表皮葡萄球菌臨床菌株icaA、icaR基因與生物被膜形成關(guān)系的研究

朱娟　陳麗華　佘鵬飛　譚芮辰　王妍樂(lè)　伍勇

〔摘要〕 目的 研究表皮葡萄球菌icaA和icaR基因與生物被膜形成的相關(guān)性。方法 收集湘雅三醫(yī)院機(jī)械通氣患者分離表皮葡萄球菌26株，按生物被膜成膜能力分成生物被膜陽(yáng)性菌組和生物被膜陰性菌組各13株。采用RT-PCR分別對(duì)2組細(xì)菌icaA和icaR基因灰度比進(jìn)行檢測(cè)；采用real-time PCR分別檢測(cè)2組細(xì)菌icaA和icaR基因的表達(dá)，并通過(guò)2-△△Ct方法進(jìn)行相對(duì)定量。結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示icaA基因在生物被膜陽(yáng)性組中的灰度比為0.96～1.38，在生物被膜陰性組中為0.89～1.56，表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T=10.65，P=0.057）；同理，icaR基因在生物被膜陽(yáng)性組中的灰度比為0.79～1.24，在生物被膜陰性組中則為0.80～1.36，表達(dá)差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T=14.62，P=0.479）。但icaA基因在生物被膜陽(yáng)性組中的平均秩（16.35）明顯高于生物被膜陰性菌組（10.65），而icaR基因生物被膜陽(yáng)性組的平均秩（12.38）明顯小于生物被膜陰性菌組（14.62）。real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌生物被膜陽(yáng)性組icaA基因的表達(dá)量（△CT=4.86）是生物被膜陰性組（△CT=13.57）的418.8倍（t=61.890，P<0.01），而icaR基因的表達(dá)量（△CT=19.03）僅為生物被膜陰性組（△CT=11.85）的1/145（t=21.330，P<0.01）。結(jié)論 icaA基因與表皮葡萄球菌生物被膜的形成呈正相關(guān)，而icaR基因與表皮葡萄球菌生物被膜的形成呈負(fù)相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 表皮葡萄球菌；icaA；icaR；生物被膜

〔中圖分類號(hào)〕R393；R378.1 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.06.003

〔Abstract〕 Objective To study the correlations between icaA and icaR genes with biofilm formation of Staphylococcus epidermidis （S. epidermidis）. Methods 26 strains of S. epidermidis isolated from tracheal catheter of patients with mechanical ventilation in ICU of the Third Xiangya Hospital were collected and divided into biofilm positive group （13 strains） and biofilm negative group （13 strains） according to biofilm formation ability. The gray scale ratios of icaA and icaR genes in two groups were determined by reverse transcription PCR. The expressions of icaA and icaR genes in two groups were detected by real time PCR， the relative quantification was measured by using 2-ΔΔCt method. Results The RT-PCR showed that the gray scale ratios of icaA in positive group and negative group of biofilm-forming were 0.96～1.38 and 0.89～1.56， respectively， the difference was not statistically significant （T=10.65， P=0.057）. The gray scale ratios of icaR genes in positive group and negative group of biofilm-forming were 0.79～1.24 and 0.80～1.36， respectively， the expression between the two groups were not statistically significant （T=14.62， P=0.479）. The mean rank and sum of ranks of icaA gene in biofilm positive bacteria group （16.35） were significantly higher than those in biofilm negative group （10.65）， but the mean rank and sum of ranks of icaR gene in biofilm positive bacteria group （12.38） were significantly lower than those in biofilm negative bacteria group （14.62）. Real-time PCR showed that the expression of icaA gene in S. epidermidis in biofilm positive group （△CT=4.86） was 418.8 times of that in biofilm negative bacteria group （△CT=13.57） （t=61.890， P<0.01）， while the expression of icaR gene in biofilm positive group （△CT=19.03） was only 1/145 of that in negative group （△CT=11.85） （t=21.330， P<0.01）. Conclusion icaA gene is positively related to the formation of biofilm in S. epidermidis， while icaR gene is negatively related to the formation of biofilm in S. epidermidis.

〔Keywords〕 Staphylococcus epidermidis； icaA； icaR； biofilm

表皮葡萄球菌（staphylococcus epidermidis）是人體皮膚和黏膜正常菌群之一。近年來(lái)，隨著各種體內(nèi)置入設(shè)施，如氣管插管、中心靜脈置管和人工心臟瓣膜等的廣泛使用，表皮葡萄球菌已成為醫(yī)院內(nèi)感染重要病原菌[1]。且隨著抗生素的不合理使用，表皮葡萄球菌的耐藥率有所增加[2]。此外，表皮葡萄球菌容易形成生物被膜，進(jìn)而增強(qiáng)菌株耐藥性并能使其逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，造成慢性、持續(xù)性和反復(fù)性感染特點(diǎn)[3]。研究發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌生物被膜胞外基質(zhì)的主要成分是胞間多糖粘附素（polysaccharide intercellular adhesion， PIA）[4]。PIA是ica操縱子編碼產(chǎn)物，ica操縱子全長(zhǎng)3.4 kb，包括icaR（調(diào)節(jié)基因）及串聯(lián)存在的icaA、icaD、icaB和icaC基因[5]。icaR基因位于ica操縱子的上游，編碼合成的icaR可與icaA基因的起始密碼子相結(jié)合調(diào)控ica操縱子的表達(dá)[6]。本文通過(guò)分析表皮葡萄球菌臨床菌株icaA、icaR基因與生物被膜形成的關(guān)系，進(jìn)一步了解表皮葡萄菌生物被膜形成的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

收集湘雅三醫(yī)院ICU病房機(jī)械通氣患者氣管內(nèi)導(dǎo)管和痰液標(biāo)本中分離出的表皮葡萄球菌單個(gè)菌落，于血瓊脂平板上純培養(yǎng)后篩選出的生物被膜陽(yáng)性和生物被膜陰性表皮葡萄球菌各13株。菌株經(jīng)Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定。生物被膜鑒定參照Freeman等的方法[7]進(jìn)行，將收集的吸痰標(biāo)本和裝有氣管導(dǎo)管的生理鹽水旋渦振蕩后，分別接種于剛果紅平板（LB瓊脂培養(yǎng)基中加入剛果紅，濃度為0.8 g/L）， 37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果，菌落變?yōu)楹谏珵樯锉荒り?yáng)性菌株，菌落紅色為生物被膜陰性菌株，表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC RP62A和ATCC12228分別為成膜能力陽(yáng)性和陰性質(zhì)控菌株。

1.2 主要試劑及儀器

UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（上海生工公司）；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司）；2×Tap PCR Master Mix、 Marker I DNA Ladder、Trans Start Green qPCR SuperMix UDG和Passive Reference DyeI/PCR Enhancer（北京全式金生物公司）；9700 GeneAmp PCR System（美國(guó)PE公司）；Gene Genius全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Syngene公司）；引物由上海生工公司合成。

1.3 細(xì)菌總RNA的提取

取0.5麥?zhǔn)蠁挝恍迈r菌懸液2 μL至3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)16 h?？俁NA的提取參照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。即在上述菌液中加入l μL 70%乙醇和100 μL溶菌酶，37 ℃ 45 min，再加入1 mL Trizol充分吹打混勻，置冰上15 min。加入氯仿萃取，收集上層水相至干凈的EP管中，加入1/2倍體積無(wú)水乙醇沉淀，再經(jīng)RPE溶液離心洗滌后，在吸附柱中央加入30 μL DEPC水收集RNA，并置-70 ℃保存[8]。

1.4 cDNA的合成及RT-PCR

根據(jù)Fermentas公司試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行cDNA合成。cDNA合成反應(yīng)體系為20 μL： Anchored Oligo（dT）18（0.5 μg/μL） 1 μL，2×ES Reaction Mix 10 μL，Easy Script RT/RI Enzyme Mix 1 μL，RNase-free Water 7 μL，RNA模板1 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 30 min。RT-PCR反應(yīng)體系為（共20 μL）：16S rRNA上、下游引物（20 μmol/L）各0.4 μL，模版1.6 μL， Taq Mixture 8 μL， ddH2O 9.6 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 40 s， 55 ℃40 s， 72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min[9]。逆轉(zhuǎn)錄icaA、icaR和16S rDNA的特異性引物序列通過(guò)軟件Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)，如表1。

其中，16S-rRNA為內(nèi)參基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳并成像，并用灰度比來(lái)進(jìn)行對(duì)比分析，即：各目的基因灰度與16S-rRNA灰度的比值，由image J軟件進(jìn)行計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 icaA和icaR基因表達(dá)量檢測(cè)

real-time PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Trans Start Green qPCR SuperMix UDG 12.5 μL，Passive Reference Dye/PCR Enhancer 0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，MgCl2 0.5 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s， 55 ℃ 15 s， 72 ℃ 10 s，45個(gè)循環(huán)。最后，設(shè)置溶解曲線程序：95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[10]。采用2-△△Ct方法進(jìn)行icaA和icaR基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。其中，△△Ct=實(shí)驗(yàn)組（目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct）-對(duì)照組（目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct）[11]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

偏態(tài)分布資料采用秩和檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)量為平均秩T。正態(tài)分布資料組間采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)icaA和icaR基因的表達(dá)差異

icaA基因在生物被膜陽(yáng)性組中的灰度比為1.17±0.28，在生物被膜陰性組中則為1.23±0.19，表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T=10.65，P=0.057）；同理，icaR基因在生物被膜陽(yáng)性組中的灰度比為（1.02±0.16），在生物被膜陰性組中則為（1.08±0.20），表達(dá)差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（T=14.62，P=0.479）。但icaA基因生物被膜陽(yáng)性菌組平均秩（16.35）及秩和（212.5）明顯高于陰性菌組平均秩（10.65）及秩和（138.5）；而icaR基因生物被膜陽(yáng)性菌組平均秩（12.38）及秩和（161.0）明顯低于陰性菌組平均秩（14.62）及秩和（190.0），見圖1。

2.2 real-time PCR結(jié)果

icaA和icaR與16S rDNA基因的熔解曲線的熔點(diǎn)峰窄且尖，表明PCR產(chǎn)物較純，沒(méi)有非特異性產(chǎn)物和引物二聚體，各目的基因引物特異性好，見圖2。生物被膜陽(yáng)性表皮葡萄球菌icaA基因轉(zhuǎn)錄水平（△CT=4.86）顯著超過(guò)了生物被膜陰性組（△CT=13.57），是陰性菌組的（418.8±21.34）倍（t=61.890，P<0.01），而icaR基因在表皮葡萄球菌生物被膜陰性菌組（△CT=11.85）中的轉(zhuǎn)錄水平是陽(yáng)性菌組（△CT=19.03）的（145.0±10.21）倍（t=21.330，P<0.01）。

3 討論

結(jié)果顯示，icaA基因在生物被膜陽(yáng)性菌組中轉(zhuǎn)錄水平顯著高于陰性菌組，是陰性菌組的418.8倍；而icaR在生物被膜陽(yáng)性菌組中表達(dá)量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于陰性菌組，僅為陰性菌組的1/145。表明表皮葡萄球菌icaA基因與其生物被膜的形成呈正相關(guān)，而icaR基因與表皮葡萄球菌生物被膜的形成呈負(fù)相關(guān)。

于樹云等[12]發(fā)現(xiàn)，某些表皮葡萄球菌臨床株具有形成生物被膜的能力，而且與icaA基因的存在及正常表達(dá)有關(guān)。而王勇翔等[13]對(duì)19例表皮葡萄球菌臨床分離株通過(guò)半定量粘附實(shí)驗(yàn)、掃描電子顯微鏡法和光學(xué)顯微鏡等方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，表皮葡萄球菌ica操縱子的轉(zhuǎn)錄水平與生物被膜形成密切相關(guān)。與本文研究結(jié)論一致。

RT-PCR受干擾的因素頗多，對(duì)于相對(duì)定量還存在一定的不足，RNA的降解等原因?qū)Y(jié)果的影響較大[14]，但real-time PCR可以為測(cè)定基因轉(zhuǎn)錄水平研究提供準(zhǔn)確可靠的信息[15]。本研究通過(guò)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示icaA和icaR兩種基因的灰度比值差異不顯著，但隨后本研究采用了real-time PCR進(jìn)一步核實(shí)，real-time PCR結(jié)果表明，生物被膜陽(yáng)性表皮葡萄球菌的icaR表達(dá)水平低，而icaA表達(dá)水平高；生物被膜陰性表皮葡萄球菌的icaR表達(dá)水平相對(duì)較高，而icaA表達(dá)水平低。本文菌株數(shù)量偏少，需增大菌株量對(duì)icaA和icaR基因調(diào)節(jié)表皮葡萄球菌生物被膜的形成進(jìn)一步研究，以便為治療表皮葡萄球菌生物膜藥物的研究提供有力的理論基礎(chǔ)。

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（本文編輯 楊 瑛）