轉(zhuǎn)CmCSA基因雙鏈RNA水稻的RNAi效應(yīng)鑒定

趙鳳 杜娟 李尚偉 張澤杰

摘?要：稻縱卷葉螟是危害水稻的主要害蟲(chóng)之一，幾丁質(zhì)合成酶是昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成通路上最后一個(gè)酶，對(duì)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。本研究對(duì)轉(zhuǎn)稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶A基因雙鏈RNA（dsCmCSA）水稻進(jìn)行了室內(nèi)和田間RNA干擾（RNAi）效應(yīng)鑒定。結(jié)果表明，相比于對(duì)照組，取食轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻的稻縱卷葉螟體型變小，蛻皮困難，出現(xiàn)畸形表型，死亡率明顯增加。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）分析表明，取食轉(zhuǎn)基因水稻株系CAⅡ-5的幼蟲(chóng)體內(nèi)CmCSA表達(dá)量比對(duì)照組下降了54.00%。田間實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻株系CAⅡ-5的卷葉率和白葉率分別為7.98%和5.04%，與對(duì)照組差異顯著。轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻具有明顯的RNAi效應(yīng)，抗蟲(chóng)效果較好。該研究為利用轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)對(duì)稻縱卷葉螟進(jìn)行綠色防控奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：稻縱卷葉螟;幾丁質(zhì)合成酶A;RNA干擾;抗蟲(chóng)性

中圖分類(lèi)號(hào)：Q966

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2018）06-0036-05?國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.007

水稻是一種主要的谷類(lèi)糧食作物，全球有一半以上的人口以大米為食。我國(guó)是主要的稻米生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)之一，因此，水稻的豐產(chǎn)和我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有緊密的聯(lián)系。稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis），俗稱(chēng)卷葉蟲(chóng)、苞葉蟲(chóng)等，屬于鱗翅目（Lepidoptera）螟蛾科（Pyralidae），是危害水稻的四大害蟲(chóng)之一，嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量[1-2]。稻縱卷葉螟是一種典型的遷飛性害蟲(chóng)，目前對(duì)該蟲(chóng)的防治方法主要是噴灑農(nóng)藥，但由于長(zhǎng)期使用化學(xué)藥物，不僅帶來(lái)嚴(yán)重的“3R”問(wèn)題，還使得糧食的安全問(wèn)題日益突顯。因此，尋找一種綠色、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)的害蟲(chóng)防治方法迫在眉睫。

幾丁質(zhì)（chitin）是存在于自然界中的一類(lèi)天然多聚物，是昆蟲(chóng)外骨骼、氣管、中腸等組織的重要組分，對(duì)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖等生理過(guò)程具有重要作用[3]。昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)的合成是一個(gè)由多種酶參與調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，其中幾丁質(zhì)合成酶（chitin synthase）是幾丁質(zhì)合成通路中最后一個(gè)酶，能催化UDP-N-乙酰氨基葡糖形成幾丁質(zhì)多聚物，在幾丁質(zhì)合成過(guò)程中至關(guān)重要，是控制害蟲(chóng)的理想靶標(biāo)。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是機(jī)體抵抗病毒或其它外來(lái)核酸入侵的重要保護(hù)性機(jī)制，由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）抑制細(xì)胞內(nèi)與其同源基因的表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象（post-transcriptional gene silencing，PTGS）[4]。由于RNAi作用具有高度的特異性、高效性和放大效應(yīng)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于如抗人體病毒研究、腫瘤治療、植株品種改良等生物領(lǐng)域[5]。在昆蟲(chóng)學(xué)中，RNAi技術(shù)主要用于基因功能研究以及害蟲(chóng)的防治，研究者將體外合成靶標(biāo)基因的dsRNA或小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）通過(guò)飼喂、注射、轉(zhuǎn)基因等方式導(dǎo)入昆蟲(chóng)體內(nèi)引發(fā)RNAi效應(yīng)，獲得目標(biāo)基因的生理缺陷，從而一方面可鑒定昆蟲(chóng)基因功能，另一方面也達(dá)到防治害蟲(chóng)的目的。Chen等[6]通過(guò)RNAi沉默甜菜夜蛾Spodoptera exigua 幾丁質(zhì)合成酶A基因（SeCSA），昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，出現(xiàn)蛻皮障礙、表皮幾丁質(zhì)層不能正常形成、氣管發(fā)育畸形等現(xiàn)象。Mao等[7]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將細(xì)胞色素P450基因?qū)朊藁ㄖ校掴徬x(chóng) Helicoverpa armigera在取食表達(dá)靶標(biāo)基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因棉花后出現(xiàn)發(fā)育遲緩癥狀。應(yīng)用 RNAi 技術(shù)能有效地保護(hù)農(nóng)作物抵抗害蟲(chóng)危害，在農(nóng)作物遺傳改良進(jìn)行精準(zhǔn)抗蟲(chóng)方面具有重大的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)室利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得表達(dá)稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶A（CmCSA）基因dsRNA （dsCmCSA）的轉(zhuǎn)基因水稻。本研究用轉(zhuǎn)基因水稻子一代植株葉片分別在室內(nèi)和田間飼喂稻縱卷葉螟3齡幼蟲(chóng)，鑒定轉(zhuǎn)基因水稻株系的RNAi效應(yīng)，旨在為利用轉(zhuǎn)基因RNAi防治稻縱卷葉螟奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?供試?yán)ハx(chóng)與水稻

供試?yán)ハx(chóng)稻縱卷葉螟由本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)[8]。在人工氣候箱內(nèi)用稻苗飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為：溫度（26±1）℃，相對(duì)濕度70%～80%，光周期14L∶10D。供試水稻為本實(shí)驗(yàn)室種植的轉(zhuǎn)dsCmCSA 的中花11。

1.2?引物設(shè)計(jì)

利用Primer 6.0根據(jù)轉(zhuǎn)基因水稻靶標(biāo)片段設(shè)計(jì)特異性PCR引物，同時(shí)針對(duì)CmCSA的開(kāi)放閱讀框序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）引物（表 1），檢測(cè)取食轉(zhuǎn)基因水稻植株的稻縱卷葉螟CmCSA基因mRNA表達(dá)水平。以稻縱卷葉螟看家基因CmActin（GenBank登錄號(hào)：JN029806）為內(nèi)參對(duì)照。

1.3?轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻的PCR檢測(cè)

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法分株提取8個(gè)轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻子一代株系（CAⅠ-3.1、CAⅠ-3.2、CAⅡ-2、CAⅡ-3.1、CAⅡ-3.2、CAⅡ-4.1、CAⅡ-4.2和CAⅡ-5）的DNA，以其為模板，利用表1中的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)水稻植株中是否存在轉(zhuǎn)入的目標(biāo)序列。反應(yīng)條件：95℃ 3 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共36個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸10 min，10℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4?室內(nèi)抗蟲(chóng)性檢測(cè)

用葉片測(cè)定法進(jìn)行RNAi水稻的室內(nèi)抗蟲(chóng)性鑒定。分別剪取8個(gè)轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻株系的5片葉，用浸有保鮮液的棉花包裹好后放入不同的玻璃直管（12 cm×3 cm）中，每管接15頭稻縱卷葉螟3齡幼蟲(chóng)，將玻璃直管兩端用紗布封口，然后將玻璃直管置于條件為：溫度（26±1）℃，相對(duì)濕度70%～80%，光周期14L∶10D的人工培養(yǎng)箱，每天定時(shí)在直管兩端噴灑保鮮液，3 d更換一次葉片。用正常水稻作為對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。每隔24 h，觀察記錄幼蟲(chóng)取食、表型及存活情況。

1.5?死亡率與校正死亡率

稻縱卷葉螟取食轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻后，檢測(cè)CmCSA敲低對(duì)稻縱卷葉螟生長(zhǎng)的影響。在接蟲(chóng)7 d后統(tǒng)計(jì)死亡率和校正死亡率，死亡率計(jì)算公式：死亡率=死亡蟲(chóng)數(shù)/總蟲(chóng)數(shù)×100%;校正死亡率計(jì)算公式：校正死亡率=（實(shí)驗(yàn)組死亡率-對(duì)照組死亡率）/（1-對(duì)照組死亡率） ×100%。

1.6?CmCSA基因沉默效應(yīng)檢測(cè)

為了更精確地檢測(cè)RNAi效應(yīng)，使用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)取食轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻植株的稻縱卷葉螟體內(nèi)CmCSA的mRNA表達(dá)水平，以CmActin為內(nèi)參對(duì)照。在稻縱卷葉螟3齡幼蟲(chóng)取食轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻植株葉片7 d 后，分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組玻璃直管中各2頭存活的幼蟲(chóng)，用HP Total RNA Kit（Omega Bio-tek，USA）分別提取總RNA，具體步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000分別檢測(cè)總RNA的完整性和純度。按照PrimeScript RT-PCR Kit（TaKaRa，China）試劑盒說(shuō)明書(shū)，取1 μL總RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL：1 μL RNA，1 μL Olige （dT）18 Primer，4 μL 5×Reaction Buffer，1 μL RNase Inhibitor（20 U/μL），2 μL dNTP Mixture，1 μL Revert Aid M-MuLV RTase （200 U/μL），10 μL RNase free Water。反應(yīng)條件為：42℃ 60 min，70℃ 5 min。然后以cDNA為模板在C1000 qPCR儀上進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系：1 μL cDNA，20 μmol/L上/下游引物各0.5 μL，10 μL 2× iTaq universal SYBR Green supermix （Bio-Rad，USA），補(bǔ)加滅菌水到總體積20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用CFX Manager軟件（Bio-Rad，USA）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄與分析。

1.7?田間抗蟲(chóng)性檢測(cè)

將轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻以小區(qū)塊種植于惠水縣試驗(yàn)田，選25株罩上尼龍網(wǎng)，至分蘗盛期（7月下旬），在每個(gè)網(wǎng)中的水稻上人工接種50頭稻縱卷葉螟低齡幼蟲(chóng)，30 d后統(tǒng)計(jì)水稻的卷葉率和白葉率。平均每株卷葉率=卷葉數(shù)/網(wǎng)中水稻葉片總數(shù)/25;平均每株白葉率=白葉數(shù)/網(wǎng)中水稻葉片總數(shù)/25。每個(gè)處理重復(fù)3次，以正常水稻作為對(duì)照。

1.8?數(shù)據(jù)與分析

采用2-ΔΔCt 法分析稻縱卷葉螟取食轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻葉片后，其體內(nèi)CmCSA基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制柱形圖。采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件中的方差分析（ANOVA）的最小顯著性差異（LSD）法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)（P <0.05）。

2?結(jié)果與分析

2.1?轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻的外源DNA片段檢測(cè)

以不同轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻植株的DNA為模板，進(jìn)行PCR檢測(cè)，電泳結(jié)果顯示轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻子一代植株存在靶標(biāo)DNA片段，可以用于后續(xù)的抗蟲(chóng)性鑒定實(shí)驗(yàn)。

2.2?CmCSA基因mRNA表達(dá)水平

在稻縱卷葉螟幼蟲(chóng)取食轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻7 d 后，分別提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組稻縱卷葉螟總RNA，進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，在取食8個(gè)不同轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻植株后，稻縱卷葉螟幾丁質(zhì)合成酶A基因的表達(dá)水平明顯下降，與對(duì)照組相比，差異顯著。因此，取食轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻后，稻縱卷葉螟體內(nèi)CmCSA基因具有明顯的沉默效應(yīng)。

2.3?取食和表型變化

接蟲(chóng)后每隔24 h觀察稻縱卷葉螟幼蟲(chóng)的取食情況，檢測(cè)轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻子一代株系對(duì)試蟲(chóng)的RNAi效應(yīng)。結(jié)果顯示，在取食表達(dá)CmCSA dsRNA水稻葉片24 h后，稻縱卷葉螟幼蟲(chóng)的取食情況和對(duì)照組沒(méi)有明顯差異;但48 h后，實(shí)驗(yàn)組幼蟲(chóng)出現(xiàn)明顯的拒食現(xiàn)象，而對(duì)照組水稻葉片被大量取食。在接蟲(chóng)7 d后，實(shí)驗(yàn)組幼蟲(chóng)明顯小于對(duì)照組，蛻皮困難，出現(xiàn)畸形和死亡現(xiàn)象;部分存活幼蟲(chóng)也不能正常化蛹，即使能夠化蛹，但是蛹明顯小于對(duì)照組或出現(xiàn)畸形。這些結(jié)果表明，取食轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻葉片后，稻縱卷葉螟幼蟲(chóng)活力降低，生長(zhǎng)發(fā)育受阻。

1，4：取食正常水稻葉片的幼蟲(chóng); 2：取食轉(zhuǎn)基因水稻葉片的幼蟲(chóng)變小; 3：取食轉(zhuǎn)基因水稻葉片的幼蟲(chóng)出現(xiàn)畸形;5，7，9：取食正常水稻葉片的幼蟲(chóng)能正?；?6，8：取食轉(zhuǎn)基因水稻葉片的幼蟲(chóng)不能化蛹;10：取食轉(zhuǎn)基因水稻葉片的幼蟲(chóng)化成的蛹變小

2.3?死亡率與校正死亡率

接蟲(chóng)7 d 后，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組幼蟲(chóng)存活情況，結(jié)果表明，在分別取食8個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻植株7 d后，相較于對(duì)照組（701），稻縱卷葉螟死亡率大幅增加，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（表2）。這些結(jié)果表明，RNAi效應(yīng)明顯，轉(zhuǎn)基因水稻子一代株系對(duì)稻縱卷葉螟產(chǎn)生明顯的致死效應(yīng)。

2.5?田間抗蟲(chóng)性檢測(cè)

在田間人工接蟲(chóng)30 d后，轉(zhuǎn)基因水稻株系的卷葉率和白葉率明顯少于對(duì)照組（表3），二者之間差異顯著。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)dsCmCSA水稻能引發(fā)RNAi效應(yīng)，稻縱卷葉螟選擇性拒食這些轉(zhuǎn)基因水稻。

3?結(jié)論與討論

幾丁質(zhì)是昆蟲(chóng)體壁、中腸、氣管等多個(gè)組織的重要組成成分，對(duì)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、蛻皮、繁殖具有重要作用。幾丁質(zhì)的合成是一個(gè)有多種酶參與調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，幾丁質(zhì)合成酶是幾丁質(zhì)合成通路上的最后一個(gè)酶，對(duì)昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)的合成至關(guān)重要。幾丁質(zhì)合成酶是無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)特有的酶，故常被作為潛在綠色殺蟲(chóng)劑的理想靶標(biāo)。本研究中，通過(guò)給稻縱卷葉螟飼喂表達(dá)CmCSA基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因水稻葉片，可以觀察到試蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育受阻，蛻皮困難，并出現(xiàn)畸形，最終導(dǎo)致死亡;部分能完成蛻皮，體型比對(duì)照組幼蟲(chóng)小，無(wú)法繼續(xù)生長(zhǎng)至化蛹;或者能夠化蛹，但是蛹的大小明顯小于對(duì)照組或發(fā)育為畸形蛹。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，CmCSA基因被有效沉默，mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組。我們推測(cè)出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能是由于CmCSA表達(dá)下降，幾丁質(zhì)合成通路紊亂，幾丁質(zhì)含量降低，影響新表皮的形成，導(dǎo)致試蟲(chóng)蛻皮困難，發(fā)育阻滯。Chen等[6]發(fā)現(xiàn)SeCSA表達(dá)被抑制之后，甜菜夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育受到阻礙，蟲(chóng)體無(wú)法正常完成蛻皮，即使完成蛻皮，蟲(chóng)體小于正常幼蟲(chóng)，無(wú)法繼續(xù)生長(zhǎng)至蛹。Arakane 等[9]干擾赤擬谷盜Tribolium castaneum幾丁質(zhì)合成酶基因（TcCHS1），發(fā)現(xiàn)TcCHS1能影響幼蟲(chóng)-幼蟲(chóng)，幼蟲(chóng)-蛹和蛹-成蟲(chóng)的蛻皮，且對(duì)于昆蟲(chóng)的繁殖和卵的孵化都有影響。Zhang 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，飛蝗Locusta migratoria 2 齡若蟲(chóng)LmCHS1 （LmCHSA）被抑制后，飛蝗蛻皮時(shí)新舊表皮難以分離，無(wú)法正常完成蛻皮，最終死亡。以上研究結(jié)果表明，CSA在昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中至關(guān)重要，該基因表達(dá)下降直接影響昆蟲(chóng)的正常生長(zhǎng)發(fā)育。

自2001年Johansen首次通過(guò)構(gòu)建了具有綠色熒光蛋白基因（GFP）回文序列的重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入煙草中成功表達(dá)dsRNA，成功沉默轉(zhuǎn)GFP基因煙草中的熒光信號(hào)以來(lái)，培育表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因作物技術(shù)已逐漸成熟，并已經(jīng)被用于研究多種植食性昆蟲(chóng)的防治[12]。2007年，Baum等[13]通過(guò)飼喂表達(dá)V-ATP基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因玉米，發(fā)現(xiàn)玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera發(fā)育遲緩，死亡率升高，顯著減少其對(duì)玉米的為害，對(duì)玉米有顯著的保護(hù)作用;同年Mao等[7]將棉鈴蟲(chóng)H.armigera中與解毒代謝直接相關(guān)的CYP6AE14 dsRNA在擬南芥和煙草上成功表達(dá)，使得取食轉(zhuǎn)基因植物的棉鈴蟲(chóng)CYP6AE14基因表達(dá)受到抑制，從而使棉鈴蟲(chóng)對(duì)棉子酚的抗性顯著降低，導(dǎo)致其出現(xiàn)發(fā)育遲緩癥狀。這兩項(xiàng)研究結(jié)果表明，通過(guò)RNAi介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植物用于害蟲(chóng)控制有巨大的潛能。在此之后，RNAi介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)成功被用于多種害蟲(chóng)的防治。如Han等[14]飼喂棉鈴蟲(chóng)H.armigera表達(dá)dsHaHR3的棉花，導(dǎo)致棉鈴蟲(chóng)畸形并大幅死亡，棉花產(chǎn)量大幅增加;Zha等[15]通過(guò)在水稻中表達(dá)褐飛虱Nilaparvata lugens中腸里高表達(dá)的3個(gè)基因NlHT1、Nlcar和Nltry，取食轉(zhuǎn)基因水稻的褐飛虱，這3個(gè)基因均有效地被沉默;Mao等[16]研究發(fā)現(xiàn)，取食表達(dá)hunchback基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因煙草后，煙蚜Myzus persicae繁殖受阻，hunchback基因的表達(dá)顯著被抑制。上述研究表明，選擇合適的靶標(biāo)基因，通過(guò)植物介導(dǎo)的RNAi沉默昆蟲(chóng)體內(nèi)的特定基因表達(dá)，能夠控制蟲(chóng)害的發(fā)生，這將有效減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，降低環(huán)境污染，為作物害蟲(chóng)防治開(kāi)辟了新的領(lǐng)域。

參?考?文?獻(xiàn)：

[1]?申效誠(chéng)，張桂芬，薛俊杰，等.稻縱卷葉螟的預(yù)報(bào)系統(tǒng)模型[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1988，21（3）：58-64.

[2]?鐘承茂.稻縱卷葉螟的為害癥狀與發(fā)生規(guī)律[J].農(nóng)技服務(wù)，2008，25（1）：40-60.

[3]?ZHUO W，F(xiàn)ANG Y.，KONG L，et al.Chitin synthase A：a novel epidermal development regulation gene in the larvae of Bombyx mori[J].Molecular Biology Reports，2014，41（7）：4177-4186.

[4]?FIRE A，XU S，MONTGOMERY MK，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature，1998，391（6669）：806-811.

[5]?林?晨.茶尺蠖幾丁質(zhì)合成酶基因克隆及其雙鏈干涉重組病毒毒力研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2010.

[6]?CHEN XF，TIAN HG，ZOU LZ，et al.Disruption of Spodoptera exigua larval development by silencing chitin synthase gene A with RNA interference[J].Bulletin of Entomological Research，2008，98（6）：613-619.

[7]?MAO YB，CAI WJ，WANG JW，et al.Silencing a cotton bollworm P450 monooxygenase gene by plant-mediated RNAi impairs larval tolerance of gossypol[J].Nature Biotechnology，2007，25（11）：1307-1313.

[8]?田?宇，杜?娟，李尚偉，等.稻縱卷葉螟海藻糖酶基因的克隆、分子特性和表達(dá)分析[J].昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2016，59（6）：602-612.

[9]?ARAKANE Y，MUTHUKRISHNAN S，KRAMER KJ，et al.The Tribolium chitin synthase genes TcCHS1 and TcCHS2 are specialized for synthesis of epidermal cuticle and midgut peritrophic matrix[J].Insect Molecular Biology，2010，14（5）：453-463.

[10]?ZHANG JZ，LIU XJ，ZHANG JQ，et al.Silencing of two alternative splicing-derived mRNA variants of chitin synthase 1 gene by RNAi is lethal to the oriental migratory locust，Locusta migratoria （Meyen）[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology，2010，40（11）：824-833.

[11]?李大琪，王?燕，張建琴，等.中華稻蝗幾丁質(zhì)酶基因10（OcCht10）的分子特性及功能[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（7）：1313-1320.

[12]?JOHANSEN LK; CARRINGTON JC.Silencing on the spot.Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system[J].Plant physiology，2001，126（3）：930-938.

[13]?BAUM JA，BOGAERT T，CLINTON W，et al.Control of coleopteran insect pests through RNA interference[J].Nature Biotechnology，2007，25（11）：1322-1326.

[14]?HAN Q，WANG Z，HE Y，et al.Transgenic Cotton Plants Expressing the HaHR3 Gene Conferred Enhanced Resistance to Helicoverpa armigera and Improved Cotton Yield[J].International Journal of Molecular Sciences，2017，18（9）：1874-1886.

[15]?ZHA W，PENG X，CHEN R， et al.Knockdown of Midgut Genes by dsRNA-Transgenic Plant-Mediated RNA Interference in the Hemipteran Insect Nilaparvata lugens[J].Plos One，2011，6（5）：e20504.

[16]?MAO J，ZENG F.Plant-mediated RNAi of a gap gene-enhanced tobacco tolerance against the Myzus persicae[J].Transgenic Research，2014，23（1）：145-152.