轉(zhuǎn)基因番木瓜檢測(cè)方法的建立

王恒波 余澤懷 肖乃衍 張華 陳平華

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因番木瓜;篩選;定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）;檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)：S667.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)： 1000-4440（2018） 05-1198-03

番木瓜（Carica papaya）是一種有較高食用和藥用價(jià)值的草本果樹(shù)，番木瓜蛋白酶廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、美容、日化品等行業(yè)。番木瓜環(huán)斑花葉病毒（PRSV）是危害番木瓜生產(chǎn)的一種世界性病毒，植株受到侵染后，無(wú)法進(jìn)行有效治療，目前的化學(xué)殺菌劑不能有效控制其蔓延。培育抗病品種是防治環(huán)斑花葉病毒最緊迫的任務(wù)之一，但番木瓜栽培品種中缺乏有效抗病基因資源。直到1986年，Abel等報(bào)道了病毒基因轉(zhuǎn)入寄主植物，導(dǎo)致植物產(chǎn)生抗性的現(xiàn)象，受此啟發(fā)，育種家們開(kāi)始使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)解決番木瓜抗環(huán)斑花葉病毒問(wèn)題，抗環(huán)斑病毒的轉(zhuǎn)基因番木瓜應(yīng)運(yùn)而生。

目前，有3個(gè)轉(zhuǎn)基因番木瓜轉(zhuǎn)化事件存在。第一，20世紀(jì)90年代初夏威夷大學(xué)的Fitch等，將一種環(huán)斑花葉病毒（PRSV）編碼的外殼蛋白（CP）基因轉(zhuǎn)入番木瓜，經(jīng)過(guò)逐步雜交育種，得到了轉(zhuǎn)基因番木瓜Rainbow，1998年5月在夏威夷正式投入商業(yè)化生產(chǎn)。第二，利用PRSV優(yōu)勢(shì)毒株Ys的復(fù)制酶（RP）基因，獲得高抗Ys、Vb、Sm等株系的轉(zhuǎn)基因番木瓜華農(nóng)一號(hào)，于2006年獲得農(nóng)業(yè)部的安全生產(chǎn)證書(shū)。第三，將PRSV YK毒株的CP基因轉(zhuǎn)入栽培品種臺(tái)農(nóng)2號(hào)，于2001年開(kāi)始進(jìn)行田間試驗(yàn)和生產(chǎn)安全評(píng)估試驗(yàn)。

目前，針對(duì)番木瓜轉(zhuǎn)基因成分篩查，還沒(méi)有形成統(tǒng)一的檢測(cè)方法，在檢測(cè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中，關(guān)于胭脂堿合成酶基因啟動(dòng)子（NOS-P）和CP基因檢測(cè)引物篩選和驗(yàn)證的相關(guān)報(bào)道較少。本研究擬針對(duì)世界上現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因番木瓜的CP基因和NOS-P，設(shè)計(jì)相應(yīng)的檢測(cè)引物，建立適合番木瓜轉(zhuǎn)基因成分篩查的方法，為轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)制度的順利執(zhí)行提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因番木瓜（GMYK系列的16-0-1和Rainbow、華農(nóng)一號(hào)）、轉(zhuǎn)基因水稻（科豐6號(hào)、TT51-1）、轉(zhuǎn)基因大豆（GTS40-3-2、MON89788、A2704、A5547-127）、轉(zhuǎn)基因玉米（MON810、MOIN863、NK603、T25、TC1507、Btll、Bt176、GA21）和非轉(zhuǎn)基因番木瓜（紅妃2號(hào)）等試驗(yàn)材料.均由農(nóng)業(yè)部甘蔗及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試劑 PCR反應(yīng)試劑SYBR Premix、ExTaq酶、dNTPs、Buffer均購(gòu)自TaKaRa公司，100 bp Ladder DNA mark-er和植物基因組提取試劑盒（DP305）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2.2 PCR檢測(cè)引物 查閱NCBI網(wǎng)站上GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中CP相關(guān)的核苷酸序列（編號(hào)為FJ467933.1、AF196839.1和YK X78557.1），利用Primer5.O軟件分別設(shè)計(jì)番木瓜環(huán)斑病毒CP基因和NOS-P的特異性檢測(cè)引物。內(nèi)源基因Papa-in檢測(cè)引物采用文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行設(shè)計(jì)。試驗(yàn)中所用引物均由南京金絲瑞生物工程有限公司合成。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系與程序定性和定量PCR反應(yīng)體系以及擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)。退火溫度的優(yōu)化：在梯度PCR儀上設(shè)置10個(gè)退火溫度，分別為50.2℃、50.7℃、51.6℃、52.7℃、54.0℃、55.4℃、56.8℃、58.1℃、59.2℃、60.O℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)源基因Papain的特異性PCR擴(kuò)增

番木瓜果實(shí)中富含多糖、果膠、酚類(lèi)等物質(zhì)，極易對(duì)Taq酶的活性產(chǎn)生影響。通過(guò)對(duì)番木瓜內(nèi)源基因Papain，的檢測(cè)，來(lái)判斷提取DNA的質(zhì)量。所有番木瓜樣品均能獲得與預(yù)期大?。?11bp）相符的擴(kuò)增產(chǎn)物，表明番木瓜DNA適合PCR檢測(cè)。

2.2 利用定量PCR染料法對(duì)CP基因和NOS-P檢測(cè)引物進(jìn)行驗(yàn)證

基于CP基因的保守序列，設(shè)計(jì)5對(duì)檢測(cè)引物，在相同反應(yīng)條件下，依據(jù)Ct值的大小、熔解曲線形狀及熔解曲線高度，篩選出轉(zhuǎn)基因番木瓜最佳的檢測(cè)引物。CP-4引物起峰最早，Ct值為24.87，CP-2引物、CP-1引物、CP-3引物、CP-5引物的Ct值分別為28.60、27.02、26.62、25.76。分析5對(duì)引物熔解曲線的形狀，只有引物CP-4是典型的單峰型曲線，最適合用作CP基因的檢測(cè)引物，其他引物都存在多峰現(xiàn)象，表明存在多個(gè)非特異性擴(kuò)增片段。同時(shí)，基于NOS-P序列，設(shè)計(jì)了1對(duì)檢測(cè)引物，進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，NOS-P引物的熔解曲線也是典型的單峰型曲線，適合作為NOS-P的檢測(cè)引物。

2.3 不同退火溫度下Papain、CP基因和NOS-P的PCR檢測(cè)條件優(yōu)化

同種引物在不同退火溫度下產(chǎn)生的條帶間存在強(qiáng)弱變化。隨著溫度的逐漸升高，Papain基因產(chǎn)生的特異性目的條帶沒(méi)有發(fā)生任何變化，說(shuō)明該引物設(shè)計(jì)合理且擴(kuò)增效率高。NOS-P檢測(cè)引物產(chǎn)生的特異性條帶，隨著溫度的逐漸升高，目的條帶逐漸減弱，當(dāng)退火溫度達(dá)到58.1℃時(shí)，目的條帶消失，說(shuō)明該引物退火溫度范圍窄，擴(kuò)增效率低。CP基因檢測(cè)引物產(chǎn)生的特異性目的條帶，隨著溫度的升高逐漸增強(qiáng)，當(dāng)退火溫度為56.8～60.O℃時(shí)，產(chǎn)生的目的條帶亮度最強(qiáng)。為了防止低含量的轉(zhuǎn)基因番木瓜在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中漏檢，本研究經(jīng)過(guò)篩選得出，Papain，基因、CP基因和NOS-P的最佳退火溫度分別為54.O℃、58.0℃、54.0℃。

2.4 CP基因和NOS-P檢測(cè)引物特異性的PCR驗(yàn)證

針對(duì)CP基因的特異性檢測(cè)，只有轉(zhuǎn)基因番木瓜16-0-1和Rainbow出現(xiàn)了預(yù)期的368 bp的目的片段，華農(nóng)一號(hào)未檢測(cè)出目的條帶。針對(duì)NOS-P的特異性檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因番木瓜16-0-1、Rainbow和華農(nóng)一號(hào)均出現(xiàn)了預(yù)期的173 bp的目的片段，其他測(cè)試材料均未檢測(cè)到任何片段。本研究的檢測(cè)結(jié)果與韓建勛等的結(jié)果相符，表明本研究設(shè)計(jì)與篩選的引物在不同轉(zhuǎn)基因材料中具有較高的特異性。

2.5 檢測(cè)引物的靈敏度

將轉(zhuǎn)基因番木瓜16-0-1和非轉(zhuǎn)基因番木瓜紅妃2號(hào)的DNA溶液（初始濃度均為100 ng/μl）按不同比例混合，配制成轉(zhuǎn)基因番木瓜DNA相對(duì)含量為20.0%、5.0%、1.0%、0.5%、0.1%的樣品，在CP基因和NOS-P已經(jīng)優(yōu)化好的退火溫度58.0℃、54.0℃下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本研究篩選出的檢測(cè)引物具有很高的靈敏度，在相對(duì)含量為0.1%以上的樣品中均能檢測(cè)出特異性目的條帶。

3 討論

中國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品實(shí)行強(qiáng)制標(biāo)識(shí)制度，因此，需要檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)市場(chǎng)上的番木瓜進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分例行監(jiān)測(cè)，以維護(hù)中國(guó)消費(fèi)者的選擇權(quán)和知情權(quán)。根據(jù)檢測(cè)的靶序列差異、外源基因與質(zhì)粒載體上的組合以及植物基因組上的整合位點(diǎn)，檢測(cè)方法分為篩選檢測(cè)、基因特異性檢測(cè)、結(jié)構(gòu)特異性檢測(cè)、轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)。一般情況下，篩選檢測(cè)以啟動(dòng)子、終止子等通用元件為檢測(cè)對(duì)象，初步判斷是否含有外源基因。番木瓜轉(zhuǎn)基因成分篩查通常以CaMV35S啟動(dòng)子、NOS-P、NOS終止子等元件為靶序列?；蛱禺愋詸z測(cè)以轉(zhuǎn)入的外源基因?yàn)榘谢?，例如常?jiàn)的目的基因、標(biāo)記基因和抗性基因（CP、RP、GUS、NPTⅡ）。對(duì)于轉(zhuǎn)基因番木瓜，除了華農(nóng)一號(hào)轉(zhuǎn)入的是RP基因外，其他轉(zhuǎn)基因番木瓜轉(zhuǎn)入的都是CP基因，未見(jiàn)關(guān)于NOS-P和CP基因檢測(cè)引物篩選和驗(yàn)證的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究對(duì)轉(zhuǎn)基因番木瓜CP基因和NOS-P分別進(jìn)行序列比對(duì)，在其保守序列上設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)大檢測(cè)的覆蓋范圍，更好地執(zhí)行轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)制度。

目前，中國(guó)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法大部分是通過(guò)定性PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行判定，部分檢測(cè)引物存在特異性差、靈敏度低的問(wèn)題。加之，瓊脂糖凝膠電泳分離技術(shù)的局限性，這就要求制定檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和篩選PCR檢測(cè)引物的科研人員，不能僅停留在原有的篩選定性PCR引物上，需要向科學(xué)化、實(shí)用化的方向進(jìn)行驗(yàn)證。本研究通過(guò)定量PCR染料法，對(duì)CP基因和NOS-P的定性檢測(cè)引物進(jìn)行熔解曲線分析，對(duì)篩選到的引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果與姜大剛等、Wall等、韓建勛等描述的質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)相同。同時(shí)，以5種不同相對(duì)含量的轉(zhuǎn)基因番木瓜為對(duì)照，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到0.1%水平。

綜上所述，本研究建立的轉(zhuǎn)基因番木瓜檢測(cè)引物篩選方法，為現(xiàn)有商業(yè)化轉(zhuǎn)基因番木瓜的外源基因和元件篩查檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，也構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因番木瓜的基礎(chǔ)檢測(cè)體系與方法，為轉(zhuǎn)基因番木瓜標(biāo)識(shí)制度的順利執(zhí)行提供了技術(shù)支撐。但是，隨著轉(zhuǎn)基因番木瓜轉(zhuǎn)化事件的逐漸增多，現(xiàn)有檢測(cè)方法也存在著檢測(cè)參數(shù)多、操作繁瑣、靈敏度低等缺點(diǎn)。因此，需要逐步建立起各種轉(zhuǎn)基因番木瓜轉(zhuǎn)化事件定性和定量的檢測(cè)體系，滿足未來(lái)監(jiān)管的需要。