強心安神湯對慢性心衰大鼠AngⅡ及AT1mRNA表達的影響

顏旭 劉春華 莊紅 陳琪 張婷 趙啟 蔡雷

〔摘要〕 目的 研究強心安神湯對Wistar慢性心衰模型大鼠AngⅡ含量及AT1 mRNA表達的影響，探討其可能的作用機制。方法 除空白組外，將Wistar大鼠造模后分為模型組、西藥組、強心安神湯高劑量組及強心安神湯低劑量組，干預(yù)4周后，抽靜脈血以免疫組化法測定大鼠血清中AngⅡ的含量；處死大鼠，提取心肌組織，以RT-PCR法檢測心肌組織AT1 mRNA的表達。結(jié)果 強心安神湯組大鼠血清AngⅡ含量及AT1 mRNA表達與模型組及西藥組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論 強心安神湯治療心衰的機制可能與其抑制AngⅡ引起的AT1 mRNA表達上調(diào)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 慢性心衰；強心安神湯；AngⅡ；AT1mRNA

〔中圖分類號〕R285.5；R541.6 〔文獻標(biāo)志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.04.007

〔Abstract〕 Objective To study the effect of Qiangxin Anshen decoction on the expression of AngⅡand AT1 mRNA in the model of Wistar rats with chronic heart failure， and investigate its possible mechanism. Methods Except for the blank group， the model rats were randomly divided into model group， Western medicine group， high-dose Qiangxin Anshen decoction group and low-dose Qiangxin Anshen decoction group. After intervention treatment for 4 weeks， the content of AngⅡof serum in rats was measured. The rats were killed and the AT1 mRNA expression in myocardial tissues were detected. Results Compared with the model and Western medicine groups，the content of AngⅡ in the rats serum and AT1 mRNA expression of myocardial tissues in Qiangxin Anshen decoction group was statistically significant （P﹤0.05 or P<0.01）， Conclusion The mechanism of Qiangxin Anshen decoction in treating heart failure may be related with the up-regulation of AT1 mRNA expression caused by restraining Ang II.

〔Keywords〕 chronic congestive heart failure； Qiangxin Anshen decoction； AngⅡ； AT1 mRNA

慢性心力衰竭（congestive heart failure， CHF）是一種常見的、多發(fā)的心臟疾病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，并沒有降低慢性心衰的病死率。我院心內(nèi)科在多年的中西醫(yī)結(jié)合臨床實踐及實驗中發(fā)現(xiàn)以“益氣滋陰、強心安神”為法組方的“強心安神湯”治療慢性心衰可以顯著改善患者臨床癥狀、體征及實驗室指標(biāo)，減輕心衰大鼠心肌細(xì)胞損傷[1-2]。本文觀察強心安神湯對慢性心衰大鼠血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）及AT1mRNA表達的影響，探討其可能的作用機制，現(xiàn)將實驗結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗藥物 “強心安神湯”組成為：炙黃芪、制首烏、酸棗仁、阿膠、香加皮、葶藶子、三七、黃連、肉桂等，采用超微顆粒，由湖南春光九匯現(xiàn)代中藥有限公司提供；鹽酸阿霉素注射液（批號：1004E1），由浙江海正藥業(yè)股份有限公司提供；生理鹽水，由四川科倫大藥廠生產(chǎn)；注射用水，由天津藥業(yè)焦作有限公司生產(chǎn)；倍他樂克，由阿斯利康制藥有限公司生產(chǎn)；卡托普利，由浙江南洋藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 實驗動物 Wistar大鼠80只，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20） g，隨機分為造模組68只及空白組12只。飼料、墊料均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供。動物實驗室環(huán)境：溫度20～25 ℃，濕度 45%～55%。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）檢測試劑盒由北京北方生物技術(shù)研究所生產(chǎn)；RT-PCR試劑盒由寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)。TC48/T/H（a）型PCR儀由杭州大和熱磁電子有限公司生產(chǎn)；GE-100型水平電泳儀由杭州大和熱磁電子有限公司生產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 Wistar大鼠慢性心衰模型的復(fù)制 根據(jù)文獻[3]，造模組采用腹腔內(nèi)注射阿霉素法，第1～3周按3 mg/kg劑量進行腹腔注射，第4～6周按2 mg/kg劑量進行腹腔注射；1次/周，復(fù)制心力衰竭模型?？瞻捉M注射等容量生理鹽水，每周1次，連續(xù)6周。每天觀察記錄大鼠的精神狀態(tài)、活動、飲食、體質(zhì)量的變化及呼吸頻率等日常習(xí)慣的改變情況，6周后，根據(jù)大鼠行為方式的改變及心臟超聲測量大鼠左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室收縮率（LVFS）及ELISA法檢測大鼠血清腦利鈉肽（BNP）水平的變化判斷造模成功與否。

1.2.2 實驗分組及干預(yù) 將復(fù)制心衰模型成功的55只大鼠，選取48只，隨機分為模型組、西藥對照組、強心安神湯高劑量組、強心安神湯低劑量組，另設(shè)一組作為空白組，每組12只，各組動物給予同等條件下飼養(yǎng)?？瞻捉M和模型組每日予以同等容量的生理鹽水灌胃；西藥組，將倍他樂克及卡托普利配制成水溶液，按2.7 mg/（kg·d）灌胃；中藥給藥劑量按臨床成人劑量×動物等效劑量系數(shù)換算后為強心安神湯低劑量組每日給藥劑量，其4倍值為高劑量組每日給藥劑量。具體為低劑量組按6.93 g/（kg·d）灌胃；高劑量組按27.72 g/（kg·d）灌胃，連續(xù)干預(yù)4周。

1.2.3 標(biāo)本采集與檢測 （1）血清AngⅡ測定：各組大鼠連續(xù)干預(yù)4周，于最后一次給藥后禁食12 h，麻醉后于股靜脈處采血6 mL，分別置于EDTA、肝素抗凝試管中，4 ℃、3 000 r/min離心，分離血漿，低溫下保存待測，由湖南省中西結(jié)合醫(yī)院免疫生化室完成。（2）心衰大鼠AT1 mRNA的檢測：處死大鼠，取心肌組織75 mg置于DECP處理過的研缽內(nèi)，倒入液氮，迅速研磨成粉末狀，加入Trizol反應(yīng)液1 mL裂解細(xì)胞，室溫孵育5～10 min。加入氯仿0.2 mL，劇烈震蕩15 s，室溫孵育3 min。12 000 r/min，4 ℃離心15 min，收集無色上層水相于1.5 mL于另一離心管中，棄沉淀管，加入0.5 mL異丙醇，振蕩混勻，室溫孵育5～10 min。12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇并振蕩。9 000 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清，空氣中干燥5～10 min。加入20 μL DEPC處理的無RNA酶的水溶解RNA，置-70 ℃保存。以A260/280法檢測RNA純度及濃度表示無嚴(yán)重DNA污染，RNA純度較高，樣本無嚴(yán)重RNA降解，符合試驗要求。按M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說明書合成cDNA。引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（具體見表1）；擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；57 ℃退火40 s；72 ℃延伸40 s；35個循環(huán)擴增后，72 ℃延伸10 min。通過圖像分析軟件讀取凝膠電泳條帶光密度掃描值，將條帶與內(nèi)參電泳條帶的比值作為目的基因mRNA的表達量。即：mRNA相對表達=樣品掃描值/內(nèi)參掃描值。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 15.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料采用“x±s”進行統(tǒng)計描述。多組數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析檢驗，方差齊時采用最小顯著差數(shù)法（LSD）法；方差不齊時選用Tamhane's T2法。取P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

如表2和圖1-2所示，模型組心衰大鼠AngⅡ水平及大鼠心肌組織AT1 mRNA表達顯著高于空白組（P<0.01）；分別給予強心安神湯及西藥干預(yù)后，各干預(yù)組AngⅡ水平及AT1 mRNA表達均較模型組顯著降低（P<0.05或P<0.01）；強心安神湯高劑量組及低劑量組與西藥組比較，AngⅡ水平及AT1 mRNA表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。而強心安神湯高、低劑量組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，慢性心衰的基本機制是神經(jīng)內(nèi)分泌介導(dǎo)的心室重構(gòu)，腎素-血管緊張素系統(tǒng)的過度激活促進了心衰的發(fā)生與發(fā)展[4]。腎素活性增加，作用于血管緊張素原，刺激血管緊張素Ⅰ（AngⅠ）分泌增加，AngⅠ被ACE分解為AngⅡ，AngⅡ通過自分泌和（或）旁分泌機制作用于AT1來活化心肌細(xì)胞G蛋白與磷酯酰肌醇特異性磷酸脂酶C耦聯(lián)，引起心肌細(xì)胞鈣離子內(nèi)流和胞漿內(nèi)鈣離子貯存池釋放增加，表現(xiàn)為收縮血管，增強心肌收縮力，并誘導(dǎo)相關(guān)蛋白激酶激活，繼而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的增加，觸發(fā)心肌肥大、纖維組織和血管增生。郭志坤等[5-7]研究證實，AngⅡ通過其特異的AT1受體介導(dǎo)，參與細(xì)胞增殖、遷移，最終導(dǎo)致血管壁及心肌增生肥厚，心室重構(gòu)。何松堅[8]、徐建輝[9]、LI M[10]、楊艷峰[11]等人的研究表明，通過抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)過度激活，從而抑制Ang Ⅱ引起的AT1 mRNA表達上調(diào)，可以阻斷心肌肥厚的發(fā)生，改善早期心肌纖維化、減輕早期心室重構(gòu)、改善預(yù)后。

慢性心衰屬于中醫(yī)學(xué)“心衰”范疇，既往主要根據(jù)臨床表現(xiàn)分別歸屬于“心悸、胸痹、喘證、痰飲、水腫”等病證范疇。“心衰”病位在心，與肺、腎、脾關(guān)系密切。本病基本病機為“本虛標(biāo)實，虛實夾雜”，本虛指“心氣虛、心陽虛”，標(biāo)實主要是寒凝、氣滯、痰濁、水飲、瘀血。其中，心氣虧虛為本病之始，心氣虧虛導(dǎo)致氣陰兩虛，漸至心陽虧虛，陽虛血瘀，心陽虛損，累及腎陽，從而心腎陽虛，陽虛則寒痰凝滯，水濕不行，痰飲阻肺或陽虛水泛，陰竭陽脫。本病后期總是伴隨心陰的損傷或心陰陽兩虛。由此可見“益氣”與“滋陰”是治療心衰的兩個重要方面，而且心衰患者在長期的治療過程中因利水消腫及溫壯心陽疊進更加耗氣傷陰從而導(dǎo)致心氣陰虧虛尤甚。心陰（血）虧虛，血不養(yǎng)心，滋生內(nèi)熱，擾動心神；腎陰（精）虧虛，不能上濟以“滋心陰、涵心陽”，以致心火內(nèi)動，擾動心神。所以，可以認(rèn)為“氣陰兩虛、心神不寧”是“心衰”中的一個常見證型，故以“益氣滋陰，強心安神”立法，組方“強心安神湯”，以期標(biāo)本同治之功。

本實驗研究結(jié)果表明：強心安神湯可顯著降低大鼠血清的AngⅡ水平，抑制AT1 mRNA表達，與西藥組及模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其作用結(jié)果無明顯量-效依賴關(guān)系。本實驗為臨床應(yīng)用強心安神湯治療慢性心衰提供了一定的實驗依據(jù)，但是，中藥復(fù)方湯劑組分復(fù)雜，煎煮后可能產(chǎn)生更多的變化，因此強心安神湯除了對腎素-血管緊張素系統(tǒng)的影響以外，是否還有更多更重要的作用機制和作用靶點，還有待于進一步臨床及實驗研究。

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