AgNO₃對顛茄毛狀根生物堿及關(guān)鍵酶基因表達的影響

劉佳 吳能表

摘 要：為了研究不同濃度AgNO3對顛茄毛狀根生長過程中托品烷類生物堿及影響其合成關(guān)鍵酶基因表達的影響，該研究使用五種不同濃度的AgNO3處理黑暗培養(yǎng)12 d的顛茄毛狀根，2 d后收集毛狀根并測定其鮮、干質(zhì)量、托品烷類生物堿的含量、部分生理指標（MDA、Pro、可溶性糖、可溶性蛋白）、關(guān)鍵酶基因（pmt、trI、h6h）表達量。結(jié)果表明：AgNO3雖然抑制了顛茄毛狀根的生長，但卻促進了托品烷類生物堿的積累，與對照相比，50、100、150 μmol·L1處理均顯著性地提高了托品烷類生物堿的產(chǎn)量。同時在150 μmol·L1處理下，毛狀根代謝途徑中MDA與對照相比均具有顯著性的提高，脯氨酸含量在150 μmol·L1下也有了顯著性提高，達到了5.92 μg·g1FM，是對照的2.91倍?？扇苄蕴桥c可溶性蛋白含量在150 μmol·L1濃度下處理時其含量分別是對照的1.55倍和1.67倍。托品烷類生物堿合成過程中關(guān)鍵酶基因（pmt、trI、h6h）的表達量在不同濃度AgNO3處理下均有不同程度的提高。由此可以推斷，AgNO3在150 μmol·L1處理下，可能通過調(diào)控脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖這幾種初級代謝產(chǎn)物或某幾種關(guān)鍵酶基因的表達來影響顛茄毛狀根托品烷類的合成。

關(guān)鍵詞：顛茄，硝酸銀，托品烷類生物堿，毛狀根，基因表達量

中圖分類號：Q943

文獻標識碼：A

文章編號：10003142（2018）06078107

Abstract：In this study，we studied the influences of different concentrations of AgNO3 on tropane alkaloids and key enzyme genes in metabolic pathway. We all know that the accumulation of plant secondary metabolites is directly related to some tprimary metabolism and activity of key enzymes. And AgNO3 is a heavy metal，which can induce oxidative stress in plants and which has a great effect on plant growth and key enzymes of metabolism. Therefore，we added five concentrations of AgNO3 into Atropa belladonna hairy roots，and cultivated in B5 liquid medium for 12 d，and then，we collected hairy roots and determined fresh weight，dry weight，contents of tropane alkaloids，some physiological indexes included MDA，Pro，soluble sugar and soluble protein，genes expression level after cultivated for 2 d. The results showed that AgNO3 promoted the accumulation of the alkaloids，although AgNO3 inhibited the growth of hairy roots，50，100，150 μmol·L1 AgNO3 could improve the contents of tropane alkaloids compared with control. Meanwhile，150 μmol·L1 treatment group significantly improved the hairy roots of the content of MDA compared with control. As well as the content of Pro increased to 5.92 μg·g1FM，2.91 times of control. Then，the contents of soluble sugar and souble protein were significantly improved 1.55 and 1.67 times of control respectively by treating with 150 μmol·L1 AgNO3 treatment. Thus，with the treatment of AgNO3，gene expressions （pmt，trI，h6h） of key enzymes in the metabolic pathway of A. belladonna hairy roots all increased their produced effects. Therefore，we could be inferred that the contents of tropine alkaloids in A. belladonna hairy roots could regulate and control primary metabolism such as Pro，soluble protein，soluble sugar and secondary metabolism like expressions of key enzyme genes with the treating of AgNO3. This study could provide the basic theories for study the synthesis mechanism of tropane alkaloids and an effective method to enhance the medicinal composition in the culture of hairy roots of Atropa belladonna in the future.

Key words：Atropa belladonna，AgNO3，tropane alkaloids，hairy roots，expression of gene

顛茄（Atropa belladonna），俗名野山茄、顛茄草，茄科顛茄屬多年生草本植物（中國藥典，2015）。顛茄是一種常見且常用的藥用植物，全草可入藥，葉和根含莨菪堿與東莨菪堿，臨床上可制成配劑和浸膏用于麻醉、鎮(zhèn)痛、抗暈動癥等（肖培根，2002）。已有研究表明，藥用植物中含有多種有效的活性物質(zhì)，對人類的健康和發(fā)展都有著重要的作用（Verpoorte & Memelink，2002）。然而，隨著市場需求的不斷變化，加之長期不當?shù)牟煞ゼ吧鷳B(tài)環(huán)境的破壞，使藥用植物中的活性物質(zhì)含量越來越低，成為藥用植物進軍國際市場的一大瓶頸（Namdeo，2007）。

近年來，毛狀根培養(yǎng)技術(shù)已在植物次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)、品種改良和特種植物栽培等領(lǐng)域有了廣泛且有效的應(yīng)用（Georgiev et al，2007）。在植物生長期間添加誘導(dǎo)子也是提高多種植物次生代謝產(chǎn)物含量的有效途徑。誘導(dǎo)子能夠引起植物體內(nèi)特殊的次生代謝產(chǎn)物的合成，所以誘導(dǎo)子成為一種提高毛狀根生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的有效方法（Savitha et al，2006）。AgNO3是一種重金屬，可誘導(dǎo)植物體內(nèi)的氧化脅迫，從而對植物的生長及代謝產(chǎn)生較大的影響（Vasconsuelo & Boland，2007）。一般來說，植物次生代謝產(chǎn)物的積累都會與代謝過程中關(guān)鍵酶的活性有直接或間接的關(guān)系。如黃蕾等（2013）的研究發(fā)現(xiàn)，硝酸鉛可促進花楸懸浮細胞的生長并刺激次生代謝產(chǎn)物的積累。目前對顛茄的研究主要集中在代謝途徑中關(guān)鍵酶基因克隆的研究（強瑋，2012）；通過調(diào)控次生代謝產(chǎn)物中關(guān)鍵酶基因的過量表達來提高顛茄托品烷類生物堿含量（李金娣等，2013）。這種方法成本較高不利于大規(guī)模生產(chǎn)，同時基因的過表達可能會存在嵌合體，導(dǎo)致遺傳的不穩(wěn)定。但目前尚未見通過添加誘導(dǎo)子來研究其對顛茄毛狀根生物堿含量以及代謝過程中關(guān)鍵酶基因影響的相關(guān)報道。本研究以顛茄毛狀根為材料，通過添加AgNO3探究誘導(dǎo)子對顛茄毛狀根的生長及代謝過程中關(guān)鍵酶基因表達的影響，旨在為提高顛茄藥用成分有效研究提供參考，為顛茄毛狀根的進一步擴大培養(yǎng)提供了依據(jù)，同時對顛茄托品烷類生物堿的合成調(diào)控機理的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

西南大學(xué)三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室保存在B5培養(yǎng)基上的顛茄毛狀根。

1.2 方法

1.2.1 AgNO3的制備 將AgNO3用蒸餾水溶解定容，配制成100 μmol·L1的母液，過0.22 μm濾膜除菌備用。

1.2.2 誘導(dǎo)子的添加及培養(yǎng) 將0.5 g新鮮顛茄毛狀根接于150 mL 含有B5液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，110 r·min1、恒溫、（25±1） ℃避光培養(yǎng)12 d，將原有培養(yǎng)基倒掉，換成添加不同濃度AgNO3的新鮮液體培養(yǎng)基，使AgNO3終濃度均分別為25、50、100、150、200 μmol·L1。相同條件下培養(yǎng)2 d。

1.2.3 毛狀根鮮、干質(zhì)量的測定方法 收集處理后的毛狀根，用蒸餾水沖洗毛狀根上殘留的液體培養(yǎng)基，濾紙吸干水分后稱重，即為毛狀根的鮮質(zhì)量。將新鮮的毛狀根于60 ℃烘箱中烘干至恒重后稱重，即為毛狀根的干質(zhì)量。

1.2.4 顛茄毛狀根中托品烷類生物堿的提取 參照Zrate et al（1997）的提取方法，略有改動：將毛狀根于烘箱中60 ℃烘干至恒重，充分研磨，過50目篩；稱取0.100 0 g加10 mL提取液（CHCl3-MeOH-NH4OH（15∶5∶1）），超聲提取30 min，室溫放置過夜。提取液抽濾，2 mL CHCl3沖洗殘渣，合并所有濾液；40 ℃真空濃縮至干，殘留物用5 mL CHCl3和2 mL 1 mol·L1 H2SO4溶解，靜置分層，收集硫酸相，濃氨水調(diào)pH至10，再分別加入4 mL CHCl3提取兩次，靜置；分層后取下層于40 ℃真空濃縮，殘留物用1 mL甲醇溶解，即為樣品液。0.22 μm濾膜過濾，-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 色譜條件 色譜柱為Ultimate XBC18色譜柱（5 μm，4.6 mm × 250 mm）；流動相為甲醇∶醋酸銨（pH4.6）=58∶42；流速為1.0 mL·min1；檢測波長為215 nm；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μL。

1.2.6 部分生理指標測定 脯氨酸、可溶性蛋白含量的測定參照高俊鳳（2006）的方法；MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法（趙世杰等，1991）；可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法（李合生，2000）。

1.2.7 關(guān)鍵酶基因表達量的測定 使用Biospin Plant Total RNA Extraction Kit 試劑盒提取總RNA，Promega GoScript試劑盒反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以cDNA為模板，pgk為內(nèi)參基因，使用Promega GoTaq qPCR Master Mix試劑盒進行熒光定量PCR。反應(yīng)結(jié)束后，分析溶解曲線、擴增曲線和標準曲線，最終得到各基因的表達量。PCR所用的引物見表1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計整理和方差分析，Origin 8繪圖。數(shù)據(jù)均以x ± s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 AgNO3對顛茄毛狀根的生長及托品烷類生物堿的影響

從表2可以看出，AgNO3抑制了顛茄毛狀根的生長，毛狀根的鮮質(zhì)量隨試驗濃度的增加逐漸降低，濃度大于100 μmol·L1時抑制作用與對照相比均有了顯著性提高；而干質(zhì)量在各處理組均表現(xiàn)出顯著性地抑制，最高濃度時抑制效果最明顯，僅為對照的73.64%。雖然AgNO3對顛茄毛狀根的生長產(chǎn)生了抑制作用，但其托品烷類生物堿的含量卻提高了，東莨菪堿的含量在50、100、150 μmol· L1時與對照相比有了顯著性的增加，100 μmol· L1時含量達到了對照的2.5倍，莨菪堿的含量被AgNO3處理后均有顯著性地提高；最終50、100、150 μmol·L1處理組與對照相比依然提高了托品烷類生物堿的產(chǎn)量，且均具有顯著性。

2.2 AgNO3對顛茄毛狀根生長過程中部分生理指標的影響

從圖1可以看出，除25 μmol·L1處理外，其余四組處理均顯著地增加了MDA的含量，150 μmol·L1處理效果最為明顯，是對照的1.24倍；其次毛狀根中脯氨酸的含量也因為AgNO3的添加全都有了顯著性地提高，150 μmol·L1處理達到5.92 μg·g1FM，是對照的2.91倍，且與25、50、200 μmol·L1處理具有顯著性差異；各處理組可溶性糖與可溶性蛋白的含量與對照相比也都有了顯著性提高，其中可溶性糖含量在150與200 μmol·L1處理時其含量分別是對照的1.55、1.52倍，且與25、50 μmol·L1處理具有顯著性差異?？扇苄缘鞍缀吭?0、150 μmol·L1兩組處理中含量的提高均比較明顯，分別達到了10.228、9.949 mg·g1FM，較對照分別增加了20.08%、16.78%，同時這兩組處理與25、50 μmol·L1處理具有顯著性差異。

2.3 誘導(dǎo)子對毛狀根托品烷類生物堿關(guān)鍵基因表達量的影響

從圖2可以看出，五種濃度AgNO3均能顯著刺激pmt基因的表達，50、100 μmol· L1處理組分別為對照的3.45倍和3.32倍，且與25、200 μmol· L1誘導(dǎo)處理組均存在顯著性差異；其次，除200 μmol· L1處理組外的四種濃度處理均可顯著地刺激trI基因的表達，50、100 μmol·L1處理與其他三組存在顯著性差異；最后，在h6h基因的表達中，200 μmol·L1處理組與對照相比沒有顯著性地提高表達，而其他四組可以顯著性地提高h6h基因的表達，100 μmol·L1處理組對該基因的誘導(dǎo)效果最強烈，較對照基因表達量提高了1.16倍。

3 討論與結(jié)論

AgNO3作為一種非生物誘導(dǎo)子，可誘導(dǎo)植物體內(nèi)的氧化及脅迫，從而對植物的生長及代謝產(chǎn)物產(chǎn)生影響（Vasconsuelo & Boland，2007），因此，近幾年越來越多的被用于植物次生代謝產(chǎn)物含量的提高。本研究發(fā)現(xiàn)：不同濃度的AgNO3均抑制了顛茄毛狀根的生長，這可能是因為AgNO3對植物的營養(yǎng)吸收、呼吸作用、光合作用等生物學(xué)進程產(chǎn)生了干擾（Clemens，2006）。雖然顛茄毛狀根的生長受到了抑制，但東莨菪堿的含量在50、100、150 μmol· L1時有了顯著性的增加。這一方面可能是因為顛茄毛狀根在受到AgNO3的脅迫后，產(chǎn)生可溶性糖、可溶性蛋白等來預(yù)防這種脅迫，這些初級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生會使多余的初級代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成次級代謝產(chǎn)物，另一方面也有可能是因為AgNO3誘導(dǎo)顛茄托品烷類生物堿代謝過程中關(guān)鍵酶基因的表達，如Xiao & Gao（2010）用Ag+處理丹參毛狀根后，在第6天的mRNA水平上檢測到了PAL轉(zhuǎn)錄達到最高峰。

誘導(dǎo)子對植物作用的過程中，會改變植物細胞的結(jié)構(gòu)從而使細胞膜發(fā)生氧化，同時植物會產(chǎn)生小分子物質(zhì)來增強自身的滲透調(diào)節(jié)能力。MDA是植物細胞膜氧化的產(chǎn)物，MDA的含量可以作為植物受誘導(dǎo)子脅迫后細胞結(jié)構(gòu)受到影響的重要指標。脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等是植物體內(nèi)有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)，其累計可明顯地提高植物細胞的滲透調(diào)節(jié)能力，使細胞在脅迫下保持正常的功能。孫際薇（2014）研究發(fā)現(xiàn)，200 μmol·L1的MJ處理曼陀羅的毛狀根后，導(dǎo)致毛狀根中Pro的含量顯著地高于對照組。本研究同樣也發(fā)現(xiàn)，AgNO3的添加導(dǎo)致毛狀根中MDA、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量的提高?？扇苄蕴桥c可溶性蛋白的滲透能力可以防治植物細胞過度脫水，保持植物細胞水分的平衡，減少誘導(dǎo)子對植物生長造成的影響（張紅敏，2014）。另外，可溶性蛋白含量的增加，可能是誘導(dǎo)子的添加導(dǎo)致防御蛋白的合成，防御系統(tǒng)啟動時會有大量的蛋白質(zhì)合成。這些因素都提高了顛茄毛狀根細胞的調(diào)節(jié)能力，從而對次級代謝產(chǎn)物的積累起到良好的作用。

誘導(dǎo)子可作為信號子被植物細胞膜上的受體識別并與其結(jié)合，結(jié)合后可以引起細胞膜及細胞內(nèi)發(fā)生一系列的級聯(lián)反應(yīng)，合成與植物次生代謝合成相關(guān)的酶或使其酶的活性發(fā)生變化，從而使植物基因表達發(fā)生變化，導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物的合成與積累。而且誘導(dǎo)子在與植物相互作用時能選擇性、快速、高度專一的誘導(dǎo)植物特定基因的表達，從而積累特定的次生代謝產(chǎn)物（翟俏麗，2011）。Peter & Sang（2003）在罌粟懸浮細胞培養(yǎng)的過程中添加真菌誘導(dǎo)子后，誘導(dǎo)子可顯著地誘導(dǎo)了八種生物堿合成基因中的七個基因的轉(zhuǎn)錄。在本研究中，25～150 μmol·L1濃度的AgNO3處理均能顯著性地刺激顛茄托品烷類生物堿合成關(guān)鍵基因pmt、trI、h6h的表達。表明這幾個基因表達量的提高均能有效提高顛茄毛狀根中托品烷類生物堿含量的積累。

本研究發(fā)現(xiàn)，添加AgNO3后，顛茄毛狀根的生長受到了抑制，但其托品烷類生物堿的產(chǎn)量在50、100、150 μmol·L1處理時顯著性地提高了。本研究還發(fā)現(xiàn)，在這三種濃度處理下，顛茄毛狀根生的MDA、脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖的含量與對照相比也有顯著性地提高，同時顛茄托品烷類生物堿代謝過程中關(guān)鍵酶基因的表達量也有顯著性地提高。由此可以推測，AgNO3脅迫后，顛茄毛狀根通過脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等生理指標影響初級代謝，從而影響托品烷類生物堿生物堿的積累；同時從關(guān)鍵酶基因的表達影響次級代謝，從而促進了托品烷類生物堿的積累。但生理指標的改變是否會影響關(guān)鍵酶的表達，這個問題還有待于進一步研究。

參考文獻：

CLEMENS S，2006. Toxic metal accumulation responses to exposure and mechanisms of tolerancein plants [J]. Biochimine，88（9）：1707-1718.

GAO JF，2006. Guidance on plant physiology test [M]. Beijing：Higher Education Press：208-230. [高俊鳳，2006. 植物生理學(xué)試驗指導(dǎo) [M]. 北京：高等教育出版社：208-230.]

GEORIEV MI，PAVLOV AI，BLEY T，2007. Hairy root type plant in vitro systems as sources of bioactive substances [J]. Appl Biochem Biotechnol ，74（6）：1175-1185.

HUANG L，XIAO WJ，LIU C，et al，2013. Effect of three heavy metals on cell suspension cultures of Sorbus aucuparia biomas [J]. Chin J Exp Trad Med Form，19（24）：226-229. [黃蕾，肖文娟，劉超，等，2013. 3種重金屬對歐洲花楸懸浮細胞生物量的影 [J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，19（24）：226-229.]

LI HS，2000. Principle and technology of plant physiological and biochemical test [M]. Beijing：Higher Education Press：195. [李合生，2000. 植物生理生化試驗原理與技術(shù) [M]. 北京：高等教育出版社：195.]

LI JD，QING BF，YANG CHX，et al，2013. Enhanced biosynthesis of scopolamine in transgenic Atropa belladonna by overexpression of h6h gene [J]. Chin J Chin Mat Med，38（11）：1719-1723. [李金娣，秦白富，楊春賢，等，2013. 過表達莨菪h6h基因提高顛茄東莨菪堿含量的研究 [J]. 中國中藥雜志，38（11）：1719-1723.]

LI SW，XUE LG，et al，2009. Hydrogen peroxide acts as a signal molecule in the adventitious root formation of mung bean seedlings [J]. Eev Exp Bot ，65（1）：63-71.

MAMDEO AG，2007. Plant cell elicitation for production of secondary metabolites [J]. Phcog Rev，1：69-79.

PETER JF，SANG P，2003. Developmental and inducible accumulation of gene transcripts involved in alkaloid biosynthesis in Opium poppy [J]. Phlytochemistry，64：177-186.

QIANG W，2012. Cloning and characterization of tropinone reductase I from Atropa belladonna and its overexpression for enhancing the tropane alkaloids production in Atropa belladonna [D]. Chongqing：Southwest University. [強瑋，2012. 顛茄基因的克隆、功能驗證及超量表達對顛茄托品烷生物堿合成的影響 [D]. 重慶：西南大學(xué).]

SAVITHA BC，THIMMARAJU R，BHAGYALAKSHMI N，2006. Different biotic and abiotic elicitors influence betalain production in hairy root cultures of Beta vulgaris in shakeflask and bioreactor [J]. Process Biochem，41（1）：50-60.

SUN JW，2014. Effects of methyl jasmonate on the Datura stramonium L. hairy root growth and secondary metabolites [D]. Chongqing：Southwest University. [孫際薇，2014. 茉莉酸甲酯對曼陀羅毛狀根的生長及次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的影響 [D]. 重慶：西南大學(xué).]

VASCONSUELO A，BOLAND R，2007. Molecular aspects of the early stages of secondary metabolites in plants [J]. Plant Sci，172（5）：861-880.

VERPOORTE R，MEMELINK J，2002. Engineering secondary metabolite production in plants [J]. Curr Opin Biotechnol，13：181-187.

XIAO PG，2002. Modern Chinese materia medica [M]. Beijing：Chemical Industry Publishing：402. [肖培根，2002. 新編中藥志 [M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社：402.]

XIAO Y，GAO S，DI P，et al，2010. Lithospermic acid B is more responsive to silvefions（As） than rosmarinic acid m Salvia mihiorrhiza hairy root cultures [J]. Bioscience Reports，30：33-40.

ZRATE R，HERMOSIN B，CANTOS M，et al，1997. Tropane Alkaloid Distribution in Atropa baetica plants [J].J Chem Ecol，23（8）：2059-2066.

ZHAI QL，2011. Preliminary study on mechanism of triterpenoids accumulation included by fungal elictor in birch （Betula platyphylla Suk） suspension culture [D]. Harbin：Northeast Forestry University. [翟俏麗，2011. 真菌誘導(dǎo)促進白樺懸浮細胞中三萜合成機理的初步研究 [D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué).]

ZHANG HM，2014. Studies of exogenous betaine on the adversity physiological characteristic and nitrogen metabolism of Pinellisa ternate under drought stress [D]. Chongqing：Southwest University. [張紅敏，2014. 外源甜菜堿對干旱脅迫下半夏逆境生理特性及氮代謝的影響 [D]. 重慶：西南大學(xué).]

ZHAO SJ，XU CHC，ZHOU Q，et al，1991.Imprvements of method for measurement of malondial dehvdein plant tissues [J]. Plant Physiol Comm，30 （3）：207-210. [趙世杰，許長成，鄒琦，等，1991. 植物組織中丙二醛測定方法的改進 [J]. 植物生理學(xué)通訊，30 （3）：207-210.]

National Pharmacopoeia Committee，2015. Pharmacopoeia of Peoples Republic of China （Part 2） [S]. Beijing：Chemical Industry Press：420. [國家藥典委員會，2015. 中國藥典（第二部） [S]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社：420.]