豬非典型性瘟病毒與豬流行性腹瀉病毒雙重PCR方法的建立與應(yīng)用

楊曉宇 徐雷 殷鑫歡 張繼宗 徐志文 朱玲

摘要：為了快速準(zhǔn)確地檢測出豬非典型性瘟病毒（APPV）與豬流行性腹瀉病毒（PEDV），根據(jù)GenBank中發(fā)布的PEDV S2基因和APPV NS3基因的序列，分別選取PEDV S2基因和APPV NS3基因的保守序列，設(shè)計、合成了1對特異性引物。通過對體系進行優(yōu)化，分別擴增出190 bp和500 bp的特異性片段。建立的雙重Rrr-PCR方法對豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬輪狀病毒（RV）的檢測均為陰性。對PEDV和APPV的最低檢出量分別為1μl 2.65x103和1μl 3.56x104，對四川遂寧、眉山等地采集到的腹瀉、肌肉震顫的病料進行檢測，PEDV、AP-PV陽性病料檢出率分別為41.18%和11.76%，經(jīng)分別與特異性檢測APPV和PEDV的單一RT-PCR法檢測結(jié)果進行比較分析，符合率均為100%。與單一RT-PCR檢測方法具有相同特異性和重復(fù)性，可用于臨床檢測。

關(guān)鍵詞： 豬非典型性瘟病毒：豬流行性腹瀉病毒：雙重RT-PCR

中圖分類號：S852.65+1

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號： 1000-4440（2018）05-1081-06

豬非典型性瘟（APP）是豬非典型性瘟病毒（A—typical porcine pestivirus virus，APPV）引起的仔豬先天性震顫（俗稱“抖抖病”），APP在臨床上可以導(dǎo)致出生仔豬全身肌肉震顫、八字腿、嚴(yán)重可導(dǎo)致全身震顫，吮乳困難。規(guī)?；B(yǎng)殖場豬發(fā)病率在5%左右。先天性震顫（Congenital tremor）可以分為A、B兩種類型，B型沒有明顯的組織損傷，A型有明顯的大腦脊柱的組織損傷。根據(jù)腦和脊柱的受傷程度可將A型分為I—V5種亞型，其中A-III型先天性震顫是只有在長白豬品種中存在的遺傳性疾病，其特征是髓鞘缺失，少突細胞減少;A-IV型，其特點是腦脊髓髓鞘形成過少引起的;A-V型病例是由敵百蟲中毒引起，常導(dǎo)致小腦發(fā)育不全;只有A-I與A-II是傳染病，A-I型是由豬瘟病毒（CSFV）引起的，但是A—II型的病因此前尚未可知。Hause等驗證了APPV是引起仔豬先天性震顫的主要病原，通過分子和血清學(xué)檢測，證明了APPV在美國豬群的廣泛存在，隨后，德國、荷蘭、奧地利等多個國家先后發(fā)現(xiàn)豬群存在APPV流行。豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV）是引起豬流行性腹瀉（Porcineepidemic diarrhea，PED）的主要病原，PED是臨床上引起水樣腹瀉、嚴(yán)重腸炎、嘔吐、脫水和食欲下降為癥狀的高度接觸性腸道傳染病。由于其傳染性強和較短的病程，哺乳仔豬的死亡率可達50%～ 90%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的損失。1977年，在比利時養(yǎng)豬場分離出一種與腹瀉相關(guān)的新型冠狀病毒樣顆粒，隨后在中國、加拿大、德國、日本、韓國等國家相繼報道了該病毒。2009年以來，韓國、日本相繼有PED發(fā)生，2010年冬季以來，中國也大規(guī)模爆發(fā)PED。

APPV和PEDV都是RNA病毒，均可導(dǎo)致出生仔豬發(fā)病。母源抗體是保護仔豬預(yù)防PEDV的重要手段之一。APPV的感染導(dǎo)致仔豬吮乳困難，嚴(yán)重影響仔豬對母乳的攝入，從而導(dǎo)致母源抗體對出生仔豬的保護力不足。為了進一步研究APPV和PEDV兩者之間的感染狀況與疾病的損傷，本試驗建立了同時檢測APPV和PEDV的雙重RT-PCR方法，為疾病診斷提供一個快速、靈敏、高效的檢測方法，為疾病防控提供合理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒和病料

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬非典型性瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒（Rotavirus，RV）、大腸桿菌（Escherichia coli）均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心保存;病料（腸道、腸系膜淋巴結(jié)、腦、腹股溝淋巴結(jié)）采自四川眉山、遂寧、宜賓、瀘州、自貢等各市規(guī)模化養(yǎng)豬場。

1.2 主要試劑

DL2000 DNA Marker、RNAiso plus、Taq Hs、10×Reaction Buffer（Mg2+ free）、dNTP Mix、ddH2 0、pMD19-T載體均購自寶生物工程（大連）有限公司，DNA凝膠回收試劑盒（DNA Gel Extraction Kit）和質(zhì)粒提取試劑盒（Plasmid Kit I）購自O(shè)mega公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)表的PEDV S2基因（登錄號：JQ638513.1）和APPV NS3基因（登錄號：MF069133.1）相關(guān)序列，選取其保守序列，并通過NCBI進行特異性比對，分別設(shè)計了一對特異性引物（表1），由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 樣品處理及核酸的提取

將獲得的PEDV和APPV樣品分別編號，將編號的樣品在研磨器中多點取樣，剪碎后加入適量的液氮，研磨成粉末狀后加生理鹽水形成研磨液，-20℃反復(fù)凍融3次后備用。采用Trizol法提取病料的總RNA，隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。轉(zhuǎn)錄體系（10μl）為：總RNA 3.0μl，5xPrimescript buffer2.0μl，Primer script RT en-zyme Mix1 0.5μl，Oligo dT Primer 0.5μl，Random 6mers 0.5μl，RNase free dH20 3.5μl。反轉(zhuǎn)錄的條件是：37℃15min，85℃30s，將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用所設(shè)計的引物對模板進行擴增。擴增體系為（25μl）：總RNA2.0μl，1OxReaction buffer 2.5μl，dNTP Mixl.0μl，Taq Hs 0.5μl，dd H20 18.0μl，上下游引物各0.5μl。反應(yīng)條件為：95℃4 min;95℃30 s，58℃30s，72℃30s，30個循環(huán)：72℃7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 目的片段的克隆及測序

將擴增出來的單一條帶用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細胞中。將陽性克隆送到生工生物工程（上海）有限公司測序，并將陽性菌擴大培養(yǎng)后用質(zhì)粒提取試劑盒提取PEDV、APPV質(zhì)粒，作為后續(xù)試驗的陽性模板。

1.6 雙重RT-PCR的建立

1.6.1 Mg2+、Taq Hs、dNTP Mix用量的優(yōu)化 在單一PCR的基礎(chǔ)上，分別改變單一變量對PEDV和APPV的混合模板進行檢測。體系為25μl，分別調(diào)整Mg2+、Taq Hs、dNTP Mix的用量，選取Mg2+的用量依次為0.5μ1、l.0μl、1.5μ1、2.0μl、2.5μl和3.0μl，選取Taq Hs的用量依次為0.1μl、0.2μ1、0.3μ1、0.4μl、0.5μl和0.6μl，選取dNTP Mix的用量依次為1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl、3.0μl和3.5μl。進行雙重RT-PCR擴增，反應(yīng)程序同方法1.4單一PCR擴增。在保證單一變量的情況下，選取目的條帶效果最好的試劑用量。

1.6.2 引物及退火溫度的優(yōu)化 在優(yōu)化Mg2+、TaqHs、dNTP Mix用量的基礎(chǔ)上，單一改變引物用量和退火溫度，其引物用量選取1.0μl、1.5μl、2.0μl和2.5μ1，退火溫度選取50.8℃、51.8℃、53.1℃、58.6℃、59.9℃、61.0℃和61.6℃。用來篩選最適引物用量和退火溫度。

1.6.3 特異性試驗在上述優(yōu)化的基礎(chǔ)上，用建立的雙重RT-PCR方法對PRRSV、CSFV、RV、PEDV、APPV進行特異性檢測，設(shè)立陰性對照，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6.4 重復(fù)性試驗對APPV和PEDV陽性病料進行抽提，以反轉(zhuǎn)錄好的cDNA為模板，用建好的雙重RT-PCR方法分別進行批間、批內(nèi)重復(fù)性試驗，已驗證所建立方法的穩(wěn)定性。

1.6.5 敏感性試驗 用質(zhì)粒提取試劑盒提取PEDV、APPV質(zhì)粒，用核酸蛋白儀測定所構(gòu)建的陽性質(zhì)粒的質(zhì)量濃度，計算出模板的拷貝數(shù)。在上述優(yōu)化體系優(yōu)化后，將模板倍比稀釋進行雙重RT-PCR。

1.6.6 符合性檢測 用本研究建立的雙重RT-PCR方法對四川遂寧、眉山等地采集的病料進行雙重RT-PCR和單- PCR的檢測，并對結(jié)果、檢出率和符合率進行對比分析。

2 結(jié)果

2.1 Mg2+、Taq Hs、dNTP Mix用量的優(yōu)化

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，當(dāng)Mg2+、Taq Hs、dNTP Mix依次為2.5μ1、0.6μl、1.0μl時，擴增出來的2條條帶最為清晰（圖l、圖2、圖3）。

2.2 引物及退火溫度的優(yōu)化

優(yōu)化結(jié)果顯示為，當(dāng)引物用量為lμl（圖4），退火溫度為58.6℃時（圖5），該方法同時擴增出來的APPV和PEDV特異性條帶亮度相對最清晰。

2.3 特異性試驗

用所建立的雙重RT-PCR對PRRSV、CSFV、RV、APPV、PEDV進行檢測，結(jié)果（圖6）顯示，PRRSV、CSFV、RV均為陰性，該方法能特異性檢測出APPV和PEDV，證明該方法具有很強的特異性。

2.4 重復(fù)性試驗

用所建立的雙重RT-PCR對陽性模板進行批間與批內(nèi)重復(fù)性檢測，結(jié)果（圖7）顯示陽性模板所擴增出來的目的條帶完全相同，證明該方法有良好的重復(fù)性。

2.5 敏感性試驗

采用建立的雙重RT-PCR的方法和優(yōu)化的體系對倍比稀釋后的模板進行擴增，結(jié)果（圖8）顯示PEDV的最低檢出量為lμl 2.65×l05，APPV的最低檢出量為lμl 3.56x104，證明該方法敏感性較強。

2.6 符合性檢測

對34份采自四川遂寧、眉山等地的疑似病料進行雙重RT-PCR和單一PCR的檢測，結(jié)果（表2）顯示檢出PEDV陽性病料14份，單一感染陽性率41.18%。檢出APPV陽性病料4份，單一感染陽性率11.76%。檢出二者混合感染l份，檢出率2.94%。雙重RT-PCR與單一PCR檢測結(jié)果進行比較分析，符合率均為100%（表3）。

3 討論

最近幾年，PEDV的感染率越來越高，由于其傳染性強和較短的病程，哺乳仔豬的死亡率可達50%～90%.給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的損失。新生仔豬的免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全，對其進行PEDV疫苗注射無法誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的體液免疫和腸道黏膜的免疫，所以母源抗體對新生仔豬尤為重要。初乳中免疫球蛋白主要為IgG，乳汁中主要為SIgA，乳汁的黏膜免疫對新生仔豬保護力已經(jīng)被試驗證明。新生仔豬需要足夠的免疫乳汁來抵抗PEDV感染，所以新生仔豬能夠喝到初乳和乳汁尤為重要。先天性震顫是新生仔豬常見的一種現(xiàn)象，會導(dǎo)致新生仔豬全身肌肉震顫，盡管搖動本身并不直接導(dǎo)致死亡，但震顫可以妨礙仔豬發(fā)現(xiàn)奶嘴，從而導(dǎo)致仔豬喝不到足夠的初乳和乳汁，嚴(yán)重的可導(dǎo)致發(fā)育遲緩或死亡。自2010年，新一輪PEDV在全球流行，作者認(rèn)為，造成PEDV新一輪流行的原因除了PEDV變異株的出現(xiàn)，規(guī)?；B(yǎng)殖場疫苗免疫程序不當(dāng)，現(xiàn)行疫苗無法對其進行有效的保護之外，出生仔豬是否能夠得到母源抗體的保護也是一個很重要的方面。而非典型性瘟病毒恰恰會導(dǎo)致出生仔豬全身震顫，妨礙仔豬發(fā)現(xiàn)奶嘴。有報道，中國新生仔豬先天性震顫在規(guī)?；i場發(fā)病率約為5%～6% ，在大多數(shù)受到新生仔豬先天性震顫影響的豬場中，APPV的發(fā)現(xiàn)率在1%～20%。本次試驗建立的雙重RT-PCR方法，通過優(yōu)化反應(yīng)體系和試劑用量，可以同時檢測出PEDV、APPV。相較于單一RT-PCR方法更為簡單、省時、省力，同時也節(jié)約了檢測試劑的損耗。根據(jù)PEDV S2基因和APPV NS3基因的保守序列設(shè)計引物，保證了擴增出來的目的片段高度保守，防止了因為病毒的變異而導(dǎo)致試驗結(jié)果的假陰性。研究中所設(shè)計的2對引物分別能夠擴增出190 bp和500 bp的目的條帶，與設(shè)計的引物長度一致，證明了該方法的特異性。對PEDV和APPV的最低檢出量分別為lμl 2.65xl05和1μl 3.56x104，具有較高的靈敏性。對樣品進行符合性檢測，符合率為100%，證明該方法的可行性。相較于單一RT-PCR方法，省時、省力、特異、敏感，對PEDV和APPV混合感染的檢測及流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。