基于UPLC特征圖譜與主成分分析的白芷配方顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)

孫福仁 李軍山 馬浩 李雪利 冀艷花 李振江

摘 要：為了評(píng)價(jià)不同廠家白芷配方顆粒的產(chǎn)品質(zhì)量，建立了白芷配方顆粒的特征圖譜與主成分分析方法。采用Waters Uplc Class H超高效液相色譜儀與Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（21 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，以乙腈-水為流動(dòng)相，柱溫為25 ℃，流速為0.2 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，利用指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件提取白芷配方顆粒特征圖譜中的特征成分，使用參照物標(biāo)定5個(gè)特征峰的成分;采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行主成分分析，給出了不同廠家白芷配方顆粒在2個(gè)主成分上的分布圖，并對(duì)不同廠家白芷配方顆粒進(jìn)行了綜合評(píng)分。結(jié)果表明：10批白芷配方顆粒特征圖譜確定的13個(gè)特征峰中，指認(rèn)出了花椒毒酚、水合氧化前胡素、歐前胡素、蛇床子素、異歐前胡素5種成分;以回歸得到的3個(gè)主成分的矩陣回歸系數(shù)與方差貢獻(xiàn)值的乘積之和作為10批樣品的綜合評(píng)分，排名第一的綜合評(píng)分為1.77?；赨PLC特征圖譜與主成分分析法能夠快速、有效地檢測(cè)和評(píng)價(jià)白芷配方顆粒。

關(guān)鍵詞：醫(yī)藥工程;白芷配方顆粒;UPLC;特征圖譜;主成分分析

中圖分類號(hào)：R917 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Evaluation of the quality of formula granule of Angelicae

dahuricae based on UPLC and PCA

SUN Furen1， LI Junshan1，2， MA Hao1， LI Xueli1， JI Yanhua1， LI Zhenjiang1

（1.Shineway Pharmaceutical Group Company Limited， Shijiazhuang， Hebei 051430， China;2.TCM Formula Granule Engineering Technology Research Center of Hebei， Shijiazhuang， Hebei 050200， China）

Abstract：In order to evaluate the product quality of Angelica dahurica formula granules from different manufacturers， the feature chromatograms and principal component analysis method of Angelica dahurica formula granules are established. The WATERS UPLC CLASS H and Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） are applied in the method. The mobile phase is acetonitrile-water solution. The column temperature is 25 ℃， the flow rate is 0.2 mL/min and the detection wavelength is 254 nm. The fingerprint similarity evaluation software is used to extract the characteristic components in the characteristic map of Angelica dahurica formula particles， and the components of the five characteristic peaks are calibrated by using a reference. Based on the similarity evaluation of fingerprints and SPSS 19.0， five peaks are identified as the common peaks of 10 batches of samples， PCA are used to analysis 10 batches of samples and 10 batches of samples are ranked in the comprehensive scores. The results show the 13 characteristic peaks identified in the characteristic map of the 10 batches of Angelica dahurica formula granules， five components are identified： Xanthohumol， hydrated oxypeucedanin， imperatorin， osthole and isoimperatorin. The sum of the product of the matrix regression coefficients of the three principal components obtained by regression and the variance contribution value is used as the comprehensive score of the 10 batches of samples， with the first comprehensive score of 1.77. ?The method is simple and reliable， and can be used to control and value the quality of formula granule of Angelicae dahuricae .

Keywords：pharmaceutical engineering; formula granule of Angelicae dahuricae radix; UPLC; feature chromatograms; PCA

白芷為傘形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.的干燥根[1]。白芷中含有水合氧化前胡內(nèi)酯、比克白芷素、異氧化前胡內(nèi)酯、珊瑚菜內(nèi)酯、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、花椒毒酚、豆甾醇、胡蘿卜苷等[2]。白芷為常用中藥，臨床應(yīng)用廣泛。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白芷具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎的功效，其脂溶性部位含有抗炎、鎮(zhèn)痛的有效成分[3-6]。白芷乙醇提取物可顯著延長(zhǎng)小鼠熱板反應(yīng)的潛伏期，以及扭體反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間[7]。

為了控制白芷飲片的質(zhì)量，有學(xué)者應(yīng)用HPLC色譜法，對(duì)不同產(chǎn)地的白芷飲片進(jìn)行了指紋圖譜研究[8-10]。還有文獻(xiàn)報(bào)道了使用HPLC法，對(duì)白芷提取物進(jìn)行了相關(guān)分析[11]。例如：盧曉琳等[12]對(duì)白芷提取物進(jìn)行了性狀、鑒別、檢查研究，應(yīng)用HPLC法建立了白芷提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);何姍姍等[13]通過調(diào)整光照、溫度、pH值、金屬離子等因素，考察了白芷提取物的穩(wěn)定性。然而，目前，以白芷配方顆粒為對(duì)象進(jìn)行質(zhì)量控制方法方面的研究文獻(xiàn)較少。筆者以不同廠家生產(chǎn)的白芷配方顆粒為研究對(duì)象，通過特征圖譜相似度分析并結(jié)合主成分分析方法，對(duì)白芷配方顆粒進(jìn)行了綜合評(píng)分。

1 主要儀器與材料

1.1 儀器

WATERS UPLC CLASS H超高效液相色譜儀，沃特世儀器設(shè)備有限公司提供;Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;CP225D型電子分析天平，賽多利斯公司提供;KH3200E型超聲波清洗器，江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司提供。

1.2 試劑

花椒毒酚對(duì)照品，批號(hào)為110737-201516，中國食品藥品檢定研究院提供;水合氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素、蛇床子素，成都曼思特生物科技有限公司提供;甲醇，分析純，批號(hào)為20170309，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供;乙腈，批號(hào)為20170313，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供。

1.3 配方顆粒

對(duì)從市場(chǎng)采購的10批白芷配方顆粒均按不同廠家、批號(hào)進(jìn)行分類，詳見表1。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）- 水（B），梯度洗脫條件見表2，流速為0.2 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為1 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取花椒毒酚、水合氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素、蛇床子素對(duì)照品適量，精密稱定，置于容量瓶中。加入甲醇制成每l mL含花椒毒酚12，10，15，20，10 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取白芷配方顆粒適量，研細(xì)，取0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，密塞，超聲處理（功率為200 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，搖勻，過濾，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度考察

取編號(hào)S4白芷配方顆粒，根據(jù)供試品溶液制備方法，按照“2.1”色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，13個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0.11%～0.14%，相對(duì)峰面積的RSD值為0.15%～1.06%。表明13個(gè)主要色譜峰的保留時(shí)間與峰面積精密度良好，符合特征圖譜技術(shù)要求。

2.4.2 重復(fù)性考察

取編號(hào)S4白芷配方顆粒，根據(jù)供試品溶液制備方法，平行制備6份供試品，按“2.1”色譜條件測(cè)定，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，13個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0.02%～0.72%，相對(duì)峰面積的RSD值為0.48%～1.45%。表明13個(gè)主要色譜峰的保留時(shí)間與峰面積的重復(fù)性良好，符合特征圖譜技術(shù)要求。

2.4.3 穩(wěn)定性考察

取編號(hào)S5白芷配方顆粒，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，分別于0，2，4，6，8，10 h進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，表明13個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值為0.09%～0.18%，相對(duì)峰面積的RSD值為0.12%～1.91%。表明13個(gè)主要色譜峰穩(wěn)定性良好，符合特征圖譜技術(shù)要求。

3 結(jié)果及分析

3.1 白芷配方顆粒UPLC特征圖譜測(cè)定

取10批白芷配方顆粒，分別按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。

對(duì)10批白芷配方顆粒特征圖譜進(jìn)行分析，確定了13個(gè)特征峰，通過與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間和紫外最大吸收的比對(duì)，指認(rèn)了13個(gè)特征峰中的5個(gè)成分：2號(hào)峰為花椒毒酚，4號(hào)峰為水合氧化前胡素，11號(hào)峰為歐前胡素，12號(hào)峰為蛇床子素，13號(hào)峰為異歐前胡素，詳見圖2。

3.2 數(shù)據(jù)分析

采用《中藥色譜指紋圖譜和相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版），選取時(shí)間窗寬度為0.1 min，以中位數(shù)生成對(duì)照色譜圖，經(jīng)過多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配，生成白芷配方顆粒UPLC特征圖譜的對(duì)照譜圖[14-15]。

通過與白芷配方顆粒對(duì)照譜圖比較可知，歐前胡素、異歐前胡素、蛇床子素3個(gè)特征峰只在2

個(gè)廠家生產(chǎn)的白芷配方顆粒中檢測(cè)到，而在其他廠家生產(chǎn)的白芷配方顆粒中均未檢測(cè)到上述3種成分。

由于對(duì)照?qǐng)D譜中13個(gè)特征峰的分離度較好，故選用13個(gè)特征峰的峰面積作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS 19.0版軟件，以10批白芷配方顆粒為分析對(duì)象，進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，提取到3個(gè)成分時(shí)方差累積已達(dá)到93.58%，可以代表整個(gè)樣品的信息，故提取到3個(gè)主成分。使用回歸得到的3個(gè)主成分的矩陣回歸系數(shù)與方差貢獻(xiàn)值的乘積之和作為10批樣品的綜合評(píng)分，進(jìn)行排序，結(jié)果見表4和圖3。

由表4可知，編號(hào)S4和S5白芷配方顆粒的綜合評(píng)分靠前，而其他廠家樣品的綜合評(píng)分靠后。由圖3可知，樣品S4和S5在主成分1、主成分2上的分布與其他樣品的距離較遠(yuǎn)，且其余樣品的分布較為集中，都處于主成分1和主成分2的負(fù)數(shù)區(qū)，表明不同廠家生產(chǎn)的白芷配方顆粒的差異較大。

4 討 論

4.1 提取溶劑及提取方式的考察

對(duì)10%，30%，50%甲醇水溶液與100%甲醇進(jìn)行比較可知，以甲醇提取的樣品中的色譜峰個(gè)數(shù)較多，峰型較好，故選擇甲醇作為提取溶劑。對(duì)比了超聲與回流2種提取方式，超聲提取樣品中峰的個(gè)數(shù)多、峰面積較大，回流提取的峰面積較小，因此選用超聲提取。通過對(duì)25，50，70 mL提取溶劑用量進(jìn)行考察，最終確定了25 mL作為提取溶劑的用量。

4.2 色譜條件的考察

分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.5%磷酸水3個(gè)流動(dòng)相體系。結(jié)果表明，采用乙腈-水溶液作為流動(dòng)相體系時(shí)，特征圖譜中的主要色譜峰的分離較好，基線波動(dòng)小，有利于特征圖譜的數(shù)據(jù)采集，有效確保數(shù)據(jù)的可重現(xiàn)性。因此，確定乙腈-水溶液作為流動(dòng)相。

4.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的篩選

分別選用254，275，300 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在不同波長(zhǎng)下各色譜峰的峰面積有較大差異。綜合考慮發(fā)現(xiàn)，在254 nm下測(cè)定，各色譜峰的分離度較好，基線平穩(wěn)，故選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

5 結(jié) 語

1）《中華人民共和國藥典》2015版中規(guī)定，在對(duì)白芷飲片含量測(cè)定時(shí)以歐前胡素為指標(biāo)，說明歐前胡素是白芷飲片質(zhì)量控制的關(guān)鍵。白芷配方顆粒是由白芷飲片經(jīng)提取、濃縮、干燥、制粒而得的。采用建立的UPLC特征圖譜方法，對(duì)不同廠家白芷配方顆粒測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，只有2家的產(chǎn)品中檢測(cè)到了歐前胡素、異歐前胡素、蛇床子素成分，其余廠家樣品中均未檢測(cè)到。

2）由于歐前胡素、異歐前胡素、蛇床子素的水溶性差，在生產(chǎn)過程中若僅用水作為提取溶媒，產(chǎn)品中所含的微量歐前胡素、異歐前胡素、蛇床子素等香豆素類成分難以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求。所以，生產(chǎn)白芷配方顆粒時(shí)，應(yīng)該兼顧藥材中各種化學(xué)成分的特性，確定合理的提取工藝，最大限度地保留中藥飲片中的指標(biāo)成分，確保療效。

3）本次研究采用特征圖譜技術(shù)結(jié)合主成分分析，對(duì)10批不同廠家的白芷配方顆粒進(jìn)行了分析和評(píng)價(jià)。由于各廠家配方顆粒生產(chǎn)工藝條件的差異，導(dǎo)致白芷配方顆粒中化學(xué)成分產(chǎn)生較大變化，今后需要對(duì)此作進(jìn)一步的研究。

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