基于Wnt通路加味烏梅丸對結腸癌的抑制機制

張然　李素娟　陳正彥

摘要目的：探討加味烏梅丸抑制結腸癌的效果并分析其作用機制。方法：選取BALB/c雄性小鼠30只，隨機分為空白組、模型組和烏梅丸組，每組10只。其中空白組小鼠不接受干預措施，烏梅丸組進行烏梅丸煎劑灌胃處理，空白組及模型組接受等劑量生理鹽水灌胃，均干預28 d，觀察腫瘤體積的變化、小鼠的體重及存活率、腫瘤組織Wnt、JNK水平變化。結果：模型組與烏梅丸組小鼠腫瘤體積較干預前均有增加的趨勢，其中烏梅丸組增加的速度較慢，并在干預28 d后腫瘤組織有減小的趨勢；干預28 d空白組小鼠體重與初始體重相近，模型組及烏梅丸組小鼠體重明顯下降，其中模型組較烏梅丸組下降明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；干預結束后模型組僅有4只小鼠存活，而烏梅丸組有7只小鼠存活，存活率差異有統(tǒng)計學意義（P<005）。模型組及烏梅丸組小鼠腫瘤組織Wnt、JNK蛋白及mRNA均過表達，其中模型組Wnt、JNK表達水平明顯高于烏梅丸組，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）。結論：加味烏梅丸具有明顯抑制結腸腺瘤惡化作用，其抗腫瘤機制可能與抑制Wnt通路表達有關。

關鍵詞結腸癌；烏梅丸；腫瘤體積；Wnt蛋白；JNK蛋白；抗腫瘤；侵襲能力；療效

Mechanism Exploration of Modified Wumei Boluses on Colon Cancer Inhibition via Wnt Pathways

Zhang Ran， Li Sujuan， Chen Zhengyan， Yang Kun

（Department of Spleen， Stomach， Liver and Gallbladder， Henan University of Traditional Chinese Medicine， Zhengzhou 450000， China）

AbstractObjective：To investigate the colon cancer inhibition of modified wumei boluses and to analyze some of the action mechanism. Methods：A total of 30 BALB/c male mice were randomly divided into blank group， model group and wumei boluses group， with 10 in each group. The mice of blank group did not accept intervention measures， and wumei boluses group had lavage treatment of wumei boluses decoction. Blank group and model group received isodose physiological saline lavage. All the groups had 28 d intervention. The changes of tumor volume， weight of mice and survival rate， concentration changes of Wnt， JNK in the tumor tissue were observed. Results：1）the mice tumor volume increased in the model group and wumei boluses group than before the intervention， and the increase in the wumei boluses group was more slowly. The tumor tissue had a tendency to decrease after 28 d of intervention. 2）After 28 days of the intervention， the mice weight in the blank group was similar to the initial weight， and the mice weight of the model group and the wumei boluses decreased obviously. The decrease of model group was more significantly than that in the wumei boluses group （P<005）； After the intervention， only 4 mice survived in the model group， and 7 mice survived in the wumei boluses group. The survival rate differences between the two groups were statistically significant （P<005）. 3）Protein and mRNA of Wnt， JNK in mice tumor tissue of both the model group and wumei boluses group showed high expression， and expression levels of Wnt， JNK in the model group was obviously higher than that of wumei boluses group （P<005）. Conclusion：The modified wumei boluses has obvious inhibitory effect on deterioration of colonic adenoma， and the mechanism of antitumor may related to the inhibition on the expression of Wnt pathways.

Key WordsColon cancer； Wumei boluses， Wnt； JNK； Antitumor； Invasiveness； Curative effect

中圖分類號：R2895；R7353文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.038

結腸癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，隨著人們生活方式以及飲食結構的改變，結腸癌的發(fā)病率日益增加，發(fā)病年齡亦有年輕化趨勢[12]。有研究顯示結腸癌從良性病變轉變成癌前病變，最終發(fā)展成惡性病變過程中Mnt信號通路被異常激活[3]。Mnt信號通路與機體正常胚胎發(fā)育密切相關，該通路的標志蛋白相互影響，從而介導相關基因轉錄，是結腸癌發(fā)生的關鍵因素之一，因此，抑制Mnt通路的活化是治療結腸癌的靶方向。烏梅丸源自《傷寒論》，既往該方被視為此方為止痛安蛔的要方，隨著醫(yī)藥研究的逐漸深入，有臨床觀察顯示烏梅丸可明顯改善結腸癌患者腹瀉、便秘等癥狀，也有研究人員利用烏梅丸治療胰腺癌后臨床獲益理想，生存期得到延長[4]，認為烏梅丸對消化道腫瘤的臨床療效值得肯定。本研究探討烏梅丸治療消化道惡性腫瘤的作用機制是否是通過Mnt信號通路進行橋接。我們制備結腸癌動物模型，利用烏梅丸進行干預，通過Western blotting及PCR法對Mnt信號通路上的標志蛋白進行檢測，探析烏梅丸治療結腸癌的作用機制。

1材料與方法

11材料

111動物

選取SPF級昆明雄性小鼠30只，體重18～24 g，平均體重（1726±152）g，鼠齡2～4個月，平均鼠齡（248±036）個月，由本院附屬中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，并在該動物中心SPF級飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度23～25 ℃，平均飼養(yǎng)溫度（1441±141）℃。將30只小鼠隨機分為空白組、模型組及烏梅丸組，每組10只。3組小鼠在體重、鼠齡等一般情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>005），具有可比性。

112藥物

加味烏梅丸，藥物組成：烏梅50 g、當歸20 g、細辛3 g、川椒6 g、桂枝10 g、黃連3 g、黃柏10 g、黨參10 g、干姜10 g、制附片10 g、白芍30 g、生黃芪30 g、炒枳殼10 g、木香10 g。上述中藥飲品購自北京華邈中藥工程技術開發(fā)中心，本院藥劑科制備，常規(guī)水煎煮后用水浴濃縮并置于4 ℃環(huán)境保存?zhèn)溆谩?/p>

113試劑與儀器

10%水合氯醛（天津市光復精細化工研究所），SDSPAGE電泳膠（北京碧云天生物技術研究所），Trizol（美國Invitrogen公司），逆轉錄試劑盒（美國Promega公司），-actin、Wnt、JNK一抗和堿性磷酸酶標記山羊抗兔（美國CST公司），PCR引物（上海生工生物工程有限公司），BCA蛋白定量試劑盒、SDSPAGE凝膠配制試劑盒、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒（北京碧云天生物技術研究所），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國Millipore公司），RPMI1640完全培養(yǎng)液（美國Hyclone公司），BALB/c小鼠來源的CT26細胞株（韓國he Korean Cell Line Bank）。

12方法

121分組與模型制備

將購買的CT26細胞于RPMI1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)并調整密度為2×103 μ/L，后將CT26細胞注射于小鼠右前腋下部位?？瞻捉M小鼠不接受模型制備，當小鼠腫瘤直徑4～5 mm時隨機分為模型組及烏梅丸組，每組10只[5]。

122干預方法

烏梅丸組小鼠予10 mg/（kg·d）烏梅丸湯劑進行灌胃，1次/d。空白組及模型組小鼠接受相同劑量生理鹽水進行灌胃，連續(xù)灌胃28 d。

123檢測指標與方法

1）腫瘤體積、體重及存活率的變化：注射前、注射后每隔3 d測量一次腫瘤體積，利用游標尺作為測量工具，以（長×寬2）×2視為腫瘤體積計算公式。小鼠的體重變化率=（當前質量-初始質量）×100%。存活率=（當前小鼠數(shù)量/初始小鼠數(shù)量）×100%。

2）Western blotting檢測腫瘤組織Wnt、JNK的蛋白水平：每組隨機選擇3只小鼠脫頸處死后，剪取腫瘤組織100 mg置于離心管中，空白組小鼠取相同部位組織相同質量進行觀察，根據(jù)不同組織質量加入相應的裂解液，放置于4 ℃進行勻漿處理后設置15 000 r/min轉速進行離心，用移液槍抽吸上清液，使用BCA試劑盒對25 μL上清液進行蛋白濃度測定，同時計算上樣量。完成上述步驟后以4∶1的比例往上清液中樣緩沖液，將混合液置于100 ℃金屬浴鍋中進行蛋白變性7 min。根據(jù)碧云天BCA試劑盒說明書配制膠體（6%濃縮膠，12%分離膠），將事先計算好每組上樣量將標本加入膠體中60 V進行電145 min后將膠體上的蛋白轉印至PVDF膜中，再用麗春紅進行PVDF膜染色觀察蛋白是否順利轉印至PVDF膜中。用TBST將脫脂奶粉配制成5%濃度，將轉印后目的蛋白的PVDF膜進行封閉2 h，隨后用TBST進行洗滌3次，1 min/次。將PCDF膜置于化學發(fā)光成像儀上，滴入ECL發(fā)光液顯影，隨后進行數(shù)據(jù)讀取。

3）PCR法檢測腫瘤組織Wnt、JNK的mRNA水平變化：每組隨機選擇3只小鼠脫頸處死后，剪取腫瘤組織100 mg置于離心管中，加用液氮后研磨成碎塊，加入1 mLTrizol充分反應后按照說明書進行總RNA的提取，并測定總RNA水平，利用PTRNA兩步法的操作說明將mRNA逆轉錄成cDNA，以該cDNA為擴增模板進行Wnt、JNK、GAPDH指標的擴增。轉錄過程：5 ℃（6 min）-55 ℃（90 s）-72 ℃（90 s）-72 ℃（10 min）-5 ℃（1 h）。具體引物序列參見表1。

13統(tǒng)計學方法

采用SPSS 90統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。其中呈正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組比較用t檢驗，多組采用多因素方差分析，以P<005為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

212組腫瘤體積比較

模型組與烏梅丸組小鼠腫瘤體積較干預前均有增加的趨勢，其中烏梅丸組增加的速度較慢，并在干預28 d后腫瘤組織有減小的趨勢。見表2。

223組小鼠體重比較

干預28 d空白組小鼠體重與初始體重相近，模型組及烏梅丸組小鼠體重明顯下降，其中模型組較烏梅丸組下降明顯（P<005）。見表3。

233組存活率比較

干預結束后空白組所有小鼠均存活，模型組僅有4只小鼠存活，存活率40%，而烏梅丸組有7只小鼠存活，存活率70%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=324，P<005）。

243組大鼠Wnt、JNK蛋白比較

模型組及烏梅丸組小鼠腫瘤組織Wnt、JNK蛋白及mRNA均出現(xiàn)過表達，其中模型組Wnt、JNK表達水平明顯高于烏梅丸組（P<005）。見圖1、圖2。

3討論

結腸癌最為臨床常見的惡性消化道腫瘤，結腸癌在我國的發(fā)病率逐年上升，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢，其中位發(fā)病年齡較歐美國家提前了近10年之多，這一數(shù)據(jù)引起了我國相關醫(yī)務工作者及科研人員的廣泛關注[6]。隨著結腸鏡在臨床的普遍使用，結腸癌的發(fā)現(xiàn)率較前遠遠提高，但其死亡率仍遠遠高于其他種類的腫瘤，其中轉移性結腸癌雖然在一定時間段內可進行切除治療，但是術后復發(fā)、轉移仍是治療失敗的主要原因。目前多數(shù)抗癌藥物主要是延緩腫瘤的生長，無法抑制其增長，當腫瘤體積逐漸增大導致腸道梗阻后臨床多數(shù)無更為有效的辦法，最終導致患者死亡。有研究人員曾經利用腸管內支架植入以期緩解腸道局部梗阻，但此方法將影響腸道蠕動，難以達到治療期望值。因此，探索新的有效的臨床方法，減輕結腸癌的病情，延長患者生存時間是目前臨床探索的需求。

烏梅丸源自醫(yī)圣張仲景之《傷寒論·辨厥陰病脈證并治》，主要用于治療蛔厥證，書中認為“厥陰之為病，消渴，氣上撞心，心中疼熱，饑而不欲食，食則吐蟯。下之利不止”，而結腸癌存在的腹脹、消化不良、腹痛、乏力、消瘦均與蛔厥證的臨床表現(xiàn)符合，故使用烏梅丸治療結腸癌具有一定的理論依據(jù)。本研究在清上熱溫下寒的烏梅丸基礎上加用白芍、生黃芪、炒枳殼、木香。方中烏梅為君藥，取酸能安蛔之功，腸寒則蛔動更甚，腹痛加劇，加川椒、細辛辛溫伏蛔，并驅寒溫下；黃連、黃柏苦寒，清解因蛔蟲上擾，氣機逆亂所致之內熱；附子、干姜、桂枝皆為溫熱之品，可增強散寒溫臟之功；當歸、黨參補益氣血，白芍與當歸合用可斂陰緩中止痛，加黃芪可助黨參益氣生血，枳殼、木香加強理氣以止痛。中醫(yī)學認為腫瘤的發(fā)生發(fā)展雖病因多樣，但正氣的盛衰是取決于腫瘤轉歸的主導因素，正氣盛則機體可有力抵御病邪，具有正常的自然修復力?，F(xiàn)代藥理證實黃芪、黨參藥用成分具有極強的抗腫瘤效應，桂枝提取物亦在動物實驗中被證實具有抑制癌細胞增殖的效果[78]。故我們認為加味烏梅丸用于結腸癌有一定的臨床基礎。本研究數(shù)據(jù)顯示，加味烏梅丸不論是在抑制小鼠腫瘤體積方面，還是提高體重及存活率方面均有明顯的優(yōu)勢，這證實了加味烏梅丸確有理想的抗腫瘤效果。

在對其作用機理進一步探討時我們檢測了小鼠腫瘤組織Wnt信號通路的標志性因子，Wnt/JNK通路在機體胚胎階段已參與細胞骨架的重排過程，與原腸胚的形成關系密切[912]。JNK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛分布于哺乳動物全身組織，對細胞生長、分化、凋亡以及癌基因的轉化都有參與調控[1316]，JNK在多類惡性腫瘤組織中均過表達，通過干擾JNK或沉默JNK基因可明顯減弱癌細胞的體外遷移及侵襲力，因此抑制JNK的表達是抑制癌細胞運動及侵襲力的靶方向。本研究數(shù)據(jù)顯示，加味烏梅丸可明顯抑制結腸癌模型小鼠Wnt、JNK表達，我們認為這是加味烏梅丸抗癌的主要機制之一。此外，本研究利用Western blotting檢測腫瘤組織相關蛋白因子的變化，僅僅是半定量觀察，且無法觀察各因子在細胞或組織內的定位變化，下階段將增加形態(tài)學的檢查進一步研究加味烏梅丸的作用機制。

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（2017-10-20收稿責任編輯：楊覺雄）