和改善作用。8 g·kg-1銹毛草莓積雪草合劑糖耐量修復(fù)作用不如4 g·kg-1銹毛草莓積雪草合劑明顯。結(jié)果說明，銹毛草莓積雪草合劑能顯著修復(fù)糖尿病小鼠的口服葡萄糖耐糖量， 4 g·kg-1是銹毛草莓積雪草合劑的有效作用濃度。

3.4 銹毛草莓積雪草合劑對(duì)STZ糖尿病小鼠血脂及肝臟抗氧化水平的影響

與正常組相比，模型組TC、TG、MDA含量明顯升高（P<0.05），SOD、CAT活性顯著降低（P<0.05、P<0.01 ）。與模型組相比，銹毛草莓積雪草合劑可顯著降低STZ小鼠血液中TC、TG含量（P<0.05、P<0.01），顯著提高SOD、CAT活性（P<0.01），明顯降低MDA含量（表3），表明銹毛草莓積雪草合劑能有效恢復(fù)糖尿病小鼠的血脂水平，同時(shí)可明顯提高糖尿病小鼠肝臟抗氧化能力。

3.5 銹毛草莓積雪草合劑急性毒性試驗(yàn)

以12 000 mg·kg-1劑量一次灌胃后，24 h內(nèi)無小鼠死亡。表明銹毛草莓積雪草合劑的小鼠一次經(jīng)口最大耐受量（LD50）大于12 000 mg·kg-1，則其LD50大于12 000 mg·kg-1，屬實(shí)際無毒級(jí)。

4 討論

糖尿病是以高血糖為基本特征的一種多基因綜合性慢性病癥，隨著發(fā)病率快速增長(zhǎng)，糖尿病及其并發(fā)癥已成為嚴(yán)重威脅人類健康的一大問題，為除心血管疾病和癌癥之外的第三大致死疾病（Szkudelski， 2001）。1型糖尿病由胰島素分泌絕對(duì)不足引起，在包括胰島素在內(nèi)的各種降糖藥物中，中藥以其副作用小的特點(diǎn)而被廣泛關(guān)注和研究，開發(fā)在降血糖的同時(shí)對(duì)糖尿病并發(fā)癥也有一定控制效果的中藥合劑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義與廣闊的市場(chǎng)前景。STZ能夠被胰島B細(xì)胞上的低親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT2）轉(zhuǎn)運(yùn)，特異性地引起胰島B細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，從而造成胰島素分泌障礙，是目前常用的糖尿病建模方法（Kai & Xue， 2011；張芳林等，2002）。血清中總膽固醇（TC）及甘油三脂（TG）是機(jī)體基本代謝物質(zhì)。甘油三酯參與人體內(nèi)能量代謝，膽固醇主要用于細(xì)胞漿膜、類固醇激素和膽汁酸等物質(zhì)的合成。因此TC、TG常作為糖尿病脂代謝檢測(cè)的重要指標(biāo)；代謝紊亂所產(chǎn)生的過氧化物游離體可造成機(jī)體損傷，SOD、CAT作為代謝中抗氧化重要酶，固其活性變化可用于衡量機(jī)體抗氧化水平（Liu et al，2017）；該研究通過STZ多次小劑量腹腔注射，誘導(dǎo)形成血糖值持續(xù)而穩(wěn)定升高、血脂含量升高的糖尿病小鼠模型。

銹毛草莓為薔薇科草莓屬植物，可清熱解毒、活血祛瘀，具有較好的藥用價(jià)值。積雪草（Centella asiatica），別名銅錢草，屬傘形科積雪草屬。近年來研究發(fā)現(xiàn)，積雪草具有抗氧化功效，能夠調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)肝臟（林麗敏等，2014；賀惠娟，2010）。該實(shí)驗(yàn)采用銹毛草莓和積雪草制備的中藥合劑作為研究藥物，探究其降血糖效應(yīng)和具體作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低劑量銹毛草莓積雪草合劑對(duì)STZ小鼠具有明顯的降糖作用，能夠緩解糖尿病小鼠多飲、多食、多尿的癥狀。研究表明，糖尿病小鼠血清中總膽固醇（TC）及甘油三脂（TG）含量明顯升高，機(jī)體的脂質(zhì)代謝處于紊亂狀態(tài)，該實(shí)驗(yàn)中，低劑量銹毛草莓積雪草合劑能有效提高TC，TG含量，調(diào)節(jié)機(jī)體脂代謝水平；有效恢復(fù)糖尿病小鼠受損的糖耐量，顯著提高SOD、CAT活性，明顯減少M(fèi)DA累積，有效改善機(jī)體抗氧化水平。結(jié)果表明銹毛草莓積雪草合劑對(duì)STZ小鼠的血脂、糖代謝、抗氧化能力三方面均有調(diào)節(jié)作用。急性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示銹毛草莓積雪草合劑實(shí)屬無毒，提示其作為降血糖中藥合劑具有重要的前景。實(shí)驗(yàn)中，高劑量銹毛草莓積雪草合劑對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖有顯著的降低作用，但效果不如低劑量組明顯，其原因可能是該劑量遠(yuǎn)大于其藥物半數(shù)有效量，即低劑量組小鼠血藥濃度已經(jīng)接近峰值，提高劑量后，藥效不會(huì)更加明顯反而出現(xiàn)拮抗現(xiàn)象。所以，優(yōu)化合劑使用劑量，探討其作用的最佳濃度區(qū)間，是進(jìn)一步開發(fā)研究的關(guān)鍵。

綜上所述，銹毛草莓積雪草合劑具有明顯的降血糖作用，對(duì)糖尿病并發(fā)癥有一定的控制效果，這可能與其改善了肝臟抗氧化水平有關(guān)，銹毛草莓積雪草作為降血糖中藥合劑具有良好的應(yīng)用前景。其中各藥物成分的比例及使用劑量的優(yōu)化有待進(jìn)一步研究。

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