分散固相萃取凈化UPLC測定煙草中4種水溶性糖

黃淼，楊敬國，姬厚偉，惠非瓊，王芳，龐紅蕊，黃錫娟，劉劍

貴州中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，貴陽市小河區(qū)開發(fā)大道96號 550009

煙草調制后其糖類物質通常占煙草干重的25%～50%，主要包括葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖等，是煙草內在質量重要評價指標之一[1,2]。由于糖類物質在卷煙燃燒過程中能生成多種致香化合物，是重要的香味物質前體物，其含量的多少是影響卷煙的感官品質重要因素之一[3,4]，因此，煙草中糖類化合物的準確定量分析一直是研究熱點。

目前，針對糖的分析檢測，發(fā)展了各種分析方法，因糖類化合物極性較大、沸點高，液相色譜法較為常用，如高效液相色譜法[5]、超高效液相色譜法[6]、離子色譜法[7]等，而氣相色譜法通常需要衍生化處理，步驟繁瑣，應用相對較少[8]。近年來串聯(lián)質譜技術的使用，使得煙草中糖類化合物的檢測方法靈敏度、選擇性有了很大提高，但是設備昂貴，檢測成本高[9,10]。現(xiàn)有此4種糖的煙草行業(yè)標準（YC/T447-2012）[11]，但該標準方法樣品處理及分析時間都較長。本實驗與該標準相比，改變前處理方式，實現(xiàn)快速檢測；同時采用超高效液相色譜，加強檢測效率。

本實驗基于超高效液相色譜的分析速度快、分離度和靈敏度高的優(yōu)勢，同時前處理樣品經(jīng)渦旋振蕩后采用分散固相萃取凈化，建立了一種高效的超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測的煙草中4種水溶性糖的快速分析方法，旨在為煙葉質量評價和卷煙產(chǎn)品開發(fā)提供技術支撐。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑和儀器

煙葉樣品（選自卷煙企業(yè)）；乙腈 （色譜純，美國Fisher公司）；D-果糖，葡萄糖，蔗糖，麥芽糖，純度＞99%（北京百靈威科技有限公司）。

固相吸附劑：Florisil （弗羅里）、石墨化碳、丙磺酸、硅膠、PSA（N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑）SPE散裝吸附劑（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

AcquityTM超高效液相色譜儀(UPLC,美國Waters公司)；高速離心機(德國Hettich公司)；渦旋振蕩儀（美國Talboys公司）；超純水儀 (美國Millipore公司)；分析天平AG104（感量：0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 樣品前處理

準確稱取0.2 g粉碎烘干后的煙葉樣品于50mL試管中，先加入25 mL溶劑，振蕩5 min后靜置3 min，取上層清液2 mL，加入固相吸附劑0.2 g，渦旋振蕩5 min后離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜于色譜瓶，待分析。

1.3 UPLC分析條件

分析柱：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide柱(2.1×100 mm, 1.7 μm)；柱溫：45℃； 進樣量：2 μL；流速：0.15 mL/min；流動相A為0.2%三乙胺/乙腈溶液，B為去離子水；洗脫程序為梯度洗脫。ELSD條件：漂移管溫度50 ℃，載氣30 Psi，噴霧器模式為冷卻，增益為100 bps。通過標準樣品對比保留時間定性，外標法定量。

2 結果與討論

2.1 萃取溶劑的優(yōu)化

本實驗考察了不同比例的乙腈/水溶液對煙草樣品中的水溶性糖的萃取效果，結果如圖1所示，當80%乙腈/水作為萃取溶液時，四種糖的含量均達到最高，萃取效果最佳，因此本實驗選擇80%乙腈/水溶液作為萃取溶劑。

圖1 不同萃取溶劑對煙草中4種糖含量的影響Fig.1 Effect of the different proportion of extraction solution on the contents of 4 sugars in the tobacco

2.2 萃取方式的優(yōu)化

樣品以80%乙腈/水溶液萃取，經(jīng)渦旋振蕩5 min后，考察了超聲時間從0分鐘到10分鐘時不同超聲時間下4種糖的萃取效率，結果發(fā)現(xiàn)超聲時間對四種糖的含量影響不大。因此，本實驗僅采用渦旋振蕩5分鐘的操作對樣品進行前處理，節(jié)省了大量的前處理時間。

2.3 樣品凈化條件的優(yōu)化

煙草樣品基質組分復雜，萃取液通常含有較多的植物堿、蛋白質、色素等干擾成分。為了減少基質干擾和減低色譜柱污染，本實驗選取常用的固相吸附劑如石墨化碳、弗羅里、硅膠土、丙磺酸、PSA作為分散固相吸附劑。如圖2所示，以不加吸附劑的待測樣品作為對照組，弗羅里、硅膠土、丙磺酸、PSA這4種吸附劑均會使糖的含量偏低，而石墨化碳所測的糖的含量和對照組相比結果較為一致。可能是由于這些吸附劑具有一定的極性，對糖類化合物有一定吸附作用，從而使得測定結果偏低，因此選擇石墨化碳作為吸附劑。

圖2 不同吸附劑對樣品含量的影響Fig.2 Effect of the different disperser adsorbents on the contents of analytes

為了進一步優(yōu)化吸附劑的用量，本實驗考察了0.05 g、0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.5 g的石墨化碳吸附劑對2 mL樣品溶液的凈化效果。實驗發(fā)現(xiàn)當其質量為0.2 g時，萃取溶液和對照樣相比已變得澄清，達到凈化效果。且發(fā)現(xiàn)不同量石墨化碳吸附劑對糖的含量幾乎沒有影響，因此，本實驗選擇0.2 g吸附劑，即可滿足實驗需求。

2.4 色譜條件的選擇

本實驗以0.2% 三乙胺/乙腈（A相）和去離子水（B相）作為流動相的洗脫溶劑，選取梯度洗脫，在10 min 內可完成4種水溶性糖的出峰及分離，見圖3。具體梯度洗脫程序見表1。此外，本實驗還對漂移管溫度和載氣壓力進行了優(yōu)化，選取漂移管溫度50 ℃，載氣壓力為30 psi時，色譜圖基線平穩(wěn)，噪聲信號最小。

表1 UPLC梯度洗脫程序Tab.1 UPLC gradient elution program

圖3 超高效液相色譜圖Fig.3 UPLC chromatograms

2.5 工作曲線、相關系數(shù)、檢測限和定量限

制備系列濃度為4 μg/mL-1000 μg/mL的4種糖的混合標準溶液，按1.3的色譜條件進行分析。以目標物峰面積(Y)對標準工作溶液的質量濃度(X)進行對數(shù)線性回歸，其線性回歸方程、相關系數(shù)、檢出限、定量限、回收率和精密度如表2所示。該本方法靈敏度較高，適合于定量分析。

2.6 方法比較

和煙草行業(yè)標準方法（YC/T 447-2012）[11]和湯建國等[6]的方法相比，本實驗方法因無需長時間振蕩萃取或超聲萃取，大大縮短檢測時間或前處理時間，且本方法增加凈化步驟，通過分散固相萃取劑的凈化后，可以很大程度上減少色素、植物堿、蛋白質等干擾物質，從而降低色譜柱污染及色譜基線，增加檢測靈敏度。

2.7 實際樣品的測定

選取對貴州省12個煙葉樣本，分別利用煙草行業(yè)標準方法[11]（YC/T 447-2012）（方法1）和本實驗方法（方法2）對煙葉樣本中的4種水溶性糖含量進行了測定。每個樣本平行測定3次，結果取平均值，見表3。兩組方法所測結果較為一致。表明此方法可用于樣品煙葉中水溶性糖的準確測定。

表2 煙草中4種水溶性糖的回歸方程、決定系數(shù)、檢測限和定量限Tab.2 Regression equations ,coefficients of determination, limits of detection and quantification of 4 water-soluble sugars in tobacco

表3 煙葉中水溶性糖的含量Tab.3 Contents of water-soluble sugar in tobacco leaf mg/g

3 結論

本文通過對樣品提取、色譜等條件的優(yōu)化，建立了一種DSPE–UPLC/ ELSD快速測定煙草中的4種水溶性糖含量的方法。該方法簡便、快速、靈敏度高，采用分散固相萃取凈化后，減少色素等化合物的干擾，有效降低樣品對色譜柱的污染。本方法適用于大批量煙草中4種水溶性糖的快速測定，為煙葉質量評價提供技術支持。