白術(shù)七物顆粒對(duì)結(jié)腸慢傳輸型便秘小鼠胃腸功能的影響及機(jī)制

王滿　劉妮妮　田萍

摘要目的：研究白術(shù)七物顆粒對(duì)結(jié)腸慢傳輸型便秘小鼠胃腸功能的影響及相關(guān)機(jī)制。方法：40只ICR小鼠以灌胃復(fù)方地芬諾酯法構(gòu)建結(jié)腸慢傳輸型便秘模型，以10只灌胃等量生理鹽水為空白組。將建模成功的38只小鼠隨機(jī)分為4組，分別為模型組與對(duì)照組，每組9只，觀察組低劑量組與高劑量組，每組10只。低/高劑量實(shí)驗(yàn)組分別予以白術(shù)七物顆粒生藥量163 g/kg、652 g/kg灌胃，對(duì)照組予以20 g/kg枸櫞酸莫沙必利溶液灌胃，模型組和空白組均灌胃等量生理鹽水，1次/d，各組均連續(xù)干預(yù)14 d，末次給藥的同時(shí)各組均給予1 mL納米碳混懸液。干預(yù)結(jié)束后觀察各組小鼠排便情況，測(cè)定腸道酶活性，免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織中5羥色胺4（5HT4）、血管活性腸肽（VIP）、一氧化氮（NO）、P物質(zhì)（SP）表達(dá)情況。結(jié)果：與空白組比較，模型組小鼠第1次排黑便時(shí)間延長(zhǎng)，排便粒數(shù)減少，糞便總重量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；與模型組比較，對(duì)照組和觀察組低/高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠第1次排黑便的時(shí)間縮短，排便粒數(shù)增加，糞便總重量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；且低/高劑量實(shí)驗(yàn)組組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。與空白組比較，模型組小鼠腸道蛋白酶和纖維素酶活性降低，木聚糖酶活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；與模型組比較，對(duì)照組與低劑量、高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠蛋白酶和纖維素酶活性升高，木聚糖酶活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），且低/高劑量實(shí)驗(yàn)組組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。與空白組比較，模型組結(jié)腸組織中VIP、NO表達(dá)量增加，5HT4、SP表達(dá)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；與模型組比較，對(duì)照組和觀察組低/高劑量實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸組織中VIP、NO表達(dá)量減少，5HT4、SP表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；且觀察組低/高劑量實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸組織中VIP、NO、5HT4、SP表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。結(jié)論：白術(shù)七物顆?？烧{(diào)控結(jié)腸慢傳輸型便秘小鼠腸道相關(guān)酶活性，改善胃腸功能，可能與調(diào)控結(jié)腸組織中5HT4、VIP、NO、SP蛋白表達(dá)相關(guān)。

關(guān)鍵詞結(jié)腸慢傳輸型便秘；白術(shù)七物顆粒；胃腸功能；腸道酶活性

Effects and Mechanism of Baizhu Qiwu Granule on Gastrointestinal Function in Colon Slow Transit Constipation Mice

Wang Man，Liu Nini，Tian Ping，Chen Xiaolan

（Department of Anus and Intestine Surgery，Shenzhen the Second People′s Hospital，Shenzhen 518032，China）

AbstractObjective：To investigate the effects of Baizhu Qiwu granule on gastrointestinal function in colon slow transit constipation mice and its related mechanisms.Methods：A total of 40 ICR mice were constructed colon slow transit constipation mice model by given compound diphenoxylate orally，and 10 cases of mice were given equal amount of normal saline orally as blank group38 cases of successful constipation models were randomly divided into model group （n=9），positive control group （n=9） and low/high dose test group （n=10，test groupsL/H）.The test groupsL/H were given orally 163 g/kg and 652 g/kg respectively of Baizhu Qiwu granule raw medicine，and the positive control group was given orally 2 g/kg mosapride citrate tablets.The model group and the blank group were given equal amount of normal saline orally once daily for 14 d continuously，and 1 mL nano carbon suspension was given at the same time when the last administration was given in each group.After intervention，the defecation of mice in each group was observed，and the activities of intestinal enzyme were measured.Immunohistochemistry was used to detect the expression of 5hydroxytryptamine 4 （5HT4），vasoactive intestinal peptide （VIP），nitric oxide （NO） and P substance （SP） in colon tissue.Results：Compared with the blank group，the time of first time black stool in the model group prolonged，and the number of defecation particles decreased.The total weight of feces decreased （P<005）.Compared with the model group，the time of first time black stool in the positive control group and the test groupsL/H shortened，and the number of defecation particles increased.The total weight of feces increased （P<005）.There was significant difference between test groupL and test groupH （P<005）.Compared with the blank group，the activity of intestinal protease and cellulase of the model group decreased and the activity of xylanase increased （P<005）.Compared with the model group，the activity of protease and cellulase in the positive control group and the test groupsL/H increased，the activity of xylanase decreased （P<005）.The difference between test groupL and test groupH was significant （P<005）.Compared with the blank group，the expression of VIP and NO in the colon tissue of the model group increased and the expression of 5HT4 and SP decreased （P<005）.Compared with the model group，the expression of VIP and NO in the colon tissues of the positive control group and the test groupL/H decreased，and the expression of 5HT4 and SP increased （P<005）.The difference between test groupL and test groupH in the expression of VIP，NO，5HT4 and SP proteins was significant （P<005）.Conclusion：Baizhu Qiwu granule can regulate the activity of intestinal related enzymes in colon slow transit constipation mice and improve the gastrointestinal function，which may be related to the regulation of the expression of 5HT4，VIP，NO and SP proteins in colon tissue.

Key WordsColon slow transit constipation； Baizhu Qiwu granule； Gastrointestinal function； Intestinal enzyme activity

中圖分類號(hào)：R25635文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.040

便秘是常見(jiàn)的消化道疾病，結(jié)腸慢傳輸型便秘屬于功能性便秘的一種，多因結(jié)腸傳輸功能降低導(dǎo)致腸道內(nèi)容物在腸腔內(nèi)傳輸緩慢，患者常出現(xiàn)排便次數(shù)減少、排便困難、腹脹以及無(wú)便意等臨床癥狀，且該病病程較長(zhǎng)，病情極易反復(fù)，給患者生活帶來(lái)極大的困擾和不便[12]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為結(jié)腸慢傳輸型便秘與肝、脾、胃、大腸等臟器功能失調(diào)有一定聯(lián)系，主要病機(jī)為陽(yáng)氣虧虛、陰血不足、脾虛氣弱致大腸傳導(dǎo)失司，常用的攻下法耗氣傷液，加重病情[34]。結(jié)腸慢傳輸型便秘屬于慢性便秘，因此應(yīng)在中醫(yī)辨證論治的基礎(chǔ)上結(jié)合益氣養(yǎng)陰、行氣運(yùn)下的治療法則[5]。本研究通過(guò)構(gòu)建結(jié)腸慢傳輸型便秘小鼠模型，并觀察中藥白術(shù)七物顆粒對(duì)模型小鼠胃腸功能的影響，初步探討其作用機(jī)制，為臨床用藥提供依據(jù)。

1材料與方法

11材料

111動(dòng)物清潔級(jí)ICR小鼠50只，4周齡，雌雄對(duì)半，體重18～22 g，購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）20120001，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，自由飲食。

112藥物白術(shù)七物顆粒（方為：生白術(shù)、木香、烏藥、檳榔、沉香、生地黃、升麻，全方生藥量125 g）；復(fù)方地芬諾酯片（長(zhǎng)春長(zhǎng)紅制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：552001）；枸櫞酸莫沙必利片（魯南貝特制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：110511）；納米碳混懸液（重慶萊美藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20140022）。

113試劑與儀器5羥色胺4（5HT4）、血管活性腸肽（VIP）、一氧化氮（NO）、P物質(zhì)（SP）抗體，美國(guó)Santa Cruz公司等；DS425P電子天平，上海寺崗電子有限公司；CUT4062型石蠟切片機(jī)，沈陽(yáng)益得電子有限公司；Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter有限公司；CKX31熒光倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司；725型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；MetaMorph圖像分析系統(tǒng)，美國(guó)Media Cybernetics公司等。

12方法

121結(jié)腸慢傳輸型便秘小鼠模型構(gòu)建[6]及分組小鼠造模前禁食12 h，根據(jù)體重及性別隨機(jī)選取40只小鼠予以灌胃復(fù)方地芬諾酯50 mg/kg，另外10只小鼠為空白組，予以灌胃等量生理鹽水，連續(xù)灌胃30 d。通過(guò)墨汁實(shí)驗(yàn)法觀察小鼠首次排黑便時(shí)間及灌服納米碳混懸液后，20 h內(nèi)排便次數(shù)，造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為首次排黑便時(shí)間明顯長(zhǎng)于空白組，排便次數(shù)明顯少于正常組，將建模成功的38只小鼠隨機(jī)分為4組，分別為模型組與對(duì)照組，每組9只，觀察組低劑量組與高劑量組，每組10只。

122干預(yù)方法低/高劑量觀察組分別予以白術(shù)七物顆粒生藥量163 g/kg、652 g/kg灌胃，對(duì)照組給予20 g/kg枸櫞酸莫沙必利片，模型組和空白組均予以等量生理鹽水，1次/d，各組均連續(xù)灌胃14 d。各組均于末次灌胃前禁食12 h，將1 mL納米碳混懸液與藥液混合后灌胃。

123檢測(cè)指標(biāo)與方法

1231各組小鼠排便情況末次藥物干預(yù)結(jié)束后觀察各組小鼠第1次排黑便的時(shí)間，計(jì)數(shù)12 h內(nèi)小鼠排便的粒數(shù)，稱重小鼠糞便總重量。

1232各組小鼠腸道酶活性干預(yù)結(jié)束后斷頭處死各組小鼠，無(wú)菌切取小鼠結(jié)腸段，并收集其結(jié)腸段中的內(nèi)容物，稱取部分內(nèi)容物，用無(wú)菌生理鹽水稀釋均勻后，40 ℃水浴30 min，以3 000 rpm/min離心15 min，取上清，用福林酚法測(cè)定上清中蛋白酶活性，用二硝基水楊酸（DNS）比色法測(cè)定纖維素酶和木聚糖酶活性[7]。

1233免疫組化染色[8]觀察小鼠結(jié)腸組織中5HT4、VIP、NO、SP表達(dá)情況將上述切取的結(jié)腸組織用石蠟包埋后制成切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后，采用免疫組化法檢測(cè)組織中5HT4、VIP、NO、SP蛋白表達(dá)情況：石蠟切片復(fù)溫，分別滴加5HT4、VIP、NO、SP一抗，37 ℃下孵育30 min，經(jīng)PBS洗滌，3 min/次，洗3次；滴加二抗，37 ℃下孵育20 min，經(jīng)PBS洗滌，3 min/次，洗3次；滴加DAB染色液，顯微鏡下控制顯色；經(jīng)蘇木精復(fù)染2 min，梯度乙醇脫水，自然晾干后，以中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下判定染色結(jié)果，陽(yáng)性著色為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)棕黃及棕褐色，采用MetaMorph圖像分析系統(tǒng)計(jì)算各組小鼠結(jié)腸組織中5HT4、VIP、NO、SP平均光密度值。

13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 220統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

21白術(shù)七物顆粒對(duì)各組小鼠排便情況的影響與空白組比較，模型組小鼠第1次排黑便的時(shí)間延長(zhǎng)，排便粒數(shù)減少，糞便總重量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；與模型組比較，對(duì)照組和低/高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠第1次排黑便的時(shí)間縮短，排便粒數(shù)增加，糞便總重量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；且高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠第1次排黑便的時(shí)間較低劑量實(shí)驗(yàn)組縮短，排便粒數(shù)增加，糞便總重量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。見(jiàn)表1。

22白術(shù)七物顆粒對(duì)各組小鼠腸道相關(guān)酶活性的影響與空白組比較，模型組小鼠腸道蛋白酶和纖維素酶活性降低，木聚糖酶活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；與模型組比較，對(duì)照組和觀察組低/高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠蛋白酶和纖維素酶活性升高，木聚糖酶活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），且高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠蛋白酶和纖維素酶活性高于低劑量實(shí)驗(yàn)組，木聚糖酶活性低于低劑量實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。見(jiàn)表2。

23白術(shù)七物顆粒對(duì)各組小鼠結(jié)腸組織中5HT4、VIP、NO、SP表達(dá)的影響5HT4、VIP、NO、SP蛋白陽(yáng)性細(xì)胞染色后胞質(zhì)中淺棕色、棕黃色或棕褐色顆粒物質(zhì)。與空白組比較，模型組結(jié)腸組織中VIP、NO平均光密度值升高，5HT4、SP平均光密度值減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和低/高劑量實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸組織中VIP、NO平均光密度值減少，5HT4、SP平均光密度值增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；且高劑量組結(jié)腸組織中VIP、NO平均光密度值低于低劑量實(shí)驗(yàn)組，5HT4、SP平均光密度值高于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。見(jiàn)圖1。

3討論

結(jié)腸慢傳輸型便秘是慢性腸功能紊亂性疾病，其致病機(jī)制復(fù)雜，西醫(yī)對(duì)癥治療雖然在一定程度上控制了病情進(jìn)展，但該病極易反復(fù)發(fā)作，給患者帶來(lái)較大的精神壓力。結(jié)腸慢傳輸型便秘的發(fā)病與臟腑功能失調(diào)相關(guān)，大便的排泄與大腸的傳導(dǎo)密不可分，同時(shí)肝的疏泄條達(dá)也與其息息相關(guān)[910]?！兜は姆ā吩唬骸坝粽?，結(jié)聚而不得發(fā)越，當(dāng)升不得升，當(dāng)降不得降，當(dāng)變化不得變化也，此為傳化失?！?。加之患者情志不暢，也可引起肝氣郁滯，肝之疏泄受阻，則致大腸傳導(dǎo)失司，糟粕蓄而不去引起便秘。結(jié)腸慢傳輸型便秘在病因上為腸胃積熱，氣機(jī)郁滯，陰虧血少，陰寒凝滯，其病位主要在大腸，病機(jī)為大腸傳導(dǎo)功能失常，陰血的濡養(yǎng)和陽(yáng)氣的溫煦使大腸正常地發(fā)揮排便功能；大腸在陰血和充足的陽(yáng)氣濡養(yǎng)下才能平衡協(xié)調(diào)排便功能，否則陽(yáng)氣虧虛或陰血不足時(shí)則會(huì)出現(xiàn)便秘難解；同時(shí)大腸為六腑之一，泄而不藏，排泄亦離不開(kāi)氣機(jī)調(diào)暢，氣機(jī)失司則大腸傳導(dǎo)功能失常，大便亦秘結(jié)難排[1112]。因此氣陰兩虧、脾虛氣弱為結(jié)腸慢傳輸型便秘發(fā)病之本，氣機(jī)郁滯、邪滯腸胃為其標(biāo)，不宜“以瀉為主，以通為用”的治標(biāo)之法，應(yīng)標(biāo)本兼治，以益氣養(yǎng)陰、行氣運(yùn)下為其治法[13]。

莫沙必利是在臨床被廣泛認(rèn)可及應(yīng)用的第四代促胃腸動(dòng)力藥物，通過(guò)興奮肌間神經(jīng)叢5HT受體，刺激乙酰膽堿釋放，是一種強(qiáng)效5HT受體激動(dòng)劑[14]。白術(shù)七物顆粒是由生白術(shù)、木香、烏藥、檳榔、沉香、生地黃、升麻七味藥物制成。生白術(shù)具有益氣健脾的功效，為君藥；木香、烏藥、檳榔、沉香、生地黃為臣藥，木香健脾寬中，善行腸胃之氣；烏藥行氣溫中；檳榔、沉香、生地黃可消積降氣，滋陰清熱，養(yǎng)血生津；升麻具升舉陽(yáng)氣之功為佐藥。諸藥配伍，使脾滯得運(yùn)、腑氣得暢、便秘自除，共同發(fā)揮益氣養(yǎng)陰、行氣運(yùn)下的功效[1415]。本研究采用灌胃復(fù)方地芬諾酯的方法構(gòu)建結(jié)腸慢傳輸型便秘小鼠模型，并在末次藥物干預(yù)結(jié)束后給予納米碳混懸液，從小鼠的排便情況分析，模型組小鼠第1次排黑便的時(shí)間較正常組延長(zhǎng)，排便粒數(shù)減少，糞便總重量降低；而陽(yáng)性對(duì)照組和低/高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠第1次排黑便的時(shí)間較模型組縮短，排便粒數(shù)增加，糞便總重量升高；同時(shí)低/高劑量實(shí)驗(yàn)組2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明白術(shù)七物顆粒干預(yù)結(jié)腸慢傳輸型便秘小鼠可顯著改善小鼠的排便情況，減輕小鼠便秘程度，且與作用的藥物劑量相關(guān)。

腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)影響便秘的發(fā)生及進(jìn)展，乳酸桿菌、雙歧桿菌等益生菌可產(chǎn)生大量有機(jī)酸調(diào)節(jié)腸道肌肉活性增強(qiáng)腸道動(dòng)力，并抑制有害菌的增殖，進(jìn)而改善腸道環(huán)境，其產(chǎn)生的各種酶在腸道消化過(guò)程中起關(guān)鍵作用[1617]。本研究對(duì)小鼠腸道相關(guān)酶活性的研究顯示，陽(yáng)性對(duì)照組和低/高劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠蛋白酶和纖維素酶活性較模型組升高，木聚糖酶活性降低。蛋白酶主要是由腸道自身分泌，而纖維素酶和木聚糖酶主要由腸道微生物分泌，因此該結(jié)果提示白術(shù)七物顆粒在一定程度上可調(diào)整腸道消化酶系統(tǒng)，進(jìn)而達(dá)到改善便秘癥狀的目的。研究[1819]發(fā)現(xiàn)，平滑肌是胃腸道運(yùn)動(dòng)的最終效應(yīng)器，而便秘患者結(jié)腸運(yùn)動(dòng)與平滑肌的運(yùn)動(dòng)失調(diào)相關(guān)；另外，便秘患者胃腸動(dòng)力學(xué)異常與特定的神經(jīng)遞質(zhì)水平異常有關(guān)，5HT4、VIP、NO、SP是目前研究較多的常神經(jīng)遞質(zhì)，與便秘患者的病情密切相關(guān)。本研究結(jié)果中，白術(shù)七物顆粒干預(yù)后可明顯增加結(jié)腸組織中5HT4、SP蛋白的表達(dá)，減少VIP、NO的表達(dá)，對(duì)小鼠結(jié)腸組織中神經(jīng)遞質(zhì)水平起到一定的調(diào)控作用。

綜上所述，白術(shù)七物顆?？烧{(diào)控結(jié)腸慢傳輸型便秘小鼠腸道相關(guān)酶的活性，改善胃腸功能，其作用機(jī)制可能與白術(shù)七物顆粒調(diào)控結(jié)腸組織中5HT4、VIP、NO、SP蛋白表達(dá)相關(guān)。

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（2018-04-12收稿責(zé)任編輯：張文婷）