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    姜黃素、甘草次酸和香菇多糖聯(lián)合對(duì)CCl4誘導(dǎo)的建鯉肝損傷的保護(hù)作用

    2018-09-10 00:53:05曹麗萍杜金梁賈睿殷國俊GalinaJeney丁煒東高崧
    關(guān)鍵詞:肝損傷四氯化碳中草藥

    曹麗萍 杜金梁 賈睿 殷國俊 Galina Jeney 丁煒東 高崧

    摘要:以四氯化碳(CC14)構(gòu)建建鯉體內(nèi)急性肝損傷模型,對(duì)姜黃素、甘草次酸和香菇多糖聯(lián)合護(hù)肝作用進(jìn)行研究。分別采用含有姜黃素、甘草次酸、香菇多糖和低、中、高劑量姜黃素+甘草次酸+香菇多糖聯(lián)合中草藥的飼料投喂60d后,各組建鯉腹腔注射30%CC14,注射劑量為每lg魚體注射0.005ml,禁食72h,以誘導(dǎo)建鯉急性肝損傷。通過測(cè)定各組建鯉生長指標(biāo)、血清和肝臟生化指標(biāo)及肝組織炎性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)情況,觀察姜黃素、甘草次酸和香菇多糖聯(lián)合用藥的保肝效果。結(jié)果顯示:甘草次酸單味用藥及中、高劑量姜黃素+甘草次酸+香菇多糖聯(lián)合用藥能顯著提高建鯉的相對(duì)增重率和特定生長率,顯著降低餌料系數(shù);與模型組相比,各用藥組能顯著抑制CC14導(dǎo)致的血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和乳酸脫氫酶(LDH)活性的升高,顯著恢復(fù)肝組織中谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)水平,抑制丙二醛(MDA)生成,能顯著抑制C-Rel,iNOS、IL-Iβ、TNF-a、IL-6和IL-8表達(dá)量的升高;與姜黃素、甘草次酸或香菇多糖單味用藥相比較,姜黃素+甘草次酸+香菇多糖聯(lián)合用藥的保肝效果更明顯,隨著聯(lián)合用藥劑量的升高,作用愈加顯著。說明姜黃素、甘草次酸和香菇多糖聯(lián)合用藥,對(duì)CC14誘導(dǎo)的建鯉肝損傷具有協(xié)同保護(hù)作用。

    關(guān)鍵詞:建鯉;四氯化碳;肝損傷;中草藥

    中圖分類號(hào):S948

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    文章編號(hào): 1000-4440(2018) 05-1100-07

    中藥姜黃為姜科姜黃屬植物姜黃(Curcuma lon,-gaL.)的干燥根莖,現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明其具有廣泛的藥理作用。姜黃素(Curcumin)是中藥姜黃的主要活性成分,是唯一一種具有酚基和醌基的天然藥物,毒性低,耐受性好,具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保肝及免疫調(diào)節(jié)等活性,且無明顯的毒副作用,是常用傳統(tǒng)中藥。甘草次酸(Glycyr-thetinic acid,GA)是甘草的重要成分,具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保肝等廣泛的藥理學(xué)作用。香菇多糖(Lentinan,LNT)是從擔(dān)子菌綱香菇中提取的一種B-D-(1,3)葡萄糖殘基為主鏈、(1,6)葡萄糖殘基為側(cè)鏈的葡聚糖,具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能和促進(jìn)干擾素生成等功能。

    臨床上,利用不同中藥聯(lián)合用藥治療疾病是中醫(yī)用藥的特色和優(yōu)勢(shì)。聯(lián)合用藥的優(yōu)勢(shì)一方面是中藥基本性能發(fā)揮作用,另一方面是各個(gè)組成藥物之間的協(xié)同放大作用。復(fù)方甘草酸苷聯(lián)合水飛薊素治療藥物性肝病的效果明顯優(yōu)于單味用藥。五味子與黃芪多糖協(xié)同作用,能顯著提高乙酰氨基酚致肝損傷小鼠谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)水平,降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)水平,減輕肝組織損傷程度。鑒于姜黃素、甘草次酸和香菇多糖的保肝和免疫調(diào)節(jié)功效,本研究以CC14誘導(dǎo)建鯉肝損傷,并建立急性肝損傷模型,通過檢測(cè)建鯉生長指數(shù)、血清和肝臟組織勻漿中相關(guān)生化指標(biāo)及細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的變化,研究姜黃素、甘草次酸和香菇多糖聯(lián)合用藥對(duì)建鯉急性肝損傷的保護(hù)作用,探討這3種中藥配伍的合理性和科學(xué)性,為進(jìn)一步開發(fā)魚類保肝中草藥配方奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)魚

    建鯉取自中國水產(chǎn)科學(xué)院淡水漁業(yè)研究中心漁場(chǎng),體質(zhì)健康無傷,規(guī)格基本一致,飼養(yǎng)于循環(huán)水系統(tǒng)中。馴養(yǎng)條件為:(27±2)℃,pH6.8~7.6,溶解氧(DO)質(zhì)量濃度>5mg/L,NH3質(zhì)量濃度<0.05mg/L,H2S質(zhì)量濃度<0.01mg/L。每天投喂普通飼料(粗蛋白40%,粗脂肪10%,灰分10%,能量21kl/g)2次,每次投喂飼料量為魚體質(zhì)量的2%,馴養(yǎng)7d。

    1.2 主要藥品與儀器

    姜黃素、甘草次酸購自Sigma公司,香菇多糖粗制粉購自無錫正大畜禽有限公司。CC14(分析純)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,配置成30%的CC1。一橄欖油溶液(CC14:橄欖油=3:7,體積比)。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、乳酸脫氫酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量測(cè)定試劑盒購自于南京建成生物工程研究所科技有限公司。DuGreen核酸染料(10000x水溶液)購自碩世生物科技有限公司,總RNA抽提試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自于TaKaRa公司。MK3酶標(biāo)儀為Thermo公司產(chǎn)品,ABI-7500型PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

    1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    初體質(zhì)量為(30.0+1.0)g的健康鯉魚,飼養(yǎng)于淡水漁業(yè)研究中心宜興屺亭基地700cmx435cmX120cm的室內(nèi)水泥池內(nèi)。隨機(jī)分為8組,每組20尾,分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組(CC14)、姜黃素組(5.0g/kg姜黃素)、甘草次酸組(3.0g/kg甘草次酸)、香菇多糖組(3.0 g/kg香菇多糖)、聯(lián)合藥物低劑量組(1.0g/kg姜黃素+1.0g/kg甘草次酸+1.0g/kg香菇多糖)、聯(lián)合藥物中劑量組(2.5 g/kg姜黃素+1.5g/kg甘草次酸+1.5g/kg香菇多糖)和聯(lián)合藥物高劑量組(5.0g/kg姜黃素+3.Og/kg甘草次酸+3.0g/kg香菇多糖)。其中,空白對(duì)照和模型對(duì)照組均投喂普通飼料,其他各藥物組分別投喂含相應(yīng)劑量中藥的飼料。每天投喂2次,每天記錄投喂餌料量,每天投喂量約為魚體質(zhì)量的2%,共投喂60 d。投喂結(jié)束后,空白對(duì)照組腹腔注射橄欖油,模型對(duì)照組和各藥物組腹腔注射30%的CC14,注射劑量為每10g魚體注射0.05ml。禁食72 h,以誘導(dǎo)肝損傷。MS-222麻醉,各組稱質(zhì)量、采集血液和肝組織。

    1.4 香菇多糖的制備及純度測(cè)定

    香菇多糖粗制粉的制備采用水煮醇沉法,略加修改。稱取香菇多糖粗制粉100g加于100ml無菌水中,100℃水浴加熱溶解30 min,待完全冷卻后,350g、20℃離心10min,棄沉淀。上清液用無水分析乙醇沉淀至終濃度為80%,靜置過夜。次日,用2層紗布濾出沉淀,并用無水乙醇洗滌沉淀2~3次。40℃烘箱中烘干沉淀,干燥后研磨過篩,備用。

    采用Dubotls法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定樣品中多糖的含量。精密稱取105℃干燥恒質(zhì)量的葡萄糖10mg,置于100ml容量瓶中定容。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml和1.0ml分置于試管中,各加蒸餾水使體積為2.0ml,再各加5%的苯酚1.0 ml,搖勻,滴加濃硫酸5.0ml,搖勻放置10min.置沸水浴中加熱15 min.冷卻,同時(shí)另取蒸餾水2.0ml,同上操作為空白對(duì)照。在490nm處測(cè)定吸光度,以濃度和吸光度為坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:Y=1.021 9+1.722 5x,R2=0.999。精密稱取2mg香菇多糖提純樣品,溶解后按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測(cè)定的吸光度值為2.638,以回歸方程計(jì)算出樣品中葡萄糖含量為93.82%。

    1.5 生長指標(biāo)的測(cè)定

    飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后,按照以下公式,計(jì)算每組魚相對(duì)增質(zhì)量率、特定生長率和餌料系數(shù)。相對(duì)增質(zhì)量率(RWR)=(Wt- Wo)/Wo×100%,特定生長率(SGR]=(InW- In Wo)/£xl00%,餌料系數(shù)(FCR)=F/(W- WO)×100%,其中,Wt為終體質(zhì)量,Wo為初始體質(zhì)量,t為投喂時(shí)間,F(xiàn)為投喂飼料量。

    1.6 血清生化指標(biāo)的測(cè)定

    試驗(yàn)結(jié)束后,用一次性注射器采集魚尾靜脈血。各組血液樣品4℃靜置2h后,3000 r/min、4℃離心15min分離血清,-20℃保存,備用。按照試劑盒操作說明分別測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和乳酸脫氫酶(LDH)活性。

    1.7 肝組織勻漿生化指標(biāo)的測(cè)定

    將抽完血的魚進(jìn)行解剖,在肝臟右中葉相同部位取肝臟組織,用預(yù)冷的生理鹽水漂洗血液,剪去肝臟表面附著的結(jié)締組織,再用濾紙吸去表面水分,稱質(zhì)量,用眼科剪刀剪碎,移人勻漿管中,加入9倍體積的生理鹽水(體積分?jǐn)?shù)為0. 86%)進(jìn)行勻漿。該勻漿以2 000r/min離心15min,收集上清液,備用。按照試劑盒操作說明分別測(cè)定肝勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)含量和丙二醛(MDA)含量。

    1.8 肝組織中NF-kB /C-Rel、iNOS、IL-lβ、TNF-α、IL-6和IL-8mRNA的表達(dá)水平測(cè)定

    鯉魚處死后,剖取適量肝組織,參照RNAiso Re-agent說明書提取總RNA。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度及純度,以O(shè)D260/OD280值達(dá)到1.8~2.0作為合格標(biāo)準(zhǔn)。以O(shè)ligo(dT)18為引物進(jìn)行RT反應(yīng),合成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)按照TaKaRa公司生產(chǎn)的ExScript TM RT-PCR Kit(Per-fect Real Time:SYBR Green I)說明書進(jìn)行。基因特異引物及內(nèi)參β-actin,引物分別按照鯉NF-kB/C-Rel、iNOS、IL一1β、TNF-a、//-6、//-8和p-actin,基因序列采用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)(表1)。

    1.9 數(shù)據(jù)分析

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,數(shù)據(jù)分析采用SPSS15軟件包中的單因素方差分析(one-way-ANOVA)。

    2 結(jié)果

    2.1 姜黃素、甘草次酸和香菇多糖對(duì)肝損傷建鯉生長指標(biāo)的影響

    60 d的試驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示:與對(duì)照相比,甘草次酸單味用藥及中、高劑量姜黃素+甘草次酸+香菇多糖聯(lián)合用藥能顯著提高建鯉的相對(duì)增質(zhì)量率和特定生長率(P<0.05),顯著降低餌料系數(shù)(P<0.05),姜黃素、香菇多糖單味用藥及低劑量聯(lián)合用藥的效果不明顯(P>0.05):與姜黃素、甘草次酸或香菇多糖單味用藥相比較,姜黃素+甘草次酸+香菇多糖聯(lián)合用藥對(duì)這3個(gè)生長指標(biāo)有顯著作用(P<0.05),隨著聯(lián)合用藥組劑量的升高,效果愈加明顯。

    2.2 姜黃素、甘草次酸和香菇多糖對(duì)肝損傷建鯉生化指標(biāo)的影響

    圖1顯示:30% CCI4-橄欖油腹腔注射建鯉后72 h,血清中GOT、GPT和LDH活性均顯著性高于空白對(duì)照組(P<0.05);各個(gè)用藥組與CC14對(duì)照組相比較,血清中GOT、GPT和IDH活性均顯著下降(P<0.05);與姜黃素、甘草次酸或香菇多糖單味用藥組相比較,姜黃素+甘草次酸+香菇多糖聯(lián)合用藥對(duì)恢復(fù)血清中的GOT、GPT和LDH活性有顯著作用(P<0.05),隨著聯(lián)合用藥劑量的升高,協(xié)同作用愈加明顯。

    從圖2可見.30% CC14一橄欖油腹腔注射建鯉后72 h.肝組織勻漿中GSH含量和SOD活性均顯著低于空白對(duì)照(P<0.05),MDA含量顯著升高(P<0.05);與CC14對(duì)照相比,姜黃素、甘草次酸、聯(lián)合用藥均能顯著促進(jìn)組織中SOD活性及GSH含量水平恢復(fù)(P<0.05),顯著抑制MDA生成(P<0.05),其中,香菇多糖組能顯著提高GSH水平,抑制MDA生成(P<0.05),但對(duì)SOD活性恢復(fù)沒有明顯作用(P>0.05);與姜黃素、甘草次酸或香菇多糖單味用藥相比較,姜黃素+甘草次酸+香菇多糖聯(lián)合用藥對(duì)恢復(fù)肝組織中SOD活性和GSH水平及降低MDA含量有顯著作用(P<0.05),隨著聯(lián)合用藥劑量的升高,作用愈加顯著。

    2.3 姜黃素、甘草次酸和香菇多糖對(duì)建鯉肝組織中炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

    為了考察中藥聯(lián)合用藥對(duì)建鯉肝組織中炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法測(cè)定了NF-kB/C-Rel、iNOS、IL—lβ、TNF-a、IL-6和IL-8 mR-NA相對(duì)含量。結(jié)果(圖3)顯示,30%CC14一橄欖油腹腔注射建鯉后72 h,肝組織中炎性細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)量與空白對(duì)照相比,均顯著升高(P<0.05);與CC14對(duì)照組相比,姜黃素、甘草次酸、聯(lián)合用藥均能顯著抑制NF-kB/C-Rel、iNOS、IL一1β、TNF-α、IL-6和//-8表達(dá)量的升高(P<0.05);與姜黃素、甘草次酸或香菇多糖單味用藥相比較,姜黃素+甘草次酸+香菇多糖聯(lián)合用藥對(duì)恢復(fù)肝組織中炎性細(xì)胞因子的mRNA水平有顯著作用(P<0.05),隨著聯(lián)合用藥劑量的升高,作用愈加顯著。

    3 討論

    CC14誘導(dǎo)建鯉肝組織損傷后,中間代謝產(chǎn)物過氧化三氯甲烷自由基( CC1302·)通過攻擊肝細(xì)胞膜上磷脂分子引起脂質(zhì)過氧化,損傷肝細(xì)胞,導(dǎo)致肝組織中的生化指標(biāo)發(fā)生變化。GPT、GOT和LDH是主要功能酶,肝細(xì)胞受損或壞死時(shí),這些酶會(huì)進(jìn)入血液,使血清中酶水平顯著提高。同時(shí)脂質(zhì)過氧化會(huì)導(dǎo)致SOD活性、GSH含量下降,MDA含量增加。本研究中采用30% CCI4-橄欖油腹腔注射建鯉后,發(fā)現(xiàn)姜黃素、甘草次酸、香菇多糖單味用藥及聯(lián)合用藥均可以降低CC14誘導(dǎo)的建鯉血清中酶活性和肝組織中MDA含量,恢復(fù)肝組織中SOD和GSH水平,說明姜黃素、甘草次酸和香菇多糖不管是單獨(dú)使用還是聯(lián)合用藥均有保護(hù)肝組織的作用。研究結(jié)果還表明,姜黃素+甘草次酸+香菇多糖聯(lián)合用藥與3種中藥單獨(dú)使用相比較,降低肝損傷的作用更顯著,且具有劑量依懶性,說明三者聯(lián)合使用具有協(xié)同保護(hù)作用。

    另一方面,CC1302·可激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-KB,導(dǎo)致炎細(xì)胞大量釋放炎性介質(zhì)(例如細(xì)胞因子IL一1β、TNF-a、IL-6及IL-8等),介質(zhì)進(jìn)一步活化中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞,通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致肝細(xì)胞變性死亡¨18-19]。抑制有關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá),可以有效降低肝損傷。本研究結(jié)果顯示,30% CCI4一橄欖油腹腔注射建鯉后,肝組織中NF-KB/C-Rel、iNOS、IL一1β、TNF-a、IL-6和IL-8 mRNA表達(dá)量顯著增加,而姜黃素、甘草次酸和香菇多糖均能抑制相關(guān)因子的表達(dá)上調(diào),而聯(lián)合用藥的效果更為顯著,表明姜黃素、甘草次酸和香菇多糖能通過抑制NF-KB/C-Rel的活化以及下調(diào)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)來降低CC14誘導(dǎo)的肝損傷,具有肝保護(hù)作用,3種藥聯(lián)合使用對(duì)抑制細(xì)胞因子表達(dá)具有協(xié)同作用。

    臨床上,甘草被廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方配伍里,甘草對(duì)增加溶解性,提高有效成分利用率,增強(qiáng)藥效和降低毒性有顯著作用。甘草次酸作為甘草的主要有效成分之一,也表現(xiàn)出與甘草類似的調(diào)和性質(zhì)。常明向等發(fā)現(xiàn)相較于姜黃素或甘草次酸單獨(dú)用藥,兩者聯(lián)合用藥藥效呈現(xiàn)相加或增強(qiáng)作用。周京輝等也發(fā)現(xiàn),甘草次酸能加強(qiáng)姜黃素對(duì)HepG-2、MCF-7、A549癌細(xì)胞增殖的抑制作用,而且兩者在癌細(xì)胞的增殖抑制方面表現(xiàn)出協(xié)同作用。這些發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)果具有一致性,姜黃素、甘草次酸和香菇多糖聯(lián)合用藥對(duì)CC14誘導(dǎo)的建鯉肝損傷具有協(xié)同保護(hù)作用,這除了與它們自身的藥性作用有關(guān)外,可能還與甘草次酸的調(diào)和特性及香菇多糖能提高機(jī)體免疫力的作用有關(guān),這也表明姜黃素、甘草次酸和香菇多糖聯(lián)合用藥的合理性和科學(xué)性。

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