“固液雙層”培養(yǎng)法誘導(dǎo)馬鈴薯‘米拉’試管薯的研究

方志榮 周才懿 李佩華 清源

摘 要： 該研究以馬鈴薯‘米拉品種的脫毒試管苗為材料，采用“固液雙層”的培養(yǎng)方式，通過正交試驗對其試管苗壯苗生長階段和試管薯誘導(dǎo)階段的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，并通過單因素試驗研究蔗糖濃度、光照條件和CCC濃度對試管薯結(jié)薯的影響。結(jié)果表明：在“固液雙層”培養(yǎng)中，‘米拉壯苗培養(yǎng)階段優(yōu)化的培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基（硝酸銨為2 000 mg·L-1、硝酸鉀為2 000 mg·L-1）+ 500 mg·L-1 CCC + 0.1% 活性炭 + 0.1 mg·L-1 DA-6 + 1 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA + 3%蔗糖 + 6 g·L-1 瓊脂，pH 5.8。試管薯誘導(dǎo)及生長階段優(yōu)化的培養(yǎng)基為MS1培養(yǎng)基（微量元素和鐵鹽的用量為MS培養(yǎng)基的2倍）+ 1.5% 活性炭+ 4 mg·L-1 6-BA + 8%蔗糖。在試管薯誘導(dǎo)階段，弱光4 h·d-1培養(yǎng)誘導(dǎo)的試管薯，結(jié)薯指數(shù)、大薯率、薯塊重量均優(yōu)于暗培養(yǎng)?！肮桃弘p層”培養(yǎng)是一種低成本的方法，在組織培養(yǎng)室內(nèi)就可以大量繁殖‘米拉試管薯，并且能增加原種的數(shù)量，這種方法也能用于馬鈴薯其他栽培品種試管薯的誘導(dǎo)。

關(guān)鍵詞： 馬鈴薯， 試管薯， 6-芐基腺嘌呤， 矮壯素， 活性炭， 胺鮮酯， 組織培養(yǎng)

中圖分類號： Q945.51 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-3142（2018）09-1172-11

Abstract： Virus-free plantlets of potato cultivar ‘Mira were used as experimental material to induce potato microtuber by a two-step culture method. In the first step， nodal cuttings （with one or two leaf） of potato plantlets were inoculated solid medium for culturing vigorous potato plantlats. After 20 d， liquid medium was added on the solid medium to proceed to the second step for induction of potato microtuber. The optimum culture media at the stages of culturing vigorous potato plantlets and induction of potato microtuber were obtained by means of orthogonal design， and the effects of sucrose concentration， light condition and CCC concentration on induction of potato microtuber were also studied. The results were as follows： the optimal medium at the stage of culturing vigorous potato plantlets was modified by MS medium （NH4NO3 was changed to 2 000 mg·L-1 and KNO3 was changed to 2 000 mg·L-1 in MS medium）+ 500 mg·L-1 CCC + 0.1% activated carbon + 0.1 mg·L-1 DA-6 + 1 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA + 3% sucrose + 6 g·L-1 agar， pH 5.8， the optimal medium at the stage of induction of potato microtuber was MS1 medium [two times of FeSO4 （Na2EDTA） and trace elements in MS medium] + 1.5% activated carbon + 4 mg·L-1 6-BA + 8% sucrose. The results also showed that illumination with dim light for 4 h·d-1 could obtain potato microtubers with higher frequency of tuberization and big microtubers than dark treatment. The results indicated that“solid + liquid” double-layer culture can be applied for mass propagation of potato tubers ‘Mira at low cost in the plant tissue culture room， and can increase the number of pre-elite seed potatoes. This method can also be used for the production of microtuber of other potato cultivars.

Key words： potato， microtuber， 6-BA， CCC， activated carbon， DA-6， tissue culture

涼山州位于四川省的西南部，屬于典型的高原山地，區(qū)內(nèi)光照充足、晝夜溫差大，有利于馬鈴薯生長，是四川省馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)，尤其是二半山（海拔1 500 m）以上的彝族聚居區(qū)，馬鈴薯既是當?shù)剞r(nóng)民的主要糧食來源，也是主要的經(jīng)濟來源，在這些地區(qū)發(fā)展馬鈴薯產(chǎn)業(yè)是貧困彝區(qū)農(nóng)民脫貧致富的重要渠道。2015年，涼山州馬鈴薯平均單產(chǎn)22.5 t·hm-2，遠低于美國、比利時、新西蘭等國的46.9～48.7 t·hm-2（世界糧農(nóng)組織資料）。實踐證明，推廣應(yīng)用脫毒種薯能顯著提高馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，涼山州生產(chǎn)的脫毒種薯是以脫毒苗為基礎(chǔ)，經(jīng)過煉苗、洗苗、移栽馴化等繁瑣、復(fù)雜的過程，脫毒種薯成本高，夏季網(wǎng)室大棚溫度高，不能進行原種生產(chǎn)，導(dǎo)致涼山州內(nèi)脫毒種薯遠遠不能滿足生產(chǎn)的需求。馬鈴薯脫毒試管薯（microtubers）是指培養(yǎng)瓶內(nèi)的試管苗通過誘導(dǎo)培養(yǎng)，于葉腋內(nèi)形成直徑為2～10 mm大小的塊莖（Vander Zaag， 1988）。馬鈴薯試管薯是繼脫毒試管苗之后發(fā)展起來的一種種質(zhì)保存和生產(chǎn)脫毒種薯的新形式，它體積小、重量輕，便于貯藏、運輸和保存，可以作為“種子”在大田中大規(guī)模種植，既能加快脫毒種薯的繁殖，縮短種薯生產(chǎn)周期，又能周年繁殖，應(yīng)用已日益廣泛。此外，馬鈴薯試管薯被用于馬鈴薯基因工程研究中作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體。

影響馬鈴薯試管薯形成的因素很多，除與基因型（Khalil et al， 2017；Gopal et al， 2004）有關(guān)外，還受溫度（ 蔣從蓮和郭華春， 2007； 馬偉清等， 2010）、培養(yǎng)方式（ 帥正彬等， 2004；白淑霞等， 2002）、光照（Hussain et al， 2006）、碳源（Gopal et al， 2004）、礦質(zhì)營養(yǎng)（ Radouani & Lauer， 2015；馬偉青等， 1999）、植物生長調(diào)節(jié)劑（Gopal et al， 2004）等多種因素的影響。Pelacho & Mingo-Castel （1991）指出，只有在誘導(dǎo)結(jié)薯的前一階段培養(yǎng)出莖干粗壯、根系發(fā)達、葉色濃綠的試管苗，才能獲得優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的試管薯。因此，試管薯一般通過兩步法誘導(dǎo)，即先將馬鈴薯脫毒試管苗接種到壯苗培養(yǎng)基上進行壯苗，然后進行試管薯誘導(dǎo)。不同培養(yǎng)方式誘導(dǎo)試管薯的研究表明：在相同濃度條件下，液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)的試管薯在結(jié)薯率、薯塊重量、薯塊直徑方面優(yōu)于固體培養(yǎng)基（ Piao et al， 2003； 白淑霞等， 2002）。但是，液體培養(yǎng)操作繁瑣、污染率高、試管苗易折斷、滅菌成本高。“固體+液體”的“固液雙層”培養(yǎng)方式雖然結(jié)薯率低一點，但相比液體培養(yǎng)方式操作簡單、污染率低、滅菌用電少，適合大規(guī)模生產(chǎn)使用（帥正彬等， 2004）。本研究采用“固液雙層”培養(yǎng)體系，使用正交試驗設(shè)計對壯苗階段和試管薯誘導(dǎo)階段的培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，并研究光照、蔗糖濃度及CCC 濃度對試管薯結(jié)薯的影響，以期能找到操作簡便、生長周期短的試管苗及試管薯的高效培養(yǎng)和誘導(dǎo)技術(shù)，為試管薯的培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為本實驗室脫毒的‘米拉（Mira）試管苗。在無菌條件下，將試管苗切成帶1～2個葉節(jié)的莖段后接種于繼代培養(yǎng)基，每瓶15～20苗， 接種后的培養(yǎng)瓶置于光照強度2 000～4 000 lx、光照時間16 h·d-1、溫度（25±2）℃條件下培養(yǎng)，待苗長至約10 cm時備用。

1.2 方法

1.2.1 壯苗培養(yǎng) 取出‘米拉試管苗，在無菌條件下切成單節(jié)莖段，接種到壯苗培養(yǎng)基中，每瓶接種10個莖段。壯苗培養(yǎng)基成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + CCC + 活性炭 + DA-6 + 1 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA + 3%蔗糖 + 6 g·L-1 瓊脂，pH 5.8；基礎(chǔ)培養(yǎng)基，CCC、AC和DA-6的成分和濃度水平采用四因素三水平的正交設(shè)計進行試驗（表1），共9個處理，每個處理5瓶，接種后的培養(yǎng)瓶置于光照強度2 000～4 000 lx、光照時間16 h·d-1、溫度（25±2）℃的條件下培養(yǎng)20 d，統(tǒng)計各個處理的根數(shù)、莖粗、節(jié)間長度、鮮重和葉面積，找出適合‘米拉脫毒試管苗的壯苗培養(yǎng)基。

1.2.2 試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng) 試管薯的誘導(dǎo)采用固液雙層培養(yǎng)的方法，在無菌條件將20 mL無菌的液體培養(yǎng)基加入試管苗進行壯苗培養(yǎng)后的培養(yǎng)瓶中，液體培養(yǎng)基成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + 蔗糖 + 6-BA + 活性炭，pH 5.8?；A(chǔ)培養(yǎng)基、6-BA、活性炭和蔗糖的組合和濃度采用四因素三水平的正交設(shè)計進行試驗（表2），共9個處理，每處理5瓶，接種后在溫度（25±2）℃、弱光4 h·d-1的條件下誘導(dǎo)結(jié)薯。誘導(dǎo)培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計各處理的成薯指數(shù)（結(jié)薯數(shù)/結(jié)薯株數(shù)）、薯塊重量（g）、大薯率（質(zhì)量>0.1 g）和薯塊直徑等，找出適合‘米拉試管薯的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 光照對試管薯結(jié)薯的影響 采用優(yōu)化后的壯苗培養(yǎng)基進行壯苗培養(yǎng)，20 d后向培養(yǎng)瓶中加入20 mL的試管薯誘導(dǎo)優(yōu)化培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)瓶分別放在（25±2）℃下弱光4 h·d-1、弱光8 h·d-1、或全黑暗條件下進行培養(yǎng)，每個處理5瓶，40 d后觀測，篩選利于試管薯結(jié)薯的光照條件。

1.2.3.2 蔗糖濃度對試管薯結(jié)薯的影響 采用優(yōu)化后的壯苗培養(yǎng)基進行壯苗培養(yǎng)，20 d后向培養(yǎng)瓶中加入20 mL的無菌試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的蔗糖濃度為2%、4%、6%、8%，之后在（25±2）℃、弱光4 h·d-1條件下進行培養(yǎng)，40 d后觀測，篩選利于試管薯結(jié)薯的蔗糖濃度。

1.2.3.3 矮壯素濃度對試管薯結(jié)薯的影響 壯苗培養(yǎng)基采用改良MS培養(yǎng)基 + CCC + 1% 活性炭 + 0.1 mg·L-1 DA-6 + 1 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA + 3%蔗糖 + 6 g·L-1 瓊脂，pH 5.8，CCC的濃度為100 mg·L-1和500 mg·L-1進行試管苗的壯苗培養(yǎng)，20 d后向培養(yǎng)瓶中加入20 mL的無菌試管薯誘導(dǎo)優(yōu)化培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)瓶分別放在（25±2）℃、弱光4 h·d-1條件下進行培養(yǎng)，每個處理5瓶，40 d后觀測，確定壯苗培養(yǎng)階段培養(yǎng)基中不同CCC濃度對試管薯結(jié)薯的影響。

1.3 數(shù)據(jù)收集和處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。其中，壯苗培養(yǎng)基和試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化采用極差、方差分析，單因素試驗采用方差分析并用LSD（P<0.05）法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 壯苗培養(yǎng)中最佳培養(yǎng)條件分析

2.1.1 不同處理對試管苗根數(shù)的影響 根的數(shù)量是判斷試管苗生長優(yōu)劣的參數(shù)之一。從表3可以看出，處理組合為A1B2C2D2培養(yǎng)出的根數(shù)最多，每株達到4.9根，且根的長勢較理想；各因素各水平極差分析結(jié)果（表4）表明，各因素對根數(shù)的影響順序為培養(yǎng)基種類 >活性炭 > DA-6 > CCC。在改良的MS培養(yǎng)基上根數(shù)相對較多，2MS培養(yǎng)基上的組培苗根數(shù)少，長勢弱。誘導(dǎo)根的最優(yōu)組合為A1B2C2D1。

2.1.2 不同處理對試管苗莖粗的影響 植株的莖粗可以反應(yīng)植株生長的健壯程度，從表3可以看出，處理組合為A1B2C2D2最健壯，達到每株1.62 mm，其余的8個處理組合在莖粗上無顯著差異。表4結(jié)果表明，CCC、活性炭、培養(yǎng)基種類、DA-6對莖粗的影響程度大致相等。

2.1.3 不同處理對試管苗節(jié)間長度的影響 從表3可以看出，處理組合A3B3C1D2節(jié)間長度最短，為2.90 mm，處理組合為A1B2C2D2節(jié)間長度為3.87 mm，但二者未表現(xiàn)出顯著差異。處理組合A1B3C3D3的節(jié)間長度最大，達到8.27 mm。各因素各水平極差分析結(jié)果（表4）表明，各因素對節(jié)間長度影響順序為培養(yǎng)基種類 > CCC > DA-6 > 活性炭。節(jié)間長度最短的優(yōu)化培養(yǎng)基配方為A3B2C2D2。

2.1.4 不同處理對試管苗葉面積的影響 葉片是植物進行光合作用的器官，葉面積的大小又與植株的健壯度相關(guān)。從表3可以看出， 各處理組合之間，葉面積存在顯著差異；其中，組合A1B2C2D2葉面積最大，達到0.27 cm2；組合A2B3C2D1、A3B1C2D3、A1B3C3D3、A2B1C3D2最小，葉片較細。各因素各水平極差分析結(jié)果（表4）表明，各因素對葉面積的影響順序為培養(yǎng)基種類≈CCC >DA-6≈活性炭。葉面積最大的最優(yōu)組合為A1B2C2D2。

2.1.5 不同處理對試管苗鮮重的影響 由于培養(yǎng)容器面積及高度有限，因此鮮重最能直接反映出植株的健壯程度。從表3可以看出，處理組合A1B2C2D2鮮重最大，每株達0.20 g；處理組合A2B3C2D1、A2B2C1D3、A3B3C1D2鮮重最低，植株較纖細。各因素各水平極差分析結(jié)果（表4）表明，各因素對鮮重的影響順序為DA-6>CCC>培養(yǎng)基種類≈活性炭。適當濃度的DA-6能促進試管苗鮮重的增加，在四因素中對鮮重的影響最大，其次為CCC，培養(yǎng)基種類和活性炭的影響最小。鮮重最大的優(yōu)化培養(yǎng)基配方為A1B2C2D2。

綜合考慮，本研究選擇A1B2C2D2，即改良MS + 100 mg·L-1 CCC + 0.1% 活性炭 + 0.1 mg·L-1 DA-6 + 1 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA + 3%蔗糖+ 6 g·L-1瓊脂，pH 5.8作為壯苗培養(yǎng)基的優(yōu)化培養(yǎng)基配方，利用該配方進行壯苗培養(yǎng)，根數(shù)、莖粗、鮮重、葉面積在所有處理中最大，而節(jié)間長度較短，達到壯苗培養(yǎng)要求。

2.2 試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基及最佳培養(yǎng)條件分析

2.2.1 不同處理對試管薯成薯指數(shù)的影響 由表5可知，不同處理組合對成薯指數(shù)有顯著影響，處理組合A1B2C3D2成薯指數(shù)最大（為1.23），其次為處理組合A3B3C3D1，成薯指數(shù)為0.87，其余組合成薯指數(shù)無顯著差異。各因素、各水平極差分析結(jié)果（表6）表明，各因素對成薯指數(shù)的影響順序為6-BA > 活性炭 > 蔗糖 > 培養(yǎng)基種類，適當濃度的6-BA能增加成薯指數(shù)，對成薯指數(shù)的影響最大，其次為活性炭，蔗糖和培養(yǎng)基種類對成薯指數(shù)的影響較小。成薯指數(shù)最大的培養(yǎng)基組合為A1B2C3D2。

2.2.2 不同處理對試管薯薯塊重量的影響 由表5可知，組合A1B2C3D2薯塊重量最大，為每粒0.25 g，且與其他處理差異顯著。極差分析結(jié)果（表6）表明，各因素對試管薯薯塊重量的影響順序為6-BA >活性炭 > 培養(yǎng)基種類 > 蔗糖，表明可以通過適當調(diào)整6-BA和活性炭濃度增加薯塊重量。誘導(dǎo)薯塊重量增加的最優(yōu)培養(yǎng)基組合為A1B2C3D2。

2.2.3 不同處理對試管薯大薯率的影響 由表5 可知，處理組合A1B2C3D2大薯率最大（為66.15%）；處理組合A2B3C2D2、A3B3C3D1、 A1B3C2D3與A1B2C3D2無顯著差異；處理組合A1B1C1D1大薯率最?。?.34%）。表6結(jié)果表明，各因素對試管薯大薯率的影響順序為6-BA > 培養(yǎng)基種類 > 活性炭 > 蔗糖；適當濃度的6-BA能增加大薯率，對大薯率的影響最大，培養(yǎng)基種類次之，增加KH2PO4的使用量能提高大薯率，活性炭和蔗糖對大薯率的影響相對較小。大薯率最高的培養(yǎng)基組合為A1B3C3D2。

2.2.4 不同處理對試管薯薯塊直徑的影響 由表5可知，處理組合A1B2C3D2薯塊直徑最大（為6.3 mm），與其他組合存在顯著差異，處理組合A1B1C1D1薯塊直徑最小（僅為2.2 mm）。表6結(jié)果表明，各因素對試管薯薯塊直徑的影響順序為活性炭>培養(yǎng)基種類≈6-BA >蔗糖；活性炭濃度的增加能提高薯塊的直徑，對薯塊直徑的影響最大，其次為培養(yǎng)基種類和6-BA， 蔗糖濃度影響最小。薯塊直徑最大的培養(yǎng)基組合為A1B2C3D2。

綜合考慮，選擇組合A1B2C3D2，即 MS1+ 1.5% 活性炭 + 4 mg·L-1 6-BA + 8%蔗糖為試管薯誘導(dǎo)的適合培養(yǎng)基。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 光照對結(jié)薯率的影響 光照是影響馬鈴薯

試管薯形成的主要因素，由表7可知，隨著光照時間的延長，弱光8 h·d-1處理成薯指數(shù)和最大薯重顯著增加；但平均薯重弱光8 h·d-1與黑暗培養(yǎng)無顯著差異；大薯率弱光8 h·d-1處理明顯低于弱光4 h·d-1及黑暗培養(yǎng)；而薯塊直徑則是弱光4 h·d-1和弱光8 h·d-1處理高于黑暗培養(yǎng)。大薯率是試管薯誘導(dǎo)中的一個重要指標，應(yīng)在保證大薯率的前提下，兼顧平均薯重、薯塊直徑和成薯指數(shù)等參數(shù)。因此認為，最佳結(jié)薯的光照條件應(yīng)為弱光處理4 h·d-1。

2.3.2 蔗糖濃度對試管薯結(jié)薯的影響 從表8可以看出，隨著蔗糖濃度的增加，成薯指數(shù)和大薯率顯著增加；在8%的蔗糖濃度下，成薯指數(shù)達1.25，大薯率達到95.63%，最大薯重達到每粒0.491 g；在薯塊重量和薯塊直徑方面，8%的蔗糖濃度與4%和6%無顯著差異，但明顯高于2%（表8）。10%和12%的高蔗糖濃度下，試管薯的成薯指數(shù)、薯塊重量、大薯率和薯塊直徑都明顯下降（表6）。因此認為，適宜的蔗糖濃度應(yīng)為8%。

2.3.3 矮壯素濃度對試管薯結(jié)薯的影響 由表9可知，500 mg·L-1 CCC處理與100 mg·L-1 CCC處理相比，成薯指數(shù)與最大薯重分別提高了29.72%和14.71%。前期壯苗階段，CCC的濃度宜采用500 mg·L-1。

3 討論

在馬鈴薯試管薯結(jié)薯研究中，邱彩玲等（2008）發(fā)現(xiàn)，試管苗長勢與試管薯均粒重成顯著或極顯著正相關(guān)，健壯試管苗比幼嫩試管苗容易結(jié)薯（鄢錚和郭德章， 2004）。因此，培育健壯試管苗是生產(chǎn)較大試管薯的先決條件?！肮桃弘p層”培養(yǎng)方式可以對試管苗生長階段和試管薯誘導(dǎo)及生長階段進行調(diào)控，已成為試管薯誘導(dǎo)的常用方法（白淑霞等， 2002；帥正彬等， 2004；王瑞斌等， 2006）。

在馬鈴薯試管苗壯苗培養(yǎng)中，在原MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上將硝酸銨濃度變?yōu)? 000 mg·L-1、硝酸鉀濃度變?yōu)? 000 mg·L-1，與MS和2倍MS培養(yǎng)基相比，植株鮮重和葉面積增加，植株長勢粗壯，節(jié)間縮短，這與馬偉青等（1999）的研究結(jié)論一致；但在另外的研究中發(fā)現(xiàn)，2倍MS培養(yǎng)基能促進馬鈴薯‘克新4號和‘克新2號試管苗的生長，使其健壯生長（金順福等，1995），這與本研究結(jié)果不一致，可能跟馬鈴薯的品種和基因型差異有關(guān)（Khalil et al， 2017）。CCC是一種植物生長延緩劑，能使試管苗節(jié)間縮短，莖粗、葉片數(shù)和有效擴繁節(jié)段數(shù)增加，但過高濃度則引起毒害，如導(dǎo)致過度低矮、葉片反卷、葉片黃化脫落等現(xiàn)象（吳艷清等， 2015）。本研究發(fā)現(xiàn)100 mg·L-1 CCC 下植株鮮重最大，500 mg·L-1 CCC抑制了植物的生長，明顯地縮短了節(jié)間長度，但未表現(xiàn)出明顯的毒性。胺鮮酯（DA-6， 2-N，N-乙氨基乙基己酸酯）是廣譜性細胞分裂素類植物生長調(diào)節(jié)劑，一定濃度的DA-6能提高草莓植株的葉面積、光合速率以及葉綠素含量，增加草莓的單產(chǎn)（苗鵬飛等， 2007）。DA-6在馬鈴薯試管苗的繁殖方面鮮有報道， 本研究發(fā)現(xiàn)0.1 mg·L-1 DA-6 使馬鈴薯‘米拉試管苗植株鮮重、葉面積和莖粗增加，節(jié)間長度縮短，植株長勢粗壯，因此DA-6可用于馬鈴薯試管薯的擴繁中。在培養(yǎng)基中加入適量的活性碳會促進試管苗的生長和生根（夏靜波等， 2011）。本研究中，0.1%的活性炭對馬鈴薯‘米拉試管苗的生長有促進作用，表現(xiàn)為根數(shù)、莖粗、鮮重和葉面積增加，節(jié)間縮短，植株健壯等，可用于壯苗培養(yǎng)。

在馬鈴薯試管苗結(jié)薯培養(yǎng)中，將MS培養(yǎng)基中的微量元素和鐵鹽的用量改為原來的2倍，成薯指數(shù)、薯塊重量、大薯率和薯塊直徑均得到提高。也有研究發(fā)現(xiàn)，將MS培養(yǎng)基中的微量元素提高4倍，可以誘導(dǎo)結(jié)薯（劉仁祥， 2001）；或?qū)S培養(yǎng)基中鐵鹽的用量改為原來的2倍，可以增加薯塊重量（張志軍， 2004）。我們在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將KH2PO4的用量改為340 mg·L-1，成薯指數(shù)下降，大薯率增加。過高的磷酸二氫鉀降低結(jié)薯數(shù)量，但薯塊重量增加，建議將培養(yǎng)基的磷濃度調(diào)整為255 mg·L-1（張志軍， 2004）。因此，MS培養(yǎng)基中的微量元素、鐵鹽及KH2PO4的用量還需要通過試驗進一步優(yōu)化。在馬鈴薯試管薯結(jié)薯培養(yǎng)中，為了縮短生產(chǎn)周期，提高試管薯的產(chǎn)量和質(zhì)量，使用外源激素是必要的，其中6-BA常用且效果最為顯著（胡云海和蔣先明， 1989；楊宏羽等， 2008）；本研究發(fā)現(xiàn)，在設(shè)定的因素和水平下，6-BA 對成薯指數(shù)，薯塊重量，大薯率的影響最大，說明6-BA對馬鈴薯‘米拉試管苗的結(jié)薯是必須的。高濃度的蔗糖 （6%～10%）是試管薯誘導(dǎo)過程中必不可少的條件（胡云海和蔣先明， 1989；呂長文等， 2004；Gopal et al， 2004）；馬鈴薯‘米拉的結(jié)薯培養(yǎng)基中最適蔗糖濃度為8% （ Elaleem et al， 2015；胡云海和蔣先明， 1989； KhalilL et al， 2017），較高或較低的蔗糖濃度會對試管薯的誘導(dǎo)及生長產(chǎn)生不利的影響，這與本研究結(jié)果一致?；钚蕴孔鳛橐环N吸附劑，在馬鈴薯試管薯的誘導(dǎo)方面具有明顯的效果，促進馬鈴薯試管薯的生成，1.5%的活性炭增加試管薯的成薯指數(shù)、薯塊重量、大薯率和薯塊直徑，此外活性炭的加入減弱了培養(yǎng)基中的光照，促進了營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移，并吸附了代謝中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，從而促進結(jié)薯。光照是影響馬鈴薯試管薯形成的主要原因，試管薯的誘導(dǎo)及生長需要在黑暗條件下完成（Hussain et al， 2006； 崔翠等， 2001； Ali et al， 2018； Elaleem et al， 2015）。馬鈴薯‘米拉結(jié)薯對光照不敏感（崔翠等， 2001），散射光是誘導(dǎo)‘米拉結(jié)薯的最佳條件（趙佐敏， 2005）。本研究結(jié)果表明，在弱光4 h·d-1條件下進行結(jié)薯培養(yǎng)，成薯指數(shù)、薯塊重量、大薯率、最大薯重、薯塊直徑均高于暗培養(yǎng)，這與光照可以延遲葉片衰老（Slimmon et al， 1989），不斷地為試管薯的生長和發(fā)育提供能量有關(guān)。弱光4 h·d-1處理的試管薯在膨大期會超出液體培養(yǎng)基，因此采摘時的發(fā)芽率高，而黑暗條件下誘導(dǎo)的試管薯采摘時發(fā)芽率低，有休眠期，這與帥正彬等（2004）的研究結(jié)果一致。因此，利用這一特點，可以根據(jù)需要選擇弱光或光照培養(yǎng)，需要立即播種的可以采用弱光誘導(dǎo)，需要貯藏、運輸?shù)脑嚬苁?，可以采用黑暗誘導(dǎo)。由于多數(shù)的試管薯著生在試管苗基部、少數(shù)著生在中上部，因此縮短節(jié)間的長度可以讓更多的節(jié)間浸泡在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中以產(chǎn)生更多的試管薯。本研究發(fā)現(xiàn)前期壯苗采用500 mg·L-1 CCC處理，可以使后期試管薯的成薯指數(shù)、最大薯重分別增加29.72%和14.71%。體積大的試管薯具有較高的發(fā)芽率，可以獲得整齊一致的幼苗，0.5 g以上的試管薯可以作為“種子”（Park et al， 2009）直接用于生產(chǎn)，因此試管大薯的培養(yǎng)十分重要。

本研究得出馬鈴薯‘米拉“固液雙層”培養(yǎng)法在試管苗壯苗培養(yǎng)及結(jié)薯誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基的配方及培養(yǎng)條件，獲得了較高的成薯指數(shù)、薯塊重量、大薯率和薯塊直徑，為該品種及其他馬鈴薯主栽品種的種薯快繁提供技術(shù)參考，有重要的科學(xué)及應(yīng)用價值。

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