α—亞麻酸對(duì)干旱脅迫下水稻種子萌發(fā)的影響

李東 甄春燕 陳德富 陳喜文

摘 要： α-亞麻酸屬ω-3系統(tǒng)的多不飽和脂肪酸，是細(xì)胞膜的重要組成部分。在干旱脅迫下，植物通過(guò)釋放α-亞麻酸重塑細(xì)胞膜的流動(dòng)性，但外源添加α-亞麻酸能否提高植物對(duì)干旱的抗性尚未可知。該研究采用PEG6000模擬干旱脅迫，探討了種子萌發(fā)過(guò)程中α-亞麻酸對(duì)水稻萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中抗旱性的影響。結(jié)果表明：在14%和16% PEG干旱脅迫下，水稻種子推遲萌發(fā)，幼苗的生長(zhǎng)受到抑制。25 μmol·L-1和250 μmol·L-1的α-亞麻酸可緩解干旱對(duì)水稻幼根和幼苗生長(zhǎng)的抑制，且隨著干旱程度的增加，緩解作用增強(qiáng)。16% PEG脅迫下，25 μmol·L-1、250 μmol·L-1的α-亞麻酸分別提高幼苗的根長(zhǎng)34.3%和29.1%、苗長(zhǎng)67.8%和52.0%、根重43.9%和35.2%、苗重59.1%和43.6%。α-淀粉酶活力測(cè)定發(fā)現(xiàn)，25 μmol·L-1和250 μmol·L-1的α-亞麻酸分別提高干旱脅迫下水稻種子α-淀粉酶活力為56.7%～70.7%和36.8%～43.8%。水稻幼根活力測(cè)定顯示，25 μmol·L-1和250 μmol·L-1的α-亞麻酸分別提高干旱脅迫下幼根活力為11.4%～28.4%和5.4%～22.2%。此外，還對(duì)不同干旱脅迫下水稻種子α-淀粉酶活性和幼根活力的變化進(jìn)行了討論，認(rèn)為α-亞麻酸主要通過(guò)提高種子萌發(fā)過(guò)程中α-淀粉酶的活性來(lái)緩解所遭遇的干旱脅迫，而對(duì)水稻幼根活力的影響則相對(duì)有限。

關(guān)鍵詞： 水稻， α-亞麻酸， 干旱脅迫， PEG， 種子萌發(fā)， α-淀粉酶

中圖分類號(hào)： Q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-3142（2018）08-1025-07

Abstract： As a member of ω-3 polyunsaturated fatty acids， α-linolenic acid （ALA） is a component of plant cell membrane. It was shown that plants release ALA to remodel the mobility of cell membrane under drought stress. However， it is not known whether exogenous ALA can increase the plant tolerance to drought stress. In this research， we studied the impact of additional ALA on the drought tolerance of rice seeds under PEG6000 during the germination and seedling stage. The result showed that under 14% and 16% PEG stresses， the germination of rice seeds was postponed and their seedlings growth were inhibited. After addition of 25 μmol·L-1 or 250 μmol·L-1 of ALA， the inhibiting effect owing to the drought stress was relieved. And the alleviatng effect became stronger as the stress became severer. Under drought stress with 16% PEG， 25 μmol·L-1 and 250 μmol·L-1 of ALA improved the root length by 34.3% and 29.1%， respectively， while improved the seedling length by 67.8% and 52.0%； the root weight was increased by 43.9% and 35.2%， and the seedling weight was increased by 59.1% and 43.6%， respectively. Analysis of α-amylase activity in rice grains under 14% and 16% PEG stress showed， after addition of 25 μmol·L-1 and 250 μmol·L-1 ALA， the activity was increased by 56.7%-70.7% and 36.8%-43.8%， respectively. Analysis of root activity showed that after addition of 25 μmol·L-1 and 250 μmol·L-1 of ALA， the root activity under 14% and 16% PEG stresses were increased by 11.4%-28.4% and 5.4%-22.2%， respectively. The change of α-amylase activity and root activity with different PEG concentrations were also discussed. Therefore， we propose that ALA can relieve the drought tolerance of rice seeds mainly by means of increasing α-amylase activity during seed germination and seedling growth stages， while with a limited effect on root activity of rice radicle.

Key words： rice， α-linolenic acid， drought stress， PEG， seed germination， α-amylase

幾乎所有作物的耕作和園藝植物的培養(yǎng)均始于種子。人類種植的作物大多通過(guò)種子一代代地延續(xù)繁殖下去。種子萌發(fā)是指成熟的種子從吸水膨脹開(kāi)始，到胚根出現(xiàn)結(jié)束的生理過(guò)程（Rajjou et al，2012）。種子萌發(fā)是植物生命周期中的最重要階段，決定了植物何時(shí)能進(jìn)入自然或農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)（Weitbrecht et al，2011）。種子成功萌發(fā)的最關(guān)鍵因素是合適的環(huán)境。這個(gè)過(guò)程不是干種子獨(dú)立的生物過(guò)程，而是與種子的成熟、脫水和幼苗建成相連續(xù)的過(guò)程。

生物膜是細(xì)胞與外界進(jìn)行信息交流和物質(zhì)交換的場(chǎng)所。各種生物和非生物脅迫對(duì)細(xì)胞的傷害主要起始于細(xì)胞膜。膜脂和膜蛋白是細(xì)胞膜的重要組成部分，它們的結(jié)構(gòu)、組成及相互作用對(duì)細(xì)胞抵抗脅迫的能力具有重要的影響（王善廣等，2000）。生物膜中約有100種脂質(zhì)，只要其中的1%～2%組分發(fā)生改變，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的存活受到影響（王善廣等，2000）。膜結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化是研究植物抗逆的一個(gè)重要方面。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）由于只含有單一的不飽和脂肪酸，是研究多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）功能的理想材料（Yazawa et al，2010）。利用釀酒酵母的研究發(fā)現(xiàn)，PUFA在逆境脅迫下具有保護(hù)功能，能提高細(xì)胞應(yīng)對(duì)氧化脅迫、低溫、鹽堿、酒精和堿性pH等逆境的能力（Yazawa et al，2010）。逆境脅迫下，膜流動(dòng)性的改變?yōu)橐恍┲匾恼夏さ鞍祝ㄈ绻夂献饔孟嚓P(guān)蛋白）發(fā)揮功能提供一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)境。有證據(jù)表明，擬南芥葉綠體中油酸（18∶1）含量的改變可啟動(dòng)應(yīng)對(duì)病原體相關(guān)基因的表達(dá)（Kachroo et al，2001）。并且，油酸（18∶1）含量對(duì)植物防御基因表達(dá)（Kachroo et al，2001）和種子中曲霉菌繁殖都有一定影響（Calvo et al，1999）。

α-亞麻酸（α-linolenic acid，ALA）是ω-3系統(tǒng)的PUFAs，是細(xì)胞膜的重要組成部分。植物在應(yīng)對(duì)生物與非生物脅迫時(shí)，可通過(guò)釋放α-亞麻酸，重塑膜的流動(dòng)性（Iba，2002）。游離的α-亞麻酸是逆境脅迫下的信號(hào)分子，本身也是phyto-oxylipin生物合成的前體（Blée，2002）。過(guò)表達(dá)ω-3去飽和酶基因的轉(zhuǎn)基因煙草，膜中18∶3不飽和脂肪酸含量升高，對(duì)鹽和干旱脅迫抗性得以提高（Zhang et al，2005）。本文研究了外源添加α-亞麻酸對(duì)模擬干旱脅迫下水稻種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)及相關(guān)生理特性的影響，為緩解水稻萌發(fā)期的干旱脅迫提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

所用的材料是水稻日本晴（Oryza sativa cv. Nipponbare）當(dāng)年的種子。種子從天津?qū)氎嬖囼?yàn)地收獲，經(jīng)過(guò)陽(yáng)光充分曬干后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 干旱脅迫下種子的萌發(fā)

本研究參照Michel & Kaufmann（1973）提出的PEG6000對(duì)水勢(shì)的影響，采用不同濃度PEG6000模擬干旱處理。水稻種子用0.1%高錳酸鉀消毒5 min后，用蒸餾水清洗5～6次，然后播種于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿播種40粒飽滿的種子，分別添加10%、12%、14%、16% （w/v）的PEG6000溶液30 mL，28 ℃、12 h光/12 h暗脅迫下培養(yǎng)。每隔2 d分別向培養(yǎng)皿中補(bǔ)加上述相同的溶液5 mL。以芽長(zhǎng)超過(guò)2 mm計(jì)為發(fā)芽，定期統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。培養(yǎng)到10 d時(shí)從每皿中選取最先萌發(fā)的20株，測(cè)定幼苗的根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)、根重和苗重。

1.3 α-亞麻酸對(duì)PEG脅迫下種子萌發(fā)的影響

首先取70%α-亞麻酸（商品原液）1 mL用無(wú)水乙醇溶解，邊加水邊攪拌定容至10 mL。然后將α-亞麻酸乳液超聲震蕩至溶液呈乳白色，使α-亞麻酸與水充分混勻，配制成25 mmol·L-1α-亞麻酸母液。選取40粒飽滿種子，培養(yǎng)在含0、1、5、25、250 μmol·L-1α-亞麻酸的14%和16% PEG6000濾紙上萌發(fā)，培養(yǎng)脅迫同上。種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)狀況的統(tǒng)計(jì)也同上。

1.4 α-淀粉酶活性的測(cè)定

使用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的淀粉酶試劑盒。其測(cè)定原理是利用α-淀粉酶可作用于淀粉中的α-1，4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、糊精等還原糖，從而能使3，5-二硝基水楊酸還原成棕紅色物質(zhì)，顏色的深淺可通過(guò)測(cè)定反應(yīng)液吸光度來(lái)反映。選取各種脅迫下萌發(fā)3 d的種子，去掉種皮、萌發(fā)的幼根和幼苗，在研缽中充分研磨后，加入1 mL雙蒸水，轉(zhuǎn)移到離心管中。4 500 r·min-1離心10 min，吸取500 μL上清轉(zhuǎn)移至試管中，加蒸餾水定容到10 mL，即為淀粉酶提取液。將試管于70 ℃水浴15 min，失活β-淀粉酶。對(duì)照管、測(cè)定管分別加入3，5-二硝基水楊酸置于40 ℃恒溫水浴中保溫10 min，540 nm處讀取吸光度，計(jì)算ΔA=A（測(cè)定管）-A（對(duì)照管）。以每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1 mg還原糖定義為1個(gè)酶活力單位。α-淀粉酶活性（U·g-1鮮重）=89.4×（ΔA+0.022）÷W，W為種子鮮重。

1.5 根活力的測(cè)定

根據(jù)Zhang et al（2015）的方法，利用無(wú)色的脂溶性光敏感復(fù)合物2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）可被細(xì)胞內(nèi)呼吸作用產(chǎn)生的還原氫還原成紅色TTF的反應(yīng)，來(lái)檢測(cè)根的活力。取α-亞麻酸實(shí)驗(yàn)中萌發(fā)7 d時(shí)的根0.05 g，剪成1 cm左右長(zhǎng)度片段，浸泡于0.6% TTC（溶于pH7.4的磷酸緩沖液中），30 ℃染色24 h，取出，倒掉染液，用蒸餾水清洗3次后，用95%乙醇于85 ℃抽提20 min，提取液于485 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每種脅迫播種3皿，每皿中含有種子40粒。生理指標(biāo)數(shù)據(jù)均通過(guò)3次獨(dú)立測(cè)定而獲得。利用SPSS11.0下使用ANOVA-Student-Newman-Keuls檢測(cè)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異水平分析，以95%為置信區(qū)間。相同脅迫下不同PEG或ALA處理下各組的顯著性差異水平，用a、b、c或星號(hào)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度PEG對(duì)水稻種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

為探索不同PEG6000干旱脅迫對(duì)水稻種子萌發(fā)的影響，將種子播種在含10%、12%、14%、16%、18%、20% （w/v）PEG6000的濾紙上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著PEG濃度的提高，水稻種子的萌發(fā)均被推遲，但到第5天時(shí)，各PEG濃度下種子均基本全部萌發(fā)（表1）。雖然18%、20%PEG脅迫下，7 d時(shí)萌發(fā)率可達(dá)75%，但由于種子均變成黑色，幼苗生長(zhǎng)也幾乎停止。因此，選擇14%、16% PEG6000作為后續(xù)干旱處理的濃度。

為進(jìn)一步探索不同干旱脅迫對(duì)水稻早期幼苗生長(zhǎng)的影響，統(tǒng)計(jì)了14%、16% PEG濃度下萌發(fā)10 d時(shí)的幼苗生長(zhǎng)狀況。表2結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，14% PEG濃度下，幼苗的苗長(zhǎng)、根重、苗重分別是對(duì)照的0.65倍，0.36倍和0.42倍；16% PEG濃度下，則分別是對(duì)照的0.41倍，0.28倍和0.29倍。隨著干旱程度的增強(qiáng)，干旱對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制程度也增強(qiáng)。在14%、16% PEG濃度下，水稻幼苗的根長(zhǎng)分別是對(duì)照的1.63倍和1.26倍，但冠根數(shù)目大幅減少。因此，推測(cè)干旱脅迫下，水稻幼苗可通過(guò)延長(zhǎng)根的長(zhǎng)度，吸收盡可能多的水分來(lái)抵抗干旱逆境。

2.2 α-亞麻酸對(duì)干旱脅迫下種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

為探索α-亞麻酸對(duì)干旱脅迫下種子萌發(fā)和幼苗早期生長(zhǎng)的影響，將水稻種子分別播種在添加0、1、5、25、250 μmol·L-1α-亞麻酸的14% PEG6000和16% PEG6000培養(yǎng)皿中進(jìn)行發(fā)芽。表3結(jié)果顯示，α-亞麻酸對(duì)水稻種子的萌發(fā)勢(shì)和萌發(fā)率均沒(méi)有明顯的提高作用。

根據(jù)不同濃度α-亞麻酸對(duì)干旱脅迫下幼苗生長(zhǎng)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)25 μmol·L-1和250 μmol·L-1的α-亞麻酸的作用最為顯著。為此，詳細(xì)分析了25 μmol·L-1和250 μmol·L-1的α-亞麻酸對(duì)干旱脅迫下幼苗生長(zhǎng)抑制的緩解作用（圖1）。從圖1結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14% PEG脅迫下，25 μmol·L-1和250 μmol·L-1的α-亞麻酸對(duì)水稻幼苗的生長(zhǎng)都有顯著影響。與對(duì)照相比，苗長(zhǎng)分別提高了23.7%和18.9%，根重分別提高了47.0%和51.0%，苗重分別提高了35.3%和29.7%，但根長(zhǎng)僅稍有增長(zhǎng)；16% PEG脅迫下，隨著干旱程度的增強(qiáng)，25 μmol·L-1和250 μmol·L-1的α-亞麻酸對(duì)幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用增強(qiáng)。與對(duì)照相比，幼苗的根長(zhǎng)分別提高了34.3%和29.1%，苗長(zhǎng)提高了67.8%和52.0%，根重分別提高了43.9%和35.2%，苗重分別提高了59.1%和43.6%。

2.3 α-亞麻酸對(duì)干旱脅迫下對(duì)水稻種子發(fā)芽過(guò)程中α-淀粉酶活性的影響

水稻種子萌發(fā)時(shí)，α-淀粉酶活性是種子活力的一個(gè)重要指標(biāo)。為探究α-亞麻酸對(duì)干旱脅迫下水稻種子的萌發(fā)能力的影響，測(cè)定了種子萌發(fā)早期α-淀粉酶的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14% PEG脅迫下，當(dāng)用25 μmol·L-1和250 μmol·L-1α-亞麻酸處理水稻種子時(shí)，α-淀粉酶活力分別比對(duì)照提高了70.7%和43.8%。16% PEG處理下，當(dāng)用25 μmol·L-1和250 μmol·L-1α-亞麻酸處理水稻種子時(shí)，α-淀粉酶活力分別比對(duì)照提高了56.7%和36.8%。同一α-亞麻酸濃度下，16% PEG脅迫下的α-淀粉酶活力均比14% PEG脅迫下的活力要低25%～31%（圖2）。

2.4 α-亞麻酸對(duì)干旱脅迫下水稻種子發(fā)芽過(guò)程中根活力的影響

根系是植株吸收水分的主要器官，根活力的高低一定程度上反應(yīng)其耐旱能力。為探究α-亞麻酸對(duì)干旱脅迫下水稻幼苗抗旱能力的影響，測(cè)定了14%和16% PEG6000脅迫下外加25 μmol·L-1 和250 μmol·L-1后根活力的變化。從圖3結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在14% PEG脅迫下，25 μmol·L-1 和250 μmol·L-1α-亞麻酸使根的活力分別比對(duì)照提高了28.4%和22.2%；在16% PEG脅迫下，幼根的活力分別比對(duì)照提高了11.4%和5.4%。同一α-亞麻酸濃度下，16% PEG脅迫下的根系活力均比14% PEG脅迫下的根系活力要高5%～42%。

3 討論

利用外源物質(zhì)提高植物抵抗逆境脅迫的能力，在植物抗性研究中越來(lái)越引起關(guān)注。目前報(bào)道外源添加茉莉酸甲酯（MeJA） （董桃杏等，2007）、水楊酸（SA） （夏方山等，2014）、一氧化氮（NO）供體硝普鈉（SNP） （毛亞斌和魏小紅，2010）、5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）（張春平等，2010）和甜菜堿（GB）等能提高植物抵抗逆境的能力。這些物質(zhì)大多是通過(guò)降低植物膜脂的過(guò)氧化程度，促進(jìn)脯氨酸和可溶性糖的積累，提高SOD、POD等保護(hù)酶活性來(lái)緩解滲透脅迫（毛亞斌和魏小紅，2010；夏方山等，2014）。α-亞麻酸是植物細(xì)胞膜脂的重要成分，外源添加是否提高植物抵抗逆境的能力尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究利用14%和16% PEG6000模擬干旱，證實(shí)了外源添加α-亞麻酸對(duì)水稻種子萌發(fā)過(guò)程中的干旱脅迫具有一定的緩解作用。α-亞麻酸的濃度以25 μmol·L-1和250 μmol·L-1為宜，但濃度過(guò)高和過(guò)低并未對(duì)植株的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生明顯的副作用，顯示α-亞麻酸不太可能作為信號(hào)分子而發(fā)揮作用。而且，α-亞麻酸對(duì)干旱脅迫的緩解主要表現(xiàn)在對(duì)幼苗早期生長(zhǎng)的緩解上，對(duì)種子的萌發(fā)率并沒(méi)有提高。對(duì)幼苗早期生長(zhǎng)的影響也主要表現(xiàn)在苗長(zhǎng)、苗重和根重上，對(duì)根長(zhǎng)的作用并不顯著。似乎干旱脅迫下幼苗通過(guò)延長(zhǎng)根長(zhǎng)來(lái)提高對(duì)水分吸收的能力是一種本能性的反應(yīng)。

水稻屬淀粉型種子，胚乳中主要的貯藏物質(zhì)是淀粉。當(dāng)種子萌發(fā)時(shí)，淀粉酶發(fā)揮作用，將貯藏物質(zhì)水解為簡(jiǎn)單的有機(jī)物，供給種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)發(fā)育所需要。水稻種子中存在多種淀粉酶，萌發(fā)初期主要起作用的是α-淀粉酶。因此，α-淀粉酶活性的高低關(guān)系到種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的速度，是種子活力的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究中，在各種干旱脅迫下（14% PEG和16% PEG），添加α-亞麻酸均能顯著提高α-淀粉酶的活性（36.8%～70.7%）。而且，隨著干旱程度的增加，α-淀粉酶活性普遍降低。即種子內(nèi)α-淀粉酶的活性高低與其所遭遇的干旱程度呈負(fù)相關(guān)。因此我們認(rèn)為，α-淀粉酶活性高低能反映干旱脅迫下水稻種子的萌發(fā)能力。外源添加α-亞麻酸提高種子萌發(fā)過(guò)程中α-淀粉酶的活性來(lái)緩解所遭遇的干旱脅迫。

根系是植物活躍的吸收器官和代謝器官?；盍Φ拇笮】勺鳛橹参锔滴账帧B(yǎng)分及逆境生存能力的一個(gè)重要指標(biāo)。根系的代謝越強(qiáng)，活力也越強(qiáng)。因此，根活力的高低一定程度上反應(yīng)其耐旱能力。本研究中，各種干旱脅迫下（14% PEG和16% PEG），添加α-亞麻酸雖在一定程度提高根的代謝活力（5.4%～28.4%）。但高濃度（16% PEG）脅迫下，α-亞麻酸對(duì)干旱脅迫下的根系活力的提高非常有限（5.4%～11.4%）。而且，隨著干旱程度的增加，根的代謝活力普遍增加。因此，我們推測(cè)干旱脅迫下根系活力的增強(qiáng)也可能是植物對(duì)干旱脅迫的一種適應(yīng)性反應(yīng)，α-亞麻酸通過(guò)提高根系活力來(lái)提高植物抗旱性的作用非常有限。

總之，本研究從形態(tài)和生理的角度證實(shí)，外源添加α-亞麻酸主要通過(guò)提高干旱脅迫下萌發(fā)水稻種子的α-淀粉酶活性，從而達(dá)到緩解干旱脅迫的目的。由于α-亞麻酸是一種細(xì)胞膜脂的成分，今后的研究應(yīng)集中于其對(duì)膜脂成分及膜脂過(guò)氧化程度的影響上，進(jìn)一步揭示其緩解干旱脅迫的機(jī)制。

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