萬古霉素發(fā)酵工藝研究進(jìn)展

張菊芳

摘 要：萬古霉素是一種糖肽類抗生素，對(duì)革蘭氏陽性菌有一定的抑制作用。其發(fā)酵工藝比較特殊，影響萬古霉素發(fā)酵的因素很多，主要包括發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)條件，以及菌種本身的影響。本次研究結(jié)合實(shí)際發(fā)酵情況對(duì)各種影響因素進(jìn)行分析，致力于探究萬古霉素的工藝應(yīng)用要求。

關(guān)鍵詞：萬古霉素；發(fā)酵工藝；碳（C）源；溶解氧

中圖分類號(hào)：TQ927 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1003-5168（2018）07-0146-02

Progress in the study of vancomycin fermentation process

ZHANG Jufang

（Hangzhou Sino-US Huadong Pharmaceutical Co.， Ltd.，Hangzhou Zhejiang 310000）

Abstract： Vancomycin is a glycopeptide antibiotic， which has a certain inhibitory effect on Gram-positive bacteria. The fermentation technology is very special， which has many influence factors on vancomycin fermentation， mainly including fermentation medium and fermentation conditions， as well as the influence of strain itself. This study combined with the actual conditions of fermentation to analyze the various influencing factors and to explore the application requirements of vancomycin.

Keywords： vancomycin；fermentation process；carbon （C） source；dissolved oxygen

萬古霉素的抗生素屬于一種糖肽類抗生素，根據(jù)實(shí)際應(yīng)用情況可知，該藥物是當(dāng)期臨床研究中治療感染疾病的首選藥物。根據(jù)實(shí)際治療要求可知，藥物本身是抵抗耐藥細(xì)菌的最后一道防線，本身有一定的抗菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，受到廣泛的關(guān)注和重視。

1 影響萬古霉素發(fā)酵的因素及實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用

萬古霉素是由McCormick等于1956年從印度尼西亞土壤中篩選到的一株被稱為東方擬無枝酸菌的發(fā)酵液中分離得到的具有抗革蘭氏陽性菌的一種糖肽類抗生素[1]，同期由美國禮萊公司開發(fā)成產(chǎn)品，并于1958年獲FDA批準(zhǔn)上市。萬古霉素發(fā)酵過程受到多種因素的影響，包括碳（C）源、氮（N）源、溫度、pH和溶解氧等，具體影響如下。

1.1 碳（C）源

碳（C）源在細(xì)胞供給及其他方面具有關(guān)鍵性作用。碳（C）源是既是一種碳素來源又能為生長代謝提供能量?？紤]到生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用情況，為提高發(fā)酵單位產(chǎn)量，對(duì)碳（C）源種類的優(yōu)化篩選就變得尤為重要。在進(jìn)行碳（C）源優(yōu)化過程中，要了解配方中碳（C）源的組成部分，分析不同碳（C）源起到的作用是否相同。通過唯一碳（C）源實(shí)驗(yàn)，對(duì)多種碳（C）源進(jìn)行單一考察，篩選出對(duì)菌體生長和產(chǎn)抗有促進(jìn)作用的碳（C）源，如淀粉、糊精、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、豆油和甘油等。當(dāng)篩選出對(duì)生長和代謝有促進(jìn)作用的碳（C）源后，可進(jìn)行多種碳（C）源的組合考察以獲得發(fā)酵最高產(chǎn)量。在發(fā)酵過程中，要考慮到菌體生長和代謝產(chǎn)物兩方面的要求。為促進(jìn)早期菌體生長，可選用像葡萄糖、蔗糖等快速利用的碳（C）源；而為了產(chǎn)抗和維持菌體后期的營養(yǎng)，可采用糊精、淀粉類等緩釋碳（C）源，最終實(shí)現(xiàn)快速而穩(wěn)定發(fā)酵，使產(chǎn)量達(dá)到最高。而甘油則作為產(chǎn)物合成的特殊因子，在發(fā)酵過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

1.2 氮（N）源

氮（N）源屬于微生物菌體細(xì)胞物質(zhì)，促進(jìn)菌體生長。氮素來源有很多，可分為有機(jī)氮（N）源和無機(jī)氮（N）源。有機(jī)氮（N）源又包括兩種：速效氮（N）源，如蛋白胨、酵母浸出粉等；緩釋氮（N）源，如黃豆粉、蛋白粉、酵母粉等。復(fù)合有機(jī)氮（N）源往往是一些緩釋氮（N）源，其含有的成分較復(fù)雜，有些氮（N）源還含有特殊的生長因子或維生素等物質(zhì)，對(duì)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提高起著關(guān)鍵性作用。而無機(jī)氮（N）源則主要有硝酸鹽、氨水等。無機(jī)氮（N）源通常被當(dāng)作一種輔助氮源，但其作用也較為關(guān)鍵。如氨水在發(fā)酵過程中除了提供N素來源，還起到維持pH的作用。

在生物合成抗生素的整個(gè)過程中，如何合理有效利用氮（N）源，實(shí)現(xiàn)合理化和有序化應(yīng)用是關(guān)鍵。萬古霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源分有機(jī)和無機(jī)兩種，有機(jī)氮源的整體化作用較為突出，具體考察的氮（N）源有：大豆蛋白胨、酵母蛋白胨、大豆蛋白粉、黃豆粉、酵母粉、麩質(zhì)粉和棉籽餅粉等。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酵母粉、麩質(zhì)粉不能被菌體利用，而棉籽餅粉和大豆蛋白粉能使菌體生長速度加快，發(fā)酵周期變短，抗生素的合成周期也縮短，提升發(fā)酵優(yōu)勢。而蛋白胨類在發(fā)酵前期能促進(jìn)菌體快速生長，但后期菌體活力不夠。因此，培養(yǎng)基的選擇可將速效氮（N）源蛋白胨和緩釋氮（N）源棉籽粉進(jìn)行混搭培養(yǎng)，最終使效價(jià)得到提高。

1.3 溫度和pH值

菌體生長繁殖及產(chǎn)物合成等都是以酶的催化作用為基礎(chǔ)，而酶的催化與溫度和pH相關(guān)，以動(dòng)力學(xué)因素為前提，如何進(jìn)行有序化控制成為研究的關(guān)鍵。在一定范圍內(nèi)，溫度值不斷提升，酶的活性也隨之提升，當(dāng)超過其最高值后就會(huì)對(duì)酶本身產(chǎn)生破壞作用，因此要做好酶的反應(yīng)速率評(píng)估工作。在發(fā)酵過程中，菌體生長和產(chǎn)物代謝其最適合的溫度很可能是不一致的，因此，在速率分析過程中，為了避免活性因素受到影響，整個(gè)發(fā)酵過程要維持合適的菌體生長環(huán)境，以最佳溫度為基礎(chǔ)，提前確定應(yīng)用條件。

1.4 溶解氧

抗生素產(chǎn)生菌多以異養(yǎng)好氧型微生物為主。根據(jù)生長繁殖及抗生素的實(shí)際應(yīng)用情況可知，要確定菌體對(duì)溶氧的需求量。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，菌量上升，菌體對(duì)氧的需求量也逐漸提升。從王會(huì)會(huì)、栗婷婷和趙建輝[2]《萬古霉素發(fā)酵工藝研究進(jìn)展》可知，以菌種本身作為基礎(chǔ)，高產(chǎn)菌株和發(fā)酵條件是不斷變化的，抗生素發(fā)酵單位容易受到影響。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在萬古霉素發(fā)酵過程中，菌體在不同培養(yǎng)基中其菌絲狀態(tài)、發(fā)酵液粘稠度等都不一樣，引起的氧傳遞不一樣，最終影響菌體生長和代謝。因此，以設(shè)備供氧和通氣量為前提，根據(jù)菌體的特征可以選用合適的培養(yǎng)基來改善發(fā)酵液的氧傳遞。

溶氧濃度是發(fā)酵過程中的一個(gè)綜合性參數(shù)，以現(xiàn)有監(jiān)控機(jī)制和管理形式作為基礎(chǔ)，需要對(duì)整個(gè)發(fā)酵過程的溶氧含量進(jìn)行監(jiān)測，溶氧過高或者過低都會(huì)產(chǎn)生不良影響。Clark等通過研究溶氧對(duì)萬古霉素發(fā)酵單位的影響，指出只有在溶解氧充足的情況下萬古霉素才能正常合成；當(dāng)溶氧不足時(shí)，氧的同化作用不足以滿足萬古霉素生物合成所需的能量，限制了產(chǎn)物的生成，降低了萬古霉素發(fā)酵單位；發(fā)酵過程中溶氧過低，菌體生長代謝受到抑制，最終影響發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。而溶氧偏高則又說明發(fā)酵存在多種問題：第一，營養(yǎng)物質(zhì)缺乏導(dǎo)致耗氧量降低，溶氧回升，這時(shí)需要補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)；第二，菌體本身活力不夠，菌體老化自溶導(dǎo)致物質(zhì)釋放，需氧量降低導(dǎo)致溶氧回升。因此，控制合適的溶氧是非常必要的。

2 萬古霉素抗性菌株的選擇

耐萬古霉素突變菌株的選育是獲得高產(chǎn)菌株的一種有效途徑。紫外誘變是菌種選育的常用方法，而為了解除萬古霉素發(fā)酵過程中產(chǎn)物的反饋抑制，可將誘變后的菌落涂布于不同萬古霉素濃度梯度平板上篩選其抗性菌株。具體考察方法和結(jié)果見表1。

誘變后不同菌株對(duì)萬古霉素的抗性如表2所示。

由此可證明，紫外誘變加上萬古霉素抗性篩選是獲得高產(chǎn)菌株的最佳方法。同時(shí)，不同的菌株其耐萬古霉素的能力是不一樣的。

3 結(jié)語

國內(nèi)外科研工作者對(duì)萬古霉素高產(chǎn)菌株的選育非常重視，除了菌種選育外，還致力于提升抗生素發(fā)酵產(chǎn)量及質(zhì)量的提升。對(duì)于發(fā)酵工藝可進(jìn)行多方面的化，結(jié)合目前不同的培養(yǎng)基原料，篩選合適的培養(yǎng)基原料，同時(shí)對(duì)發(fā)酵的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終得到高產(chǎn)量的萬古霉素。

參考文獻(xiàn)：

[1]Ramakrishnan Nagarajan. Antibacterial activities and modes of action of vancomycin and related glycopeptides [J].Antimicrobial agents and chemotherapy，1991（4）：605-609.

[2]王會(huì)會(huì)，栗婷婷，趙建輝.萬古霉素發(fā)酵工藝研究進(jìn)展[J].煤炭與化工，2013（5）：56-58.