培元解郁方對急性糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)SD大鼠的抗抑郁作用及TRYKYN代謝途徑的調(diào)節(jié)

楊桃　張靜　李麗娜

摘要目的：研究培元解郁方的抗抑郁作用以及對色氨酸（TRY）犬尿氨酸（KYN）代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制。方法：建立氫化可的松大鼠抑郁模型，以蔗糖消耗反映大鼠的抑郁狀態(tài)，采用高效液相質(zhì)譜聯(lián)用（HPLCMS/MS）技術(shù)檢測腦組織KYN、TRY、喹啉酸（QUIN）、犬尿烯酸（KA）含量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測定肝組織中色氨酸2，3雙加氧酶（TDO）mRNA表達(dá)水平和腦組織海馬中吲哚胺2，3雙加氧酶（IDO）、5HT1A的mRNA表達(dá)。結(jié)果：造模21 d后，大鼠對蔗糖的偏好降低，KYN/TRY比值升高，QUIN含量升高，KA含量降低，TDO mRNA的表達(dá)水平增加，5HT1A mRNA的表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。各給藥組能提高大鼠對蔗糖的偏好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。各給藥組均能顯著降低KYN/TRY比值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），培元解郁方中劑量組和天絲飲組能顯著提高KA的含量，降低QUIN的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。天絲飲能明顯降低肝臟中TDO和海馬中IDO mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。四逆散和培元解郁方中、高劑量能夠增加海馬中5HT1A mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。結(jié)論：天絲飲、四逆散和培元解郁方均有抗抑郁藥樣作用，機(jī)制與降低TRYKYN代謝的關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)，降低神經(jīng)毒性代謝產(chǎn)物和增加神經(jīng)保護(hù)性代謝產(chǎn)物，從而提高神經(jīng)元保護(hù)作用，以及增加5HT1A的mRNA表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞培元解郁方；抗抑郁；色氨酸犬尿氨酸代謝途徑

Antidepressant Effect of Peiyuan Jieyu Decoction and Its Regulation on TRYKYN Metabolic Pathway on Acute glucocorticoid on SD rats

Yang Tao1，Zhang Jing1，Li Lina2，Lu Yi2，Wang Shuyan2，Huang Xiang2，Zhang Bo1，Chang Hongsheng1

（1 School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102488，China； 2 School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

AbstractObjective：To study the antidepressant effects of Peiyuan Jieyu Decoction and the regulatory mechanism of the tryptophankynurenine （TRYKYN） metabolic pathway.Methods：The rat model of depression induced by intraperitoneal injection hydrocortisone was built.The symptoms of depression were observed by sucrose preference experiment.The contents of tryptophane，kynurenine，kynurenic acid and quinaldinic acid in brain tissue were detected by HPLCMS/MS technique.The mRNA expression levels of TDO in liver tissue，IDO and 5HT1A in brain tissue were detected by using realtime PCR.Results：After 21 days′ acute stress，the preference in sucrose was reduced.The ratio of KYN/TRY and the content of QUIN were increased.The content of KA was decreased.The expression of TDO mRNA increased and the expression of 5HT1A mRNA decreased （P<005）.The Fluoxetine group，Tiansi decoction group，Sini decoction group，high dose and middle dose of Peiyuan Jieyu decoction group could improve the preference in sucrose preference experiment （P<005）.Each treatment group could obviously reduce the ratio of KYN/TRY （P<005）.Tiansi decoction and middle dose of Peiyuan Jieyu decoction could significantly improve the content of KA，and decrease the content of QUIN P<005）.Tiansi decoction could obviously decrease the expression of TDO mRNA in liver and the expression of IDO mRNA in hippocampus （P<005）.Sini decoction，middle dose and high dose of Peiyuan Jieyu decoction could increase the expression of 5HT1A mRNA in hippocampus （P<005）.Conclusion：Traditional Chinese medicine groups have antidepressant effects.Its mechanism may be connected with reducing the expression of the key enzyme mRNA in TRYKYN metabolic pathway，improving the neuron protective effect by reducing neurotoxic metabolites and increasing neuroprotective metabolites，and increasing the expression of 5HT1A.

Key WordsPeiyuan Jieyu Decoction； Antidepression； TRYKYN

中圖分類號：R7816+4；R2855文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.036

四逆散來源于張仲景的《傷寒論》，是疏肝解郁的祖方[1]，具有顯著的抗抑郁作用[2]。天絲飲來源于《辨證錄》，有溫補(bǔ)腎元、安定神志之功效，所含巴戟天寡糖具有較好的抗抑郁作用[3]。本研究采用的培元解郁方即四逆散和天絲飲合方。我們采用腹腔注射氫化可的松誘導(dǎo)的大鼠抑郁模型，對四逆散、天絲飲和培元解郁方的抗抑郁作用進(jìn)行了觀察，并著重就其TRYKYN代謝調(diào)節(jié)，及相關(guān)酶TDO、IDO mRNA表達(dá)水平和5HT1A mRNA表達(dá)水平影響，進(jìn)行了深入研究。

1材料與方法

11材料

111動物雄性SD大鼠56只，體重250～280 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證編號：SCXK（京）20110004，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，自由飲食。

112藥品鹽酸氟西汀膠囊（上海信誼九福藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：20140302A），氫化可的松（H0533，TCI）。制巴戟天配方顆粒（批號：15001781）、北柴胡配方顆粒（批號：13002303）、炙甘草配方顆粒（批號：13002752）、白芍配方顆粒（批號：13002773）、鹽菟絲子配方顆粒（批號：15004252）、麩炒枳實(shí)配方顆粒（批號：120601），上述藥材均由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供。

113試劑與儀器犬尿氨酸（SigmaAldrich）、喹啉酸（Alfa Aesar）、犬尿喹啉酸（SigmaAldrich）、色氨酸（Aladdin）、已腈、甲醇等其他常規(guī)試劑均購于Fisher公司。TRIZOL REAGENT（Invitrogen），HiFiMMLV cDNA第一鏈合成試劑盒和SYBR Green PCR Mixture試劑盒均購自于Cwbio公司。質(zhì)譜儀（美國，ABI公司，型號：3200QTRAP），熒光定量PCR儀（美國，CFX96）。

12方法

121分組與模型制備將大鼠用隨機(jī)分組法分為7組：空白組、模型組、氟西汀組、天絲飲組、四逆散組、培元解郁方中劑量組和培元解郁方高劑量組，每組8只。氫化可的松（02%DMSO和02%Tween 80生理鹽水溶解）40 mg/kg腹腔注射，1次/d，連續(xù)21 d建造模型。

122給藥方法天絲飲的給藥量045 g/kg，四逆散的給藥量042 g/kg，培元解郁方中劑量給藥量087 g/kg，培元解郁方高劑量給藥量174 g/kg，氟西汀給藥量2 mg/kg，空白組和模型組給予同等劑量的蒸餾水，灌胃給藥。分別在第7天、14天、21天進(jìn)行行為學(xué)測試，末次試驗(yàn)后取材，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

123檢測指標(biāo)與方法

1231蔗糖偏好測試12 h禁食禁水后，將大鼠單籠飼養(yǎng)，每籠放2個(gè)相同的水瓶，一只瓶盛有1%的糖水，另一瓶裝自來水。記錄3 h內(nèi)大鼠飲用糖水和自來水的量，計(jì)算蔗糖水偏嗜度。

1232TRY、KYN、KA、QUIN含量測定大鼠腹主動脈取血，凝血后4 ℃、2 500 r/min離心15 min，吸取上清100 uL，-20 ℃凍存，HPLCMS/MS測定KYN、KA、TRY、QUIN的含量。以血清中TRY/KYN比值來表示TDO活性，KYN/KA比值來反映神經(jīng)保護(hù)作用，QUIN則反映神經(jīng)毒性作用。液相檢測條件[4]：SLab HPC18色譜柱（150 mm×46 mm，5 μm），流動相由水（A）乙腈（B）組成，進(jìn)樣體積為20 μL，柱溫為30 ℃，流速為08 mL/min。采用梯度洗脫：0～1 min，（95%B）；1～8 min，（95%～40%B）；8～81 min，（40%～0%B）；81～10 min，（0%B）；10～101 min，（0%～95%B）；101～15 min（95%B）。質(zhì)譜檢測條件：掃描方式用MRM多反應(yīng)監(jiān)測；離子源為+ESI電噴霧離子源，正離子方式；霧化溫度500 ℃；射入電壓10 V；噴霧電壓+5 500 V；碰撞室射出電壓20 V；GS1：55 psi（霧化氣）；CAD：Medium（碰撞氣）；GS2：60 psi（輔助氣）；CUR：20 psi（氣簾氣）。

1233肝組織TDO mRNA含量測定將新鮮肝組織放到液氮速凍，用一步法提取肝組織的總RNA，吸取1 μL RNA，1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，后用試劑盒按說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用熒光定量PCR法測定其含量，用SYBR PCR Mixture進(jìn)行擴(kuò)增。目的基因引物序列：TDO F為GGCTATTATTATCTGCGCTCAACTG，TDO R為AACCAGGTACGATGAGAGGTTAAA，擴(kuò)增產(chǎn)物大小：144bp，最后用2-△△ct法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1234海馬IDO、5HT1A mRNA含量測定方法同1233。目的基因引物序列：IDO F為GACCCGAAAGCACTGGAGA，IDO R為TGCCCTTCCAACCAGACAA，擴(kuò)增產(chǎn)物大?。?20bp；5HT1A F為CTGCCCATGGCTGCTCTGTA，5HT1A R為CATCCAGGGCGATAAACAGGTC，擴(kuò)增產(chǎn)物大?。?32bp，最后用2-△△ct法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。內(nèi)參的引物

13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 170統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來表示。多個(gè)樣本采用單因素方差分析進(jìn)行組間數(shù)據(jù)比較，如方差不齊則采用Dunnett′ s T3法，如方差齊則用LSD法，以P<005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

21蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)的結(jié)果從第21天開始模型組的蔗糖偏好明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；各給藥組均能提高大鼠對蔗糖的偏好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），天絲飲給藥14 d即出現(xiàn)顯著作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。見表1。

22對TRYKYN代謝產(chǎn)物的影響模型組與空白組比較，KYN/TRY比值升高、QUIN含量增加，KA含量減少，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。與模型組比較，各個(gè)給藥組的KYN/TRY比值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；培元解郁方中劑量和天絲飲能升高KA含量，降低QUIN含量，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。見表2。

23對肝組織TDO mRNA表達(dá)的影響與模型組比較，天絲飲可以降低TDO mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。見表3。

24對海馬中IDO mRNA表達(dá)的影響與模型組比較，氟西汀和天絲飲能夠降低海馬中IDO mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。見表4。

25對海馬中5HT1A mRNA表達(dá)的影響與模型組比較，四逆散和培元解郁方中、高劑量能夠增加海馬中5HT1A mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。見表5。

3討論

糖皮質(zhì)激素注射抑郁模型是較為常用的抑郁癥動物模型[56]。本研究中，模型組糖水偏好顯著降低，并伴有TRY代謝異常，陽性藥氟西汀能通過調(diào)節(jié)TRY代謝，對其抑郁行為產(chǎn)生改善作用。中藥復(fù)方天絲飲、四逆散、培元解郁方中、高劑量均能提高大鼠對蔗糖的偏好，體現(xiàn)出較強(qiáng)抗抑郁樣作用，且與氟西汀的效應(yīng)相近。

TRYKYN代謝和應(yīng)激引起的激素變化關(guān)系密切，糖皮質(zhì)激素水平持續(xù)升高可以增加肝內(nèi)主要限速酶TDO的表達(dá)和活性，從而改變TRYKYN代謝。促進(jìn)TRYKYN代謝會耗竭TRY，導(dǎo)致5HT合成減少，皮質(zhì)醇產(chǎn)生增加，大腦皮質(zhì)興奮，表現(xiàn)出情緒不穩(wěn)、煩躁失眠等抑郁癥狀[7]。KYN可代謝產(chǎn)生QUIN和KA，與抑郁癥的發(fā)生有直接關(guān)系[811]。其中，QUIN為NMDA受體的內(nèi)源性激動劑，QUIN生成增加，可能產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性作用，使神經(jīng)元軸突損傷。KA則是NMDA受體的內(nèi)源性拮抗劑，能對抗QUIN產(chǎn)生的神經(jīng)毒性作用，可以保護(hù)神經(jīng)。相關(guān)研究顯示，選擇性NMDA受體拮抗劑，如CGP37849、MK801、GMP等，能使小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動時(shí)間明顯縮短，發(fā)揮抗抑郁作用。而激活NMDA受體可產(chǎn)興奮性毒性作用，使海馬神經(jīng)元受到損害，并使氧化應(yīng)激反應(yīng)加重，最終導(dǎo)致抑郁癥[1215]。

此外，過多的KA又能夠增強(qiáng)肝外組織IDO的活性[16]，導(dǎo)致TRY進(jìn)一步減少，5HT含量降低，后者是抑郁癥形成的主要原因，并與其受體5HT1A減少密切相關(guān)[1718]。

IDO活性可通過產(chǎn)物KYN/TRY的比值判斷，比值越大，則酶的活性越大[19]。本實(shí)驗(yàn)中，各給藥組對KYN/TRY比值有明顯降低作用，顯示出抑制IDO活性的作用。其中，天絲飲可降低TDO和IDO mRNA的表達(dá)水平，因此，降低糖皮質(zhì)激素引起的TDO、IDO表達(dá)增加，可能是天絲飲產(chǎn)生抗急性應(yīng)激抑郁的機(jī)制。另外，天絲飲和培元解郁方中劑量能夠降低QUIN的含量，提高KA的含量，表現(xiàn)出抑制喹啉酸興奮性毒性，提高KA神經(jīng)保護(hù)作用的調(diào)節(jié)機(jī)制。四逆散和培元解郁方中、高劑量則表現(xiàn)出增加海馬5HT1A mRNA表達(dá)，提高5HT神經(jīng)系統(tǒng)功能的作用。

總之，天絲飲、四逆散和培元解郁方均有改善氫化可的松引起的大鼠抑郁行為作用，其機(jī)制與抑制IDO引起的TRY代謝異常有關(guān)。其中，天絲飲對TDO、IDO表達(dá)有較明顯的抑制作用，并能通過調(diào)節(jié)QUIN和KA的產(chǎn)生發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。四逆散能明顯促進(jìn)5HT系統(tǒng)神經(jīng)元功能。合方培元解郁方能通過上述綜合機(jī)制發(fā)揮抗抑郁作用，但對TDO、IDO表達(dá)作用不及天絲飲。結(jié)合本課題前期研究成果[4，20]，我們認(rèn)為，抑制IDO，有效地降低TRY代謝異常造成神經(jīng)損傷，并通過5HT5HT1A調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能，可能是培元解郁方抗抑郁的機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1]申子龍，龐博，宮晴，等.《傷寒論》四逆散證治及組方研究[J].中醫(yī)雜志，2013，54（17）：15241526.

[2]王慧慧，張百霞，葉小，等.基于“中藥作用機(jī)理輔助解析系統(tǒng)”的四逆散抗抑郁作用機(jī)制研究[J].中國中藥雜志，2015，40（19）：37233728.

[3]周靜洋，魯藝，徐向青，等.天絲飲的抗抑郁作用及其對IDO的調(diào)節(jié)[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，38（3）：182185.

[4]周靜洋，李麗娜，魯藝，等.培元解郁方方對IFNγ誘導(dǎo)抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)元可塑性的影響[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，11（8）：10831086.

[5]秦琴，劉利學(xué).抑郁癥動物模型概述及評價(jià)[J].實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)，2010，27（1）：5359.

[6]何書芬，居文政，胡浩彬，等.腎陽虛型抑郁癥大鼠模型的建立和評價(jià)[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2017，33（1）：140143.

[7]Oglodek E，Szota A，Just M，et al.The role of the neuroendocrine and immune systems in the pathogenesisof depression[J].Pharmacological Reports，2014，66（5）：776781.

[8]劉宇凝，蔣春雷，王云霞.炎癥誘發(fā)抑郁癥：吲哚胺2，3雙加氧酶的激活是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12（14）：27512756，2762.

[9]管西婷，林文娟.抑郁癥發(fā)病機(jī)理中的重要調(diào)節(jié)因子：吲哚胺2，3雙加氧酶[J].心理科學(xué)進(jìn)展，2013，21（6）：951957.

[10]王麗莎，劉新民，馮利，等.犬尿氨酸通路在神經(jīng)退行性疾病中的研究進(jìn)展[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2015，25（11）：6975.

[11]王道涵，王素梅，衛(wèi)利，等.犬尿酸代謝途徑異常與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾[J].生理科學(xué)進(jìn)展，2016，47（1）：4346.

[12]Guillemin GJ.Quinolinic acid，the inescapable neurotoxin[J].Febs Journal，2012，279（8）：13561365.

[13]陳慧彬，李菲，吳帥，等.應(yīng)激性抑郁樣行為發(fā)生中海馬喹啉酸對谷氨酸及其受體的調(diào)節(jié)[J].生理學(xué)報(bào)，2013，65（6）：577585.