一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定車(chē)前子配方顆粒中3種成分含量

田方 李軍山 常云鳳 高晗 李雪利

摘 要：為實(shí)現(xiàn)對(duì)車(chē)前子配方顆粒多指標(biāo)成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)，解決中藥化學(xué)對(duì)照品分離難度大、單體性質(zhì)不穩(wěn)定、供應(yīng)價(jià)格高等問(wèn)題，建立了一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定車(chē)前子配方顆粒中的3種有效成分含量。以京尼平苷酸為內(nèi)標(biāo)物，建立與蘆丁、毛蕊花糖苷的相對(duì)校正因子，測(cè)定其含量，同時(shí)采用外標(biāo)法測(cè)定這3種成分的含量，比較兩種方法的結(jié)果差異。結(jié)果表明：京尼平苷酸、蘆丁、毛蕊花糖苷分別在0.804～8.040，0.172～1.720，0.158～1.580 μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好（r≥0.999），平均加樣回收率分別為102.52%，102.00%和101.86%，RSD值分別為1.64%，1.06%和1.07%。一測(cè)多評(píng)法所得結(jié)果與外標(biāo)法差異不明顯，具有較高的重復(fù)性、穩(wěn)定性及可信度，可為車(chē)前子配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：中藥化學(xué);車(chē)前子配方顆粒;京尼平苷酸;蘆丁;毛蕊花糖苷;一測(cè)多評(píng)

中圖分類(lèi)號(hào)：R2841 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Simultaneous determination of three constituents in Plantago

Seed formula granules by QAMS

TIAN Fang1， LI Junshan1，2， CHANG Yunfeng1， GAO Han1， LI Xueli1

（1. Shineway Pharmaceutical Group Company Limited， Shijiazhuang， Hebei 051430， China;2. TCM Formula Granule Engineering Technology Research Center of Hebei， Shijiazhuang， Hebei ?050200， China）

Abstract：In order to achieve the quality evaluation of the multi-index components of Plantago Seed Formula Granules and to solve the problem of the difficulty in separating the chemical reference substances of traditional Chinese medicine and the unstable supply price of monomer properties， the quantitative analysis of multi-components by single marker （QAMS） is established to simultaneously determine the content of three effective components in Plantago Seed formula granules.Geniposidic acid is used as the internal reference substance， and the relative correction factor of Rutin and Verbascoside is established respectively， measuring the content， and the three constituents are determined by the relative correction factor. At the same time， the content of the 3 components is determined by external standard method， and the difference between the results of the two methods is compared. Geniposidic acid， Rutin and Verbascoside show good linear relationships within the ranges of 0.804～8.040，0172～1.720，0.158～1.580 μg（r≥0.999），whose average recovery rate is 102.52%，102.00%，101.86%，and the RSD is 164%，1.06%，1.07% correspondingly. The results obtained by QAMS are close to the external standard method. The results turn out that it is no obviously difference between the two Methods and the quantitative analysis of multi-components by single marker （QAMS） is accurate and feasible， which could provide a reference for the quality evaluation of Plantago Seed formula granules.

Keywords：chemistry of Chinese materia medica;Plantago Seed formula granules; Geniposidic acid; Rutin; Verbascoside; quantitative analysis of multi-components by single marker （QAMS）

車(chē)前子為車(chē)前科植物車(chē)前Plantago asiatica L.或平車(chē)前Plantago depressa Willd.的干燥成熟種子，性寒，味甘，歸肝、腎、肺、小腸經(jīng)，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，具有清熱利尿通淋、滲濕止瀉、明目、祛痰的功效，用于治療熱淋澀痛、水腫脹滿(mǎn)、暑濕泄瀉、目赤腫痛、痰熱咳嗽[1]，主產(chǎn)于江西、河南等地。本研究所用樣品為車(chē)前的干燥成熟種子經(jīng)水提取、濃縮、噴霧干燥而制成的顆粒，具有免煎易服、攜帶方便、計(jì)量準(zhǔn)確、調(diào)配方便等優(yōu)點(diǎn)，受到廣大醫(yī)患人員的歡迎[2]，但關(guān)于該制劑的質(zhì)量控制方法目前尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)報(bào)道也較少。

車(chē)前子配方顆粒的臨床療效是其活性成分、藥理活性的綜合體現(xiàn)，僅以單指標(biāo)成分評(píng)價(jià)其質(zhì)量高低有一定的局限性，難以體現(xiàn)制劑的整體質(zhì)量。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》收錄了一測(cè)多評(píng)法測(cè)定黃連、丹參等藥材成分的含量，很好地解決了中藥化學(xué)對(duì)照品分離難度大、單體性質(zhì)不穩(wěn)定、供應(yīng)價(jià)格高等問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了中藥多指標(biāo)的質(zhì)量評(píng)價(jià)[3-4]。也有研究人員報(bào)道了采用HPLC-DAD，對(duì)配方顆粒多種成分實(shí)現(xiàn)了中藥多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)[5]。筆者采用一測(cè)多評(píng)法，測(cè)定車(chē)前子配方顆粒中京尼平苷酸、蘆丁、毛蕊花糖苷的含量，建立了用一種中藥化學(xué)對(duì)照品同時(shí)評(píng)價(jià)3種成分含量的方法，探討了該方法的可行性與適用性。

1 主要儀器與材料

高效液相色譜儀，日本島津公司提供;AE 240電子分析天平，瑞士Mettler-Toledo有限公司提供;KH-3200E超聲波清洗器，江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司提供。

京尼平苷酸對(duì)照品（批號(hào)為11828-201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.4%），蘆丁對(duì)照品（批號(hào)為11630-201607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.2%），毛蕊花糖苷對(duì)照品（批號(hào)為111530-201512，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.7%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;車(chē)前子配方顆粒，共12批，分別購(gòu)自神威藥業(yè)、三九企業(yè)集團(tuán)、江陰天江藥業(yè)、四川新綠色藥業(yè)、湖北康仁堂藥業(yè)、廣東一方制藥有限公司;乙腈，色譜純;其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果[STBZ][6-10]

2.1 色譜條件

Waters C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相為乙腈-0.5%（體積分?jǐn)?shù)，下同）冰醋酸，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min。流動(dòng)相梯度洗脫條件見(jiàn)表1，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 供試品溶液的制備

取車(chē)前子配方顆粒，研細(xì)，精密稱(chēng)取0.50 g，置入具塞錐形瓶中，精密加入60%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（250 W，40 kHz）60 min。取出，室溫放置，用60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取京尼平苷酸、蘆丁、毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，加入一定量的60%的甲醇，制成0.402，0.086，0.079 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品溶液2，6，10，12，16，20 μL，注入液相色譜儀，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，各成分在各自范圍內(nèi)的線(xiàn)性關(guān)系均良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、蘆丁精密度RSD值分別為0.23%，0.19%和0.28%，表明儀器的精密度良好。儀器精密度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，于0，2，4，6，10，12，16，18和24 h分別進(jìn)樣，測(cè)得京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、蘆丁峰面積RSD值分別為0.42%，0.34%和0.32%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。穩(wěn)定性考察結(jié)果詳見(jiàn)表4。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，測(cè)得京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、蘆丁

峰面積與取樣量比值的RSD值分別為0.38%，0.32%和0.27%，表明方法的重復(fù)性良好。重復(fù)性考察結(jié)果見(jiàn)表5。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的同一樣品各0.10 g，共6份，分別按樣品含量的80%，100%，120%加入

對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計(jì)算其回收率，結(jié)果見(jiàn)表6。

2.5 相對(duì)校正因子測(cè)定[STBZ][11-15]

2.5.1 計(jì)算方法

取混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣2，6，10，16，20 μL，按公式fk/m=fk/fm=Wk×Am/（Wm×Ak）計(jì)算相對(duì)校正因子。其中：Ak為內(nèi)標(biāo)物峰面積;Wk為內(nèi)標(biāo)物濃度;Am為組分m的峰面積;Wm為組分m的濃度。以京尼平苷酸為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算蘆丁、毛蕊花糖苷相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表7。

2.5.2 耐用性考察

在3種不同廠(chǎng)家高效液相色譜儀和3種不同型號(hào)的色譜柱上進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算平均值，結(jié)果見(jiàn)表8;測(cè)定在不同柱溫、流速下的相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表9和表10。

2.5.3 色譜峰定位

利用相對(duì)保留時(shí)間對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行定位，考察不同品牌色譜柱的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果表明，各組分在6種不同品牌色譜柱中的出峰順序相同，蘆丁、毛蕊花糖苷的相對(duì)保留時(shí)間分別為1.68和1.72，RSD值分別為1.22%和1.41%，表明相對(duì)保留時(shí)間可以用于色譜峰的定位。

2.5.4 樣品含量測(cè)定

按“2.2”項(xiàng)下方法制備12批車(chē)前子配方顆粒供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表11所示。由表11可知，2種方法所得結(jié)果差異不明顯（RSD值<3.0%），表明一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異。

3 討 論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用DAD檢測(cè)器對(duì)供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，紫外光譜圖見(jiàn)圖2。研究發(fā)現(xiàn)，京尼平苷酸、蘆丁、毛蕊花糖苷的最大吸收波長(zhǎng)分別為238，255，328 nm。綜合考慮色譜圖的基線(xiàn)、分離度、數(shù)目及峰面積，最終選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。

3.2 供試品溶液制備方法選擇

對(duì)供試品的提取溶劑（25%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、甲醇、水）和超聲時(shí)間（10，30，60 min）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)采用60%甲醇超聲60 min時(shí)，各成分的提取效率較高，色譜圖的峰型較好。

3.3 內(nèi)標(biāo)物的選擇

京尼平苷酸、蘆丁、毛蕊花糖苷在車(chē)前子配方顆粒中的含量較高，由于京尼平苷酸化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，且2015版《中華人民共和國(guó)藥典》將其作為車(chē)前子藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣的評(píng)價(jià)指標(biāo)，故選擇京尼平苷酸作為內(nèi)標(biāo)物。

4 結(jié) 論

1）目前中藥化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量和種類(lèi)仍不能滿(mǎn)足質(zhì)量檢測(cè)的需要，實(shí)際應(yīng)用中常采用分別檢測(cè)有效成分的方法來(lái)控制中藥及其制劑的質(zhì)量，檢測(cè)效率較低，檢測(cè)成本偏高。一測(cè)多評(píng)法利用中藥中各成分間的相對(duì)校正因子同時(shí)測(cè)定多個(gè)有效成分，實(shí)現(xiàn)了在對(duì)照品缺乏的情況下進(jìn)行中藥多成分的質(zhì)量控制，顯著降低了檢測(cè)成本，提高了工作效率，對(duì)于中藥及其制劑的研究與開(kāi)發(fā)具有重要意義。

2）以車(chē)前子配方顆粒為研究對(duì)象，通過(guò)方法學(xué)考察、相對(duì)校正因子確認(rèn)、耐用性考察、色譜峰定位等過(guò)程，對(duì)一測(cè)多評(píng)方法的可行性與適用性進(jìn)行了探討，所得結(jié)果與外標(biāo)法差異不明顯，具有較高的重復(fù)性、穩(wěn)定性及可信度，可為車(chē)前子配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

3）筆者僅對(duì)6個(gè)生產(chǎn)廠(chǎng)家12批次的配方顆粒進(jìn)行了研究，對(duì)于更多批次和其他廠(chǎng)家的數(shù)據(jù)有待進(jìn)一步加以研究;此外，對(duì)于不同產(chǎn)地的車(chē)前子制成的配方顆粒的相對(duì)校正因子、相對(duì)保留時(shí)間也未進(jìn)行考察。針對(duì)以上不足，一測(cè)多評(píng)法測(cè)定車(chē)前子配方顆粒中多種成分含量的相關(guān)研究需要進(jìn)一步對(duì)藥材的產(chǎn)地和批次進(jìn)行考察，以明確方法的普遍適用性。

參考文獻(xiàn)/References：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：68-69.

[2] 常云鳳，郝磊，張肖建，等.不同廠(chǎng)家五味子配方顆粒的質(zhì)量比較[J].中國(guó)藥物警戒，2017，14（5）：278-282.

CHANG Yunfeng，HAO Lei，ZHANG Xiaojian ，et al.Quality comparation of Schisandra formula particles from different manufacturers[J].Chinese Journal of Pharmacovigilance，2017，14（5）：278-282.

[3] 王智民，錢(qián)忠直，張啟偉，等.一測(cè)多評(píng)法建立的技術(shù)指南[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36（6）：657-658.

[4] 李軍山，聶麗建.HPLC-DAD測(cè)定仙鶴草配方顆粒中3種成分[J].河北工業(yè)科技，2018，35（4）：288-293.

LI Junshan，NIE Lijian.Determination of three constituents in Agrimoniae Herba formula granules by HPLC-DAD[J]. Hebei Journal of Industrial Science and Technology， 2018，35（4）：288-293.

[5] 孫立磊，包永睿，孟憲盛，等.一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定川芎中5種成分[J].中成藥，2016，38（11）：2503-2505.

[6] 俞燕，鐘瑞建，丁劍虹，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地車(chē)前子生品及鹽炙品中3個(gè)主要活性成分的含量[J].藥物分析雜志，2015，35（5）：889-892.

YU Yan，ZHONG Ruijian，DING Jianhong，et al.HPLC simultaneous determination of the content for three main active constituents before and after salt processing of Plantaginis Semen from different habitats[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis，2015，35（5）：889-892.

[7] 鄭秀棉，楊莉，王崢濤，等.車(chē)前子的化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J].中藥材，2013，36（7）：1190-1196.

[8] 何新榮，古今，劉萍.車(chē)前子指紋圖譜研究及其2種指標(biāo)成分的測(cè)定[J].中草藥，2013，44（21）：3053-3056.

HE Xinrong，GU Jin，LIU Ping.Fingerprint of Plantaginis Semen and determination of its two index contents[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs，2013，44（21）：3053-3056.

[9] 王劭華，曾金祥，朱玉野，等.車(chē)前子主成分分析研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，23（1）：48-50.

WANG Shaohua，ZENG Jinxiang，ZHU Yuye， et al.Main ingredients analysis of Plantago seed[J].Journal of Jiangxi University of TCM，2011，23（1）：48-50.

[10]曾金祥，朱繼孝，朱玉野，等.車(chē)前子的高效液相指紋圖譜研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22（2）：329-331.

ZENG Jinxiang，ZHU Jixiao，ZHU Yuye， et al.The high performance liquid chromatography finger print of Plantain seed[J].Lishizhen Medicine and Materia Medica Research，2011，22（2）：329-331.

[11]田雨柔，馬景梅，王鑫國(guó)，等.一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定山茱萸配方顆粒中5種成分[J].中成藥，2017，39（9）：1845-1849.

TIAN Yurou，MA Jingmei，WANG Xinguo，et al.Simultaneous determination of five consistiuents in Shanzhuyu formulated granules by QAMS[J].Chinese Traditional Patent Medicine，2017，39（9）：1845-1849.

[12]農(nóng)新維，梁冰麗，李穎，等.壯藥毛冬青配方顆粒一測(cè)多評(píng)的定量研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2017，34（8）：1118-1121.

NONG Xinwei，LIANG Bingli，LI Ying， et al.Quantitative analysis of Zhuang medicine Ilex Pubescens formula granules by QAMS[J].Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy，2017，34（8）：1118-1121.

[13]劉暉暉，張輝，莫結(jié)麗，等.一測(cè)多評(píng)法測(cè)定黃連配方顆粒中4個(gè)成分的含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2012，21（10）：39-40.

LIU Huihui，ZHANG Hui，MO Jieli， et al.Determination of 4 components in Coptis Chinensis formula granules by QAMS[J].China Pharmaceuticals，2012，21（10）：39-40.

[14]黃群蓮，羅穎，李芹，等.“一測(cè)多評(píng)”含量測(cè)定法對(duì)黃柏配方顆粒與黃柏飲片適用性研究[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2015，35（16）：1470-1474.

HUANG Qunlian，LUO Ying，LI Qin， et al.Study on applicability of QAMS to Phellodendri Chinensis Cortex formula granules and cork pieces[J].Chinese Journal of Hospital Pharmacy，2015，35（16）：1470-1474.

[15]陸兔林，石上梅，蔡寶昌，等.基于一測(cè)多評(píng)的中藥多成分定量研究進(jìn)展[J].中草藥，2012，43（12）：2525-2529.