鈣泵的發(fā)現(xiàn)歷程

任衍鋼 白冠軍 宋玉奇 路彥文

（陽(yáng)泉師范高等專科學(xué)校 山西陽(yáng)泉 045200）

鈣泵的發(fā)現(xiàn)具有漫長(zhǎng)的歷史背景。早在1848年，德國(guó)生理學(xué)家雷蒙德（Emil du Bois-Reymond）在研究動(dòng)物電時(shí)就假定細(xì)胞膜上存在主動(dòng)運(yùn)輸?shù)目赡苄浴?948年，羅森博格（Rosenberg T.）重新闡述主動(dòng)運(yùn)輸（Active transport）的概念［1］。1957年，丹麥科學(xué)家斯科（Skou J.C.）首先發(fā)現(xiàn)了第1 個(gè)具有主動(dòng)運(yùn)輸意義的離子泵——鈉鉀泵。鈉鉀泵的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是開(kāi)啟了人類認(rèn)識(shí)離子泵的先河，斯科也因此分享了1997年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)［3］。鈣泵則是繼鈉鉀泵后被發(fā)現(xiàn)的第2 個(gè)離子泵。鈣泵的研究主要在肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵（sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase，SERCA）、動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜鈣泵（plasma membrane Ca2+ATPase，PMCA）和植物細(xì)胞鈣泵3 個(gè)相對(duì)獨(dú)立的領(lǐng)域進(jìn)行，下文按照歷史的進(jìn)程分別介紹。

1 肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵的發(fā)現(xiàn)及揭示

鈣泵的發(fā)現(xiàn)源自于鈣離子對(duì)動(dòng)物肌肉收縮的影響研究。早在1885年，英國(guó)生理學(xué)家榮格（Ringer S.）發(fā)現(xiàn)離體青蛙心跳在蒸餾水和自來(lái)水中的表現(xiàn)不同（自來(lái)水中含有鈣離子），他通過(guò)逐漸增加鈣離子濃度的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鈣是支持心臟收縮的重要因素［1］。為什么鈣離子能影響肌肉的收縮？1940年，赫爾布輪（Heilbrunn L.V.）通過(guò)注射Ca2+到肌纖維中證實(shí)，鈣離子是在肌纖維中起作用的［2］。20世紀(jì)40年代末，學(xué)者希爾（Hill A.V.）等在骨骼肌收縮的研究中也注意到這一點(diǎn)。20世紀(jì)50年代安瑪莉（Annemarie W.）通過(guò)量化的方法發(fā)現(xiàn)在Mg2+和ATP 存在的情況下，肌肉收縮需要低濃度的Ca2+。那么，肌肉收縮時(shí)鈣離子來(lái)自哪里？人們將肌纖維含有豐富的肌質(zhì)網(wǎng)聯(lián)系起來(lái)。雖然早在1902年，意大利生理學(xué)家瓦拉蒂（Veratti E.）就用光學(xué)顯微鏡對(duì)肌質(zhì)網(wǎng)作了精確的描述，但并不清楚它的作用。直到20世紀(jì)50年代后，電子顯微鏡的應(yīng)用和微量鈣濃度檢測(cè)生化技術(shù)的改進(jìn)才為人們深入研究肌質(zhì)網(wǎng)與鈣離子的活動(dòng)提供了技術(shù)條件。1962年，江橋節(jié)郞（Setsuro E.）和李普曼（Lipmann F.，1935年諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)獲得者）等發(fā)現(xiàn)，ATP 驅(qū)動(dòng)Ca2+脫離肌原纖維進(jìn)入肌質(zhì)網(wǎng)后肌肉松弛［3］。此后江橋節(jié)郞（1964）進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Ca2+從原肌球蛋白排出后肌肉才發(fā)生松弛［4］。1970—1971年，麥克倫南（Maclennan D.H.）和王（Wong P.T.S.）用脫氫膽酸鹽和鹽沉淀方法首次純化了肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵（SRCa2+Mg2+ATPase）。1985年，他們又用DNA 克隆方法獲得肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵全部氨基酸序列，并根據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)和X-光中子衍射圖譜等提出鈣泵的空間結(jié)構(gòu)模型，他們的研究被認(rèn)為是開(kāi)辟了分析離子泵轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的新時(shí)期。同年，博爾曼（Berman M.C.）等通過(guò)外源熒光探針標(biāo)記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵存在2 種蛋白構(gòu)象，一種為E1，對(duì)Ca2+親和力高；另一種為E2，對(duì)Ca2+親和力低，2 種構(gòu)象α-螺旋含量不同，結(jié)合位點(diǎn)互相有協(xié)同作用［5］。

肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵研究取得突破性進(jìn)展是在21世紀(jì)初。2000年，豐島（Toyoshima）等利用分辨率0.26 nm 的透鏡得到肌質(zhì)網(wǎng)膜上結(jié)合Ca2+的鈣泵晶體結(jié)構(gòu)。2年后他們又得到了結(jié)合Ca2+的鈣泵的晶體圖，隨后對(duì)鈣泵傳導(dǎo)Ca2+過(guò)程中的不同鈣泵晶體結(jié)構(gòu)也被結(jié)晶出來(lái)。他們發(fā)現(xiàn)這與肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵的拓?fù)湫再|(zhì)相同［3］。2004年，丹麥科 學(xué)家索倫森（Sorensen T.L.）等也結(jié)晶出2 個(gè)不同狀態(tài)的鈣泵晶體結(jié)構(gòu)。李（Lee A.G.）在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究Ca2+的結(jié)合位點(diǎn)。這期間，斯托克斯（Stokes D.L.）小組提出了一個(gè)描述鈣泵酶中催化循環(huán)過(guò)程的結(jié)構(gòu)模型（圖1）。此外，人們還發(fā)現(xiàn)，即使在Mg2+、Na+、K+的濃度比Ca2+的濃度高出數(shù)萬(wàn)倍的情況下，鈣泵酶仍然會(huì)選擇性吸收Ca2+。在理論方面，杉田（Sugita Y.）等運(yùn)用原子-分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法確認(rèn)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)處酸性殘基的質(zhì)子化狀態(tài)。卡斯特（Costa V.）等運(yùn)用分子模擬和靜電計(jì)算研究Ca2+結(jié)合過(guò)程中幾個(gè)關(guān)鍵中間狀態(tài)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)特征［6］。這一系列研究對(duì)進(jìn)一步了解肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵及研究心肌缺血的機(jī)制提供了新的參考依據(jù)。

圖1 鈣泵循環(huán)和鈣離子通道示意圖

2 動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜鈣泵的發(fā)現(xiàn)及揭示

在鈉鉀泵被發(fā)現(xiàn)之前，人們已經(jīng)注意到細(xì)胞對(duì)微小的鈣離子濃度變化具有很強(qiáng)的敏感性。但是這種差異是如何形成的，曾經(jīng)是個(gè)迷，鈉鉀泵的發(fā)現(xiàn)對(duì)研究這種差異無(wú)疑是一個(gè)重要的啟示。1966年，齊默曼（Zimmerman A.N.E.）等發(fā)現(xiàn)，用無(wú)鈣的“生理鹽溶液”灌注大鼠離體心臟，短時(shí)間內(nèi)即發(fā)生心肌膜損傷，隨后灌注正常含鈣的生理溶液，心臟發(fā)生更為嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)和功能的改變，這種現(xiàn)象被稱之為鈣反常［7］。這種現(xiàn)象顯然與細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多（鈣超載）有關(guān)。同年，沙茨曼（Schatzmann H.J.）在研究人類紅血細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，ATP 酶可從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)運(yùn)出鈣離子，他將這種蛋白質(zhì)命名為質(zhì)膜鈣泵（PMCA），這是人們首次將鈣轉(zhuǎn)運(yùn)與ATP酶聯(lián)系起來(lái)［8］。1977年，加里特（Jarrett H W）等首先證實(shí)有一種蛋白（鈣調(diào)蛋白/鈣調(diào)素，簡(jiǎn)稱CaM）直接參與質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)鈣的活性調(diào)節(jié)［9］。1979年，尼哥（Niggle V.）等利用鈣調(diào)蛋白親和層析方法將較多量的質(zhì)膜鈣泵純化出來(lái)。通過(guò)純化發(fā)現(xiàn)，質(zhì)膜鈣泵由4 種基因編碼，其轉(zhuǎn)錄經(jīng)不同類型的選擇性拼接后可形成多種類型和變體。這些亞型和變體具有不同的Ca2+的外排性質(zhì)，并且在不同組織和細(xì)胞中具有各異的表達(dá)水平，以滿足不同類型細(xì)胞對(duì)于Ca2+精確調(diào)控的需要［10］。1980年，卡羅尼（Caroni P.）和卡洛福林（Carafolin E.）在研究動(dòng)物細(xì)胞鈣泵的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)鈣泵的主要轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)是將Ca2+運(yùn)出細(xì)胞之外［11］。1983年，科學(xué)家依據(jù)質(zhì)膜鈣泵大小約為251kDa，其大小接近單體人紅細(xì)胞酶的2 倍推測(cè)，該離子泵以二聚體形 式存在［12］。1988年，沙爾（Shull G.E.）和格潤(rùn)（Greeb J.）以大鼠腦細(xì)胞為材料，針對(duì)ATP 酶結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，純化得到cDNA 后推出質(zhì)膜鈣泵的氨基酸一級(jí)序列，發(fā)現(xiàn)質(zhì)膜鈣泵包括2 個(gè)亞型，分別含1 176 和1 198 個(gè)氨基酸［13］，他們還依據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)推測(cè)出鈣泵的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)。同年，維爾馬（Verma A.K.）等則利用紅細(xì)胞質(zhì)膜鈣泵的胰蛋白酶水解片段設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針，從人畸胎瘤cDNA 文庫(kù)中推導(dǎo)出的是含1 220 個(gè)殘基的完整亞型的氨基酸序列。比較發(fā)現(xiàn)，該序列與大鼠中獲得的第1 個(gè)亞型的前1 117 個(gè)殘基有大約99%的相同［14］。1994年，費(fèi)根（Fagan M.J.）和賽爾（Saier M.H.）通過(guò)用腎皮質(zhì)Na+/K+-ATP 酶與質(zhì)膜鈣泵比較表明，這2 種泵具有類似的反應(yīng)循環(huán)和35%相同的氨基酸序列，同屬于P 型ATP 酶系列［15］。但是，需要指出的是，因三維晶體結(jié)構(gòu)其胞質(zhì)區(qū)部分較大，本身難形成構(gòu)象，而蛋白質(zhì)的有序排列又是解晶體結(jié)構(gòu)的必要條件，且對(duì)蛋白質(zhì)純化水平也有較高的要求，所以，至今對(duì)質(zhì)膜鈣泵的了解仍然停留在拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)上，需要進(jìn)一步攻克。

3 植物細(xì)胞鈣泵的發(fā)現(xiàn)及揭示

植物中鈣的作用過(guò)去被認(rèn)為是一個(gè)難以捉摸的問(wèn)題。鈣在植物中的總量并不?。ㄓ胢mol／L 計(jì)算），但就需求而言卻屬于微量營(yíng)養(yǎng)素（micronutrient，用μmol／L 量計(jì)算），其原因在于它很大一部分存在于細(xì)胞壁處，極少的一部分存在于細(xì)胞內(nèi)。植物細(xì)胞鈣泵的發(fā)現(xiàn)主要是受動(dòng)物細(xì)胞鈣泵研究的影響。如早在20世紀(jì)50—60年代，科學(xué)家就在動(dòng)物肝和腎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，線粒體具有吸收和積累貯存Ca2+的能力，并且這種吸收與呼吸和ATP 活動(dòng)有關(guān)，并且受解偶聯(lián)劑的抑制。1965年，霍奇斯（Hodges T.K.）和漢森（Hanson J.B.）在玉米細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)同類的現(xiàn)象［1］。但是這些發(fā)現(xiàn)（包括一些用放射性元素45Ca2+）雖然涉及到鈣離子從細(xì)胞流出及ATP 的水解活動(dòng)，但還不足以確定鈣泵是來(lái)自于質(zhì)膜還是細(xì)胞內(nèi)的其他膜系統(tǒng)。直到20世紀(jì)70年代，由于科學(xué)家發(fā)現(xiàn)線粒體中的NADH 脫氫酶受Ca2+的調(diào)節(jié)等，植物線粒體鈣泵的存在才獲得了學(xué)術(shù)界的公認(rèn)。故在植物細(xì)胞中的鈣泵首先在線粒體上發(fā)現(xiàn)。20世紀(jì)80年代進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，植物線粒體鈣泵還受光的影響［1］，緊接著發(fā)現(xiàn)液泡膜上存在鈣泵。1990年，布萊克福德（Blackford S.）等發(fā)現(xiàn)，在植物液泡中同樣存在積累Ca2+的現(xiàn)象，1993年，菲佛（Pfeiffer W.）和海格（Hager A.）在玉米中證實(shí)液泡膜鈣泵的存在［16］。

植物細(xì)胞質(zhì)膜鈣泵發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)80年代末至90年代初，由于技術(shù)上的改進(jìn)，科學(xué)家才從蘿卜苗、菠菜葉等植物組織中（通過(guò)排除其他膜系統(tǒng)上鈣泵）證實(shí)植物細(xì)胞質(zhì)膜上同樣存在鈣泵［17］。

植物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵于1992年在高等植物土豆和煙草中被克隆出來(lái)（它的同系物于1996 和1997年在擬南芥中發(fā)現(xiàn)）。1993—1994年，大衛(wèi)（David E.E.）和洛林（Lorraine E.W.）發(fā)現(xiàn)在植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中同樣存在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣結(jié)合蛋白的同系物，且發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣泵不同于質(zhì)膜上的鈣泵而是與動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣泵類似，植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣泵也不存在Ca/H 的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)［16］。植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣泵主要參與胞漿中Ca2+的調(diào)節(jié)及在種子發(fā)芽、 分泌中起重要的作用。學(xué)者還發(fā)現(xiàn)，質(zhì)膜鈣泵與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵的差異主要是底物的差異，大小119 kDa 的鈣泵既存在于質(zhì)膜也存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，而大小124 kDa 的鈣泵僅存在于質(zhì)膜上［16］。

質(zhì)體內(nèi)的鈣泵于1994年被黃（Huang L.Q.）等確定，它被證實(shí)與哺乳動(dòng)物P 型Ca2+ATP 酶具有同源性［17］。葉綠體上的鈣泵主要發(fā)現(xiàn)存在于內(nèi)膜上（1993—1994）。葉綠體上的鈣泵被認(rèn)為可能在葉綠體基質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)之間的信號(hào)傳導(dǎo)中起作用，以及與葉綠體內(nèi)的代謝和蛋白質(zhì)進(jìn)入葉綠體基質(zhì)等有關(guān)［18］。

植物中鈣泵的類型在20世紀(jì)90年代下半期被鑒定出來(lái)，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，植物質(zhì)膜鈣泵的單體普遍小于哺乳動(dòng)物的單體［17］。但他們也屬于P-型ATP 酶家族［18］。植物質(zhì)膜鈣泵的主要功能被認(rèn)為就是維持胞漿Ca2+的低濃度水平，此外，還有細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、分泌、氣孔等調(diào)節(jié)的功能，也與有絲分裂、向地性、向光性等相關(guān)?？茖W(xué)家還發(fā)現(xiàn)，盡管不同類型的鈣泵作用不同，但都參與細(xì)胞中第2 信使的活動(dòng)，并與蛋白質(zhì)的活性穩(wěn)定和維持、細(xì)胞的分泌和生長(zhǎng)等密切相關(guān)。

總之，從榮格的發(fā)現(xiàn)到今天，對(duì)鈣在細(xì)胞內(nèi)作用的探討已經(jīng)走過(guò)漫長(zhǎng)的道路，20世紀(jì)60年代鈣泵的發(fā)現(xiàn)揭開(kāi)了這項(xiàng)研究新的一頁(yè)，20世紀(jì)90年代至21世紀(jì)初又獲得一系列重要的進(jìn)展。對(duì)上述的要點(diǎn)簡(jiǎn)要?dú)w納為圖2和圖3。

圖2 鈣泵發(fā)現(xiàn)的歷史背景

圖3 鈣泵發(fā)現(xiàn)中的重要事件

綜上所述，鈣泵發(fā)現(xiàn)的歷史順序是沿著肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵—?jiǎng)游锛?xì)胞質(zhì)膜鈣泵—植物細(xì)胞鈣泵的進(jìn)程，它們之間既相對(duì)獨(dú)立又相互影響。與鈉鉀泵研究相比，鈣泵研究相對(duì)滯后，例如鈣離子的跨膜傳輸過(guò)程及鈣泵在信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡中的分子機(jī)制等現(xiàn)在仍不完全清楚。鈣泵研究的重要性不亞于其他離子泵，它的突破性進(jìn)展需要引起進(jìn)一步的關(guān)注。鈣泵的作用廣泛而重要，尤其是在鈣行使第2 信使功能時(shí)起著非常重要的作用，被認(rèn)為是生命和死亡的信號(hào)。正如著名的生理學(xué)家洛維（Otto Loewi 1873—1961，1936年諾貝爾生理學(xué)獲獎(jiǎng)?wù)撸┥邦A(yù)言：是的，鈣是一切！