鮮生地黃對慢加急性肝衰竭大鼠JAK2/STAT3通路的影響

郭麗穎 李秋偉 李力

摘要目的：觀察鮮生地黃對慢加急性肝衰竭大鼠JAK2/STAT3通路的影響。方法：30只雄性Wistar大鼠按照1∶4比例隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組大鼠先用四氯化碳誘導(dǎo)成肝纖維化模型，再按照1∶1比例隨機(jī)分為模型組和觀察組，應(yīng)用D氨基半乳糖進(jìn)行急性攻擊，建立慢加急性肝衰竭大鼠模型。觀察組在急性攻擊前7 d予以鮮生地黃連續(xù)灌胃。各組大鼠分別在急性攻擊后24 h取材，檢測血清內(nèi)毒素、白細(xì)胞介素6含量及肝臟組織中JAK2mRNA、STAT3mRNA的表達(dá)。結(jié)果：模型組大鼠肝組織中JAK2mRNA、STAT3mRNA表達(dá)低于對照組和觀察組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。觀察組與對照組大鼠肝組織中JAK2mRNA、STAT3mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。模型組大鼠血清內(nèi)毒素顯著高于對照組和觀察組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001）;觀察組與對照組比較，大鼠血清內(nèi)毒素表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。模型組大鼠血清白細(xì)胞介素6高于對照組和觀察組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。結(jié)論：鮮生地黃能夠降低腸道內(nèi)毒素的吸收，促進(jìn)JAK2/STAT3通路活化，但是介導(dǎo)物質(zhì)可能并不是IL6，相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步完善。

關(guān)鍵詞鮮生地黃;慢加急性肝衰竭;JAK2;STAT3

Effects of Fresh Radix Rehmanniae Recens on JAK2/STAT3 Pathway in Acuteonchronic Liver Failure Rats

Guo Liying1，2，Li Qiuwei1，2，Li Li1，Miao Jing2，Jia Jianwei2

（1 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China; 2 Tianjin Second People′s Hospital，Tianjin 300192，China）

AbstractObjective：To observe the effect of fresh Radix Rehmanniae Recens on JAK2/STAT3 pathway in acuteonchronic liver failure rats.Methods：Thirty male Wistar rats were randomly divided into control group and experimental group according to 1∶4 ratio.Rats in experimental group were firstly induced to hepatic fibrosis model with carbon tetrachloride，and then randomly divided into model group and treatment group according to the ratio of 1∶1.Acute attacks were performed with Dgalactosamine and a rat model of chronic acute liver failure was established.The treatment group was given intragastrically with the fresh Radix Rehmanniae Recens 7 days before the acute attack.Rats in each group were harvested 24 hours after acute challenge.Serum endotoxin，interleukin6 levels，and expression of JAK2 mRNA and STAT3 mRNA in liver tissue were measured.Results：The expression of JAK2 mRNA and STAT3 mRNA in the liver tissue of the model group was lower than that in the control group and the model group.The difference was statistically significant （P<005）.There was no significant difference in the expression of JAK2 mRNA and STAT3 mRNA between the treatment group and the control group （P>005）.The serum endotoxin level in the model group was obviously higher than that in the control group and the treatment group，and the difference was statistically significant （P<001）.There was no significant difference in serum endotoxin expression between the treatment group and the control group （P>005）.Serum interleukin6 levels in the model group were higher than those in the control group and the treatment group，but the difference was not statistically significant （P>005）.Conclusion：Fresh Radix Rehmanniae Recens can reduce the absorption of toxins in the intestine and promote the activation of JAK2/STAT3 pathway，but the mediator may not be IL6，and the relevant mechanisms need to be further improved.

Key WordsFresh Radix Rehmanniae Recens; Chronic plus acute liver failure; JAK2; STAT3

中圖分類號：R7433文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.039

肝衰竭屬于中醫(yī)學(xué)“急黃”“瘟黃”范疇，“濕、熱、瘀”是肝衰竭的主要病理基礎(chǔ)，“毒、虛”是肝衰竭的特有病理因素，“熱、毒”是疾病進(jìn)展的關(guān)鍵[1]。鮮生地黃既可以清熱涼血，又可以養(yǎng)陰生津，因此它可以作用于肝衰竭的多個(gè)病理過程，在臨證中獲得一定的療效[24]，但是其作用機(jī)制尚不明確。酪氨酸激酶2（JAK2）/轉(zhuǎn)錄因子3（STAT3）信號通路是肝損傷發(fā)展過程中的重要調(diào)控機(jī)制。因此本研究基于JAK2/STAT3通路，初步探討鮮生地黃治療肝衰竭的可能作用機(jī)制。

1材料與方法

11材料

111實(shí)驗(yàn)動物清潔級雄性Wistar大鼠30只，質(zhì)量（220±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司（動物許可證號：SCXK2016006）。實(shí)驗(yàn)前在恒溫（25 ℃）、光照周期12 h/12 h環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

112藥物鮮生地黃生地黃采自河南省武陟縣，清洗后真空冰凍保鮮技術(shù)處理，用前榨汁。

113試劑與儀器

1131主要試劑TRNzol總RNA提取試劑由天根生化科技（北京）有限公司，生產(chǎn)批號：DP40502。PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser由TaKaRa生物有限公司，生產(chǎn)批號：RR047B。Premix Ex TaqTM（探針法mix）由TaKaRa生物有限公司，生產(chǎn)批號：RR390L。所用的JAK2、STAT3目的基因引物、探針均由北京Invitrogen公司合成。D氨基半乳糖（DGal）購自上海市阿達(dá)瑪斯試劑有限公司，批號：P1243553。四氯化碳（CCl4）購自天津市化學(xué)試劑供銷公司，批號：160918。橄欖油購自天津市化學(xué)試劑供銷公司，批號：161205。

1132主要儀器QL902渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;Centrifuge 5415D離心機(jī)（Eppendorf公司）;分光光度NANODROP 2000（Therno scientific公司）;凝膠成像系統(tǒng)Tanon 1600（上海天能科技有限公司）;熒光定量PCR儀ABI7500（Applied Biosystems公司）;ELX800型酶標(biāo)儀（美國BIOTEK公司）。

12方法

121分組與模型制備

1211動物模型制備參考樸正福、張海燕等[56]方法建立慢加急性肝衰竭大鼠模型。

1212肝纖維化大鼠模型制備將CCl4與橄欖油按照1∶1配制成50%CCl4橄欖油溶液，按照2 mL/kg劑量，給予大鼠腹腔注射，1次/3 d，連續(xù)8周，建立肝纖維化大鼠模型。

1213慢加急性肝衰竭大鼠模型制備DGal與09%氯化鈉溶液按照1∶10配制成DGal溶液。肝纖維化模型大鼠禁食24 h，不禁水，按照2 g/kg劑量，腹腔注射DGal溶液，建立慢加急性肝衰竭大鼠模型。

1214分組采用SPSS 220統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行隨機(jī)化處理。30只Wistar大鼠按照1∶4比例隨機(jī)分為2組，空白對照組（簡稱對照組）6只，自由飲水進(jìn)食;實(shí)驗(yàn)組24只，自由飲水進(jìn)食，并按照1212方法應(yīng)用50%CCl4橄欖油溶液建立肝纖維化模型。8周后從實(shí)驗(yàn)組中隨機(jī)抽取6只大鼠驗(yàn)證肝纖維化模型成立后，余下的大鼠按照1∶1比例隨機(jī)分為模型組和觀察組，按照1213方法應(yīng)用DGal進(jìn)行急性攻擊，建立慢加急性肝衰竭大鼠模型。

122給藥成模前1周開始進(jìn)行藥物干預(yù)。對照組、模型組按照025 mL/100 g劑量給予生理鹽水灌胃，1次/d;觀察組按照025 mL/100 g劑量給予鮮生地黃汁灌胃，1次/d。取材：慢加急性肝衰竭大鼠模型成立24 h后，麻醉解剖大鼠，采集門靜脈血液，于3 000 r/min離心10 min后留取上清，液氮保存后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱凍存，待測;取肝左葉組織液氮保存后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱凍存，待測。

123檢測指標(biāo)與方法

1231一般情況觀察每天記錄各組大鼠飲食量及體重，觀察皮毛及大便情況。

1232血清內(nèi)毒素、IL6檢測采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測。往預(yù)先包被的內(nèi)毒素（ET）、白細(xì)胞介素6（IL6）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫浴并徹底洗滌，用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和ET、IL6呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長測定吸光度，計(jì)算樣品濃度。

1233肝組織中JAK2、STAT3的mRNA檢測采用Real Time PCR taqman探針方法檢測目的基因mRNA，以GAPDH為內(nèi)參照，雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對定量。肝臟組織放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨成粉末狀，按TRNzol總RNA提取試劑說明書提取RNA，并應(yīng)用紫外吸收測定法檢測濃度和純度。然后采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。取cDNA樣品配置Realtime PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為20 μL，Master Mix（2×）10 μL，上下游特異引物各05 μL，探針05 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃孵育30 s，然后95 ℃延伸5 s重復(fù)循環(huán)39次，末次循環(huán)60 ℃延伸至40 s，收集熒光。JAK2引物序列（5′to3′）：上游TATGCGAATGATCGGCAATG，下游AAATCTCGTCTGGGCACCCT，探針FAMAAGGGCAGATGATCGTATTCCATTTBHQ1;STAT3引物序列（5′to3′）：上游TGATAAGGACTCTGGGGATG，下游GGGTCAGGTGCTTGAACTCT，探針FAMCCTCAGAGGGTCTCGGAAATTTAACBHQ1。其中Reporter為FAM，Quencher為BHQ1。目的基因和內(nèi)參分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)，每個(gè)樣本檢測3個(gè)復(fù)孔。數(shù)據(jù)采用2△△ CT法進(jìn)行分析。每一份標(biāo)本均行復(fù)管檢測，取其均值做為目的基因的表達(dá)水平。

13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 220統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)應(yīng)用單因素方差分析LSD檢驗(yàn);呈偏態(tài)分布或方差不齊則作多組樣本秩和kw檢驗(yàn)。以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

21一般情況比較對照組大鼠毛發(fā)光澤，活動多，精神狀態(tài)好，大便正常。實(shí)驗(yàn)組大鼠在給予CCl4過程中，毛發(fā)凌亂無光澤，易急惹，皮膚逐漸黃染，體重增長緩慢。8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組大鼠死亡2只，隨機(jī)抽取6只大鼠中解剖發(fā)現(xiàn)有2只出現(xiàn)腹水。DGal急性攻擊后，模型組和觀察組大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡，黃疸加重，部分可見口鼻出血癥狀，至24 h模型組死亡1只。

22肝組織JAK2mRNA、STAT3mRNA表達(dá)3組大鼠肝組織中JAK2mRNA、STAT3mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001）。對照組及觀察組大鼠肝組織中JAK2mRNA、STAT3mRNA表達(dá)均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001）。對照組與觀察組比較，大鼠肝組織中JAK2mRNA、STAT3mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。見表1。

3討論

肝衰竭是多種病因所致的嚴(yán)重肝臟損害，導(dǎo)致其合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙或失代償，出現(xiàn)以凝血功能障礙、黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床征候群，預(yù)后差，病死率高，是肝臟病中常見的危重病。肝衰竭發(fā)病機(jī)制可以概括為免疫損傷、缺血缺氧損傷、內(nèi)毒素血癥“三重打擊學(xué)說”[7]，核心表現(xiàn)在肝細(xì)胞死亡、炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤和微循環(huán)障礙三方面，其中肝細(xì)胞大量壞死及有效再生的缺乏是肝衰竭死亡的主要原因[8]。因此肝細(xì)胞的有效再生，是改善肝衰竭預(yù)后的重要因素。酪氨酸激酶JAK/轉(zhuǎn)錄因子STAT參與了許多細(xì)胞因子及生長因子介導(dǎo)的細(xì)胞增殖及分化等生物過程，特別是STAT蛋白已被證實(shí)在細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞增殖過程中占有重要地位，其中JAK2/STAT3通路在成人肝臟中表達(dá)，并參與肝再生、免疫等過程[910]。研究[11]表明在肝臟局部切除術(shù)后多種早期即刻基因被立即激活。IL6負(fù)責(zé)激活這些基因的40%。IL6可活化STAT，許多研究表明這就是肝再生的開始[12]。

鮮生地黃甘寒質(zhì)潤，養(yǎng)陰生津同時(shí)又可清熱涼血，將其應(yīng)用于肝衰竭治療中可涼血解毒、清營護(hù)絡(luò);可增水濡絡(luò)而行血;調(diào)和陰陽，生津養(yǎng)液，滋補(bǔ)肝腎，整體作用于肝衰竭“三重打擊學(xué)說”中的各個(gè)階段?，F(xiàn)代研究[1314]表明中藥養(yǎng)陰生津作用主要體現(xiàn)在調(diào)控細(xì)胞增殖方面。為進(jìn)一步明確鮮生地黃作用機(jī)制，我們探討了鮮生地黃對JAK2/STAT3通路影響。

本研究證實(shí)了鮮生地黃能夠提高慢加急性肝衰竭大鼠模型中肝組織中JAK2mRNA、STAT3mRNA的表達(dá)（P<005），達(dá)到正常大鼠水平（P>005）;能夠降低慢加急性肝衰竭大鼠模型門靜脈ET水平（P<005），但是不能改善早期免疫損傷所致的IL6升高的結(jié)局（P>005）。因此我們推測鮮生地黃能夠降低腸道內(nèi)毒素的吸收，能夠促進(jìn)JAK2/STAT3

通路活化，但是介導(dǎo)物質(zhì)并不是IL6，相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步完善。

參考文獻(xiàn)

[1]周小舟，黃俏光，孫新鋒，等.慢加急性、慢性肝衰竭中醫(yī)證候規(guī)律的研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2012，19（6）：483484.

[2]沈南蘭，雷金艷，郭麗穎.鮮生地改善慢性乙型肝炎患者胃腸功能臨床研究[J].河北醫(yī)藥，2012，34（13）：20542055.

[3]賈建偉，趙潔，李謙，等.慢性重型肝炎營血證的鮮生地汁治療[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2007，17（1）：79.

[4]賈建偉，袁桂玉，曹武奎，等.鮮生地治療慢性重肝營血癥臨床觀察[C].深圳：全國中西醫(yī)結(jié)合傳染病學(xué)術(shù)會議，2006.

[5]樸正福，趙丹，張海燕，等.大鼠慢加急性肝衰竭模型肝臟組織病理學(xué)特征研究[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2010，19（5）：432436.

[6]張海燕，侯維，盧靜，等.大鼠慢加急性肝衰竭模型建立的方法探討[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2009，18（4）：348351.

[7]葉一農(nóng)，高志良.乙型肝炎肝衰竭發(fā)生機(jī)制中的三重打擊[J].傳染病信息，2009，22（5）：276279.

[8]徐少卿，郭建彪，李紅艷，等.血清甲胎蛋白與慢加急性肝衰竭預(yù)后的關(guān)系[J].臨床消化病雜志，2014，26（1）：4647.

[9]吳志豪.人類肝臟JAKSTAT相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建[D].北京：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2008.

[10]閆春玲.EPO、IGF1、ILK和JAK/Stat信號通路在大鼠肝再生中對肝細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用研究[D].河南師范大學(xué)，2013.

[11]Li W，Liang X，Leu JI，et al.Global changes in interleukin6dependent gene expression patterns in mouse livers after partial hepatectomy[J].Hepatology，2001，33（6）：13771386.

[12]Taub R.Liver regeneration：from myth to mechanism[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2004，5（10）：836847.

[13]李民，張旭，朱平，劉學(xué)鳳.麥冬、生地藥血清對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響[J].國醫(yī)論壇，2001，16（5）：4344.

[14]陳志國，葉松山，范迎，等.金釵石斛多糖提取工藝的優(yōu)化及對小鼠脾細(xì)胞增殖的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（15）：2732.

（2018-04-17收稿責(zé)任編輯：王明）