新合成材料PLGA-STPGS制備的大黃素納米粒 誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

田 燕，劉 琦，張成鴻，高 萌，金 越，徐 紅，李慶偉

(1. 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116081；2. 大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116044； 3. 大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連 116044)

原發(fā)性肝癌是世界上癌癥致死率排在第3位的惡性腫瘤[1-2]，但目前治療肝癌的方法有限。采用納米粒(nanoparticles, NPs)等靶向給藥系統(tǒng)、提高化療藥物的靶向性是目前一種常見的肝癌治療手段[3]。大黃素(emodin, EMO)是中藥大黃、何首烏等的重要有效單體，具有抗菌消炎、肝臟保護(hù)、抗癌等藥理作用[4-6]，但以EMO為主要成分并投入臨床治療的制劑較少，主要是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)中含有較多的游離酚羥基、不穩(wěn)定，又由于其在水中的溶解性較差、口服生物利用度較低，限制了其在臨床中的應(yīng)用。本研究將EMO制成納米粒，通過材料的包載作用，可提高EMO的體外穩(wěn)定性，并通過控制粒徑大小使其被動(dòng)靶向到肝臟，更好的發(fā)揮對(duì)肝癌的治療作用[7]。

納米粒載體材料的選擇是制備納米粒的關(guān)鍵因素之一，其中乙交酯丙交酯共聚物(polylactide-co-glycolide, PLGA)是目前研究和應(yīng)用較為成熟的合成高分子材料，有可靠的生物相容性、無免疫原性及可生物降解、無毒性[8]。維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate, TPGS)是納米粒制備過程中的高效乳化劑，有提高疏水性藥物吸收、加強(qiáng)抗腫瘤藥物的滲透性和吸收性等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。因此，本課題組將二者通過酯化反應(yīng)合成新的高分子材料乙交酯丙交酯共聚物-琥珀?；S生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(polylactide-co-glycolide succinyl-D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate, PLGA-STPGS)，可通過控制納米粒的粒徑，實(shí)現(xiàn)所載藥物對(duì)肝臟的被動(dòng)靶向作用，由于TPGS是P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的抑制劑及其較好的水溶性[10]，可使藥物在腫瘤細(xì)胞中更好的發(fā)揮治療作用。

本研究在此基礎(chǔ)上，以EMO為模型藥物，以PLGA-STPGS為載體材料，通過乳化溶劑揮發(fā)法制備大黃素PLGA-STPGS納米粒(emodin-loaded PLGA-STPGS nanoparticles, EPTN)，并以市售材料PLGA為對(duì)照制備大黃素PLGA納米粒(emodin-loaded PLGA nanoparticles, EPN)，測(cè)定二者粒徑、載藥量(drug loading, DL)和包封率(entrapment efficiency, EE)；選擇人肝癌細(xì)胞HepG2為模型細(xì)胞，將2種NPs分別在體外與HepG2細(xì)胞孵育24 h和72 h，再用膜聯(lián)蛋白V-熒光素異硫氰酸酯(annexin V-fluorescein isothiocyanate, Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide, PI)雙染試劑盒和原位凋亡檢測(cè)試劑盒(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end labelling, TUNEL)檢測(cè)凋亡的細(xì)胞，以評(píng)價(jià)EPTN在體外誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的效果。

1 材料與方法

1.1試劑大黃素(純度97%，美侖生物公司，批號(hào)J0510A)；TPGS(MBWB1500，美國Eastman化學(xué)公司，批號(hào)：09060025)；PLGA(50∶50；MBWB40 000，山東省醫(yī)療器械研究所，批號(hào)：16042609)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：20170519)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：20161123)；其他所用試劑均為分析純。

1.2細(xì)胞株人肝癌HepG2細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。

1.3儀器XS105DU電子天平(梅特勒托利多有限公司，瑞士)；Olympus CKX41熒光倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；TENSOR27傅立葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrophotometer, FTIR，Bruker Optics公司，德國)；AVANCEIII HD1H-核磁共振光譜儀(1H nuclear magnetic resonance,1H-NMR，400M，Bruke公司，瑞士)；Milford凝膠滲透色譜儀(Gel permeation chromatography, GPC，Waters公司，美國)；NanoZS90激光粒徑儀(Marlvern公司，英國)；BD FACSAria II流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司，美國)。

1.4PLGA-STPGS的合成精密稱取TPGS 300 mg(0.2 mmol)和丁二酸酐50 mg(0.5 mmol)于燒瓶中，加二氧六環(huán)溶解。加入一定量的4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine, DMAP)為催化劑，在60 ℃反應(yīng)24 h。將產(chǎn)物加入適量石油醚產(chǎn)生白色沉淀，真空干燥48 h，得白色粉末為琥珀?；S生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(succinyl-D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate, STPGS)。精密稱取PLGA 200 mg(0.005 mmol)和適量的STPGS(0.005 mmol)于燒瓶中，加適量二甲基甲酰胺(dimethyl formamide, DMF)溶解。用甲烷磺酸為催化劑，90 ℃反應(yīng)24 h。將產(chǎn)物加入適量無水乙醇得到白色沉淀，并用純化水反復(fù)洗至無反應(yīng)物和溶劑殘留，冷凍干燥24 h，得白色粉末PLGA-STPGS(合成過程見圖1)。

1.5PLGA-STPGS的表征精密稱取PLGA、TPGS與PLGA-STPGS各1 mg，分別用溴化鉀100 mg壓片，用FTIR法測(cè)定產(chǎn)物的紅外光譜；同時(shí)以氘代氯仿(Chloroform-d, CDCl3)為溶劑測(cè)定3種聚合物的氫核磁共振譜(1H-nuclear magnetic resonance,1H-NMR)來確定產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)；采用GPC法測(cè)定PLGA-STPGS的數(shù)均分子量和分子量分布，流動(dòng)相為四氫呋喃(tetrahydrofuran, THF)，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為50 μL[樣品濃度為0.1%(W/V)]。采用差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)評(píng)價(jià)3種聚合物的熱性能，量取3種樣品各5 mg置于鋁坩堝中，以10 ℃/min的速度將溫度從30 ℃逐漸升高到390 ℃進(jìn)行測(cè)定。

1.6納米粒的制備精密稱取PLGA和PLGA-STPGS各100 mg，EMO 30 mg，用適量乙酸乙酯使其全部溶解，滴加到120 mL 0.5 g/L的TPGS水溶液中，在150 W超聲條件下超聲4 min，形成乳濁液。再將乳濁液于室溫下600 r/min電動(dòng)攪拌24 h，充分揮發(fā)乙酸乙酯后20 000 r/min高速離心15 min，然后將沉淀物用適量去離子水反復(fù)洗至上清液無EMO殘留(將上清液吸出后滴加適量20 g/L的FeCl3水溶液至不顯色為止)，每次均用20 000 r/min高速離心15 min，所得沉淀物再用少量去離子水分散均勻后冷凍干燥24 h，得淡黃色EPN及EPTN，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。以PLGA-STPGS為載體，同法制得不含EMO的白色空白納米粒(blank PLGA-STPGS nanoparticles, BPTN)。

1.7納米粒的表征

1.7.1粒徑和ζ-電位的測(cè)定 稱取干燥好的EPTN、EPN適量，用25 g/L的磷鎢酸溶液進(jìn)行負(fù)染，置透射電鏡下觀察2種NPs的形態(tài)特征。另稱取干燥好的EPTN、EPN適量，超聲分散后形成納米?；鞈乙海眉す饬６葍x對(duì)其粒徑、粒徑分布和納米粒表面的ζ-電位進(jìn)行測(cè)定。

圖1PLGA-STPGS的合成途徑示意圖

Fig.1 Illustration of the synthesis of PLGA-STPGS copolymer

1.7.2EMO色譜條件的建立 色譜柱為Kromasil ODS1(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測(cè)波長為287 nm，流動(dòng)相為甲醇-0.5%冰乙酸溶液(90∶10)，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。分別精密稱取EMO原料藥、對(duì)照品、EPN和EPTN適量，EMO溶解于甲醇中，EPN及EPTN溶解于乙酸乙酯中后用氮?dú)獯蹈桑偌尤爰状既芙舛ㄈ葜?5 mL(質(zhì)量濃度為12 μg/mL)，取適量進(jìn)樣。反相高效液相色譜圖(reverse phase-high performance liquid chromatography, RP-HPLC)見圖2，EMO的保留時(shí)間約為14.0 min，在此條件下，理論板數(shù)以EMO計(jì)不低于2 000，分離度符合要求。

圖2大黃素反相高效液相色譜圖

Fig.2 RP-HPLC images of EMO

A：EMO對(duì)照品；B：EMO原料藥；C：EPTN；D：EPN。1：EMO。

1.7.3EMO標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取EMO對(duì)照品10 mg，以甲醇為溶劑配制濃度為500 μg/mL的EMO對(duì)照貯備液。依次從中精密量取60、120、240、480、960 μL至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得EMO系列對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為3.0、6.0、12.0、24.0、48.0 μg/mL)。按照1.7.2項(xiàng)下色譜條件，取EMO系列對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣3次，以峰面積(A)對(duì)濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=81.998 2C+54.568 1(r=1.000 0)。結(jié)果表明，EMO在3.0～48.0 μg/mL之間線性關(guān)系良好。

1.7.4載藥量和包封率的測(cè)定 精密稱取同一批號(hào)的EPN 2.1 mg和EPTN 1.4 mg各6份，按1.7.2項(xiàng)下操作，測(cè)定峰面積A，計(jì)算樣品中EMO含量，再根據(jù)以下公式(1)、公式(2)計(jì)算EPN和EPTN的DL和EE。

公式(1)

公式(2)

1.8誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的測(cè)定選取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度(5×105/mL)后用6孔板培養(yǎng)細(xì)胞24 h。細(xì)胞貼壁后，吸去各孔培養(yǎng)液，以5-氟尿嘧啶溶液(5-fluorouracil solution, FS, 20 μg/mL)為陽性對(duì)照組，分別加入EMO濃度為20 μg/mL的EPTN、EPN混懸液、材料濃度為72.5 μg/mL的BPTN混懸液(與EPTN混懸液中PLGA-STPGS濃度相同)和EMO溶液(emodin solution, EMS, 20 μg/mL)，各組藥物溶液均用無血清的H-DMEM培養(yǎng)基溶解、納米粒均用無血清的H-DMEM培養(yǎng)基超聲分散均勻，每組3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、72 h后，分別收集每孔細(xì)胞并用冷的PBS緩沖液沖洗3次，重新分散在結(jié)合緩沖液(binding buffer)中使?jié)舛葹?×106/mL，按照試劑盒說明書操作，分別加入AnnexinV-FITC 5 μL和PI 5 μL，混勻，避光孵育20 min后，加入結(jié)合緩沖液400 μL，輕輕吹散細(xì)胞并用紗布過濾，立即用流式細(xì)胞分析儀分析細(xì)胞的凋亡特性。

將待測(cè)細(xì)胞接種于48孔板中(1×104/mL)并培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)分為陽性對(duì)照組(加入TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒配備的DNA內(nèi)切酶Ⅰ)、BPTN、FS組、EMS組、EPN和EPTN混懸液組，每組3個(gè)復(fù)孔，藥物濃度及處理方法同上。繼續(xù)培養(yǎng)24、72 h后，按照TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒說明書操作，37 ℃避光孵育30 min后，將所有孔內(nèi)液體吸走，用冷PBS洗3次，每次5 min。將500 ng/mL的4′，6-二咪基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI)100 μL加入到各孔細(xì)胞中，染色15 min。用PBS洗3次，每次5 min，立即在倒置熒光顯微鏡(fluorescence inversion microscope, FIM)下觀察各孔細(xì)胞的凋亡情況。

2 結(jié) 果

2.1PLGA-STPGS的表征由IR結(jié)果(圖3)可見，3種聚合物的主要吸收峰是在3 500～3 000 cm-1的OH鍵，在2 864～2 943 cm-1范圍是-CH2鍵引起的吸收。三者在1 724 cm-1處均有羰基吸收，但因PLGA與PLGA-STPGS分子中有較多的乳酸和羥基乙酸基團(tuán)，故羰基吸收峰強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于TPGS的羰基吸收。另外，三者在1 191 cm-1附近均有C-O引起的伸縮振動(dòng)峰，由FTIR光譜證明PLGA-STPGS是不同于PLGA和STPGS的新的共聚物。1H-NMR測(cè)定結(jié)果見圖4。信號(hào)5.15 ppm和1.52 ppm(峰b和e)分別是PLA片段中-CH和-CH3，4.75 ppm(峰c)是PGA片段中CH2質(zhì)子信號(hào)。3.78 ppm(峰d)是TPGS分子中聚氧乙烯片段上的-CH2信號(hào)。8.09(峰a)是聚乳酸片段中游離羧基-COOH上的質(zhì)子信號(hào)。1H-NMR譜中PLGA-STPGS的數(shù)均分子量可以用質(zhì)子信號(hào)分別在5.15(峰面積3.16)、4.75(峰面積6.44)和3.78 ppm(峰面積1.62)的峰面積比值進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果為24 114。PLGA和TPGS在整個(gè)聚合物中的比例分別為93.45%和6.55%。GPC測(cè)得PLGA-STPGS的數(shù)均分子量和分散度分別為25 347和1.42，與用1H-NMR測(cè)得的結(jié)果相似。PLGA和TPGS的熔融吸熱峰分別為316 ℃和45 ℃，而PLGA-STPGS的熔融吸熱峰為321 ℃(圖5)。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，PLGA-STPGS與PLGA、TPGS不同，是一個(gè)新合成的高分子材料。

2.2EMO納米粒的表征掃描電鏡測(cè)定結(jié)果見圖6，2種NPs均呈類球狀或球狀，表面圓整，且粒子大小均勻、粒子間分散無粘連。用激光粒度儀測(cè)定EPN的粒徑、多分散系數(shù)(polydispersity index, PDI)、ζ-電位和DL、EE結(jié)果見表1。結(jié)果表明，以自制材料PLGA-STPGS為載體制備的EPTN比用市售材料PLGA制備的EPN粒徑更小、分布更均勻，具有更大的DL和EE(P<0.05)。

圖3PLGA、TPGS與PLGA-STPGS的IR圖

Fig.3 FTIR spectra of PLGA, TPGS and PLGA-STPGS copolymer

2.3誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的情況

2.3.1Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測(cè)結(jié)果 流式結(jié)果如表2所示，F(xiàn)S組中細(xì)胞凋亡、壞死含量相對(duì)較低；而經(jīng)EMS和載EMO納米粒作用后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡率不斷增加，呈時(shí)間依賴性。與EMS相比，EMO納米粒誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡率更高，且EPTN的凋亡率大于EPN。細(xì)胞孵育24 h后，EPTN和EPN誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡率相比EMS的凋亡率(28.1%)分別提高了19.1%(P=0.042)和13.5%(P=0.046)，且相比FS的凋亡率(17.8%)分別提高了29.4%(P=0.029)和23.8%(P=0.031)；72 h后，EPTN和EPN誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡率相比EMS的凋亡率(30.9%)分別提高了31.5%(P=0.008)和21.2%(P=0.013)，且比FS的凋亡率分別提高了42.3%(P=0.006)和32.0%(P=0.009)。而空白納米粒BPTN組與陰性對(duì)照組相似，當(dāng)HepG2細(xì)胞與BPTN共同孵育24、72 h后，細(xì)胞的存活率均在97%以上，表明本研究中自制的高分子材料PLGA-STPGS對(duì)HepG2細(xì)胞無明顯毒性和誘導(dǎo)其凋亡的作用。

圖4PLGA、TPGS與PLGA-STPGS的1H-NMR圖

Fig.41H-NMR spectra of PLGA, TPGS and PLGA-STPGS copolymer

2.3.2TUNEL試劑盒檢測(cè)結(jié)果 以FS為對(duì)照，用TUNEL原位凋亡試劑盒檢測(cè)2種NPs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的結(jié)果如圖7所示。陽性對(duì)照組中所有細(xì)胞核均被TUNEL標(biāo)記呈綠色熒光，同時(shí)被DAPI標(biāo)記呈藍(lán)色熒光。與對(duì)照組相比，其他組細(xì)胞核均被DAPI標(biāo)記呈藍(lán)色熒光，但是其中只有凋亡的細(xì)胞核被TUNEL標(biāo)記呈綠色熒光，而未凋亡的細(xì)胞核在該條件下不呈現(xiàn)綠色熒光。與EMS組相比，EMO納米粒組中有更多的細(xì)胞核被TUNEL標(biāo)記呈綠色熒光，EPTN組中細(xì)胞核被標(biāo)記的最多。明場(chǎng)下觀察，凋亡的HepG2細(xì)胞體積變小、形狀變圓，部分核膜破裂。同樣空白納米粒BPTN組與HepG2細(xì)胞共同孵育24、72 h后，每孔中幾乎觀察不到被TUNEL標(biāo)記的呈綠色熒光的細(xì)胞核，表明本研究中自制的高分子材料PLGA-STPGS對(duì)HepG2細(xì)胞無明顯毒性和誘導(dǎo)其凋亡的作用。

圖5PLGA、TPGS和PLGA-STPGS的DSC熱吸收?qǐng)D

Fig.5 DSC heating thermographs of PLGA, TPGS and PLGA-STPGS copolymer

圖6大黃素納米粒的透射電鏡圖

Fig.6 TEM images of EMO-loaded NPs (×200 000)

A：EPN；B：EPTN。

表1EGPN和EPN的表征

表2AnnexinV-FITC/PI試劑盒檢測(cè)HepG2細(xì)胞與BPTN、FS、EMS、EPN和EPTN孵育24h和72h后的凋亡結(jié)果

組別孵育時(shí)間(h)細(xì)胞比例(%)存活細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死細(xì)胞陰性對(duì)照組2497.9±1.91.8±0.60.3±1.07295.1±1.82.3±0.82.6±1.2BPTN組2498.2±1.20.8±0.41.0±0.57297.1±1.31.2±0.61.7±1.1FS組2458.9±3.017.8±1.323.3±2.47245.6±2.820.1±1.734.3±1.4EMS組2465.4±2.728.1±1.46.5±1.37258.3±2.730.9±1.810.8±1.3EPN組2450.8±2.441.6±2.2ac7.6±0.97237.5±2.352.1±2.6bc10.4±1.0EPTN組2446.7±2.2a47.2±2.1ac6.1±1.77224.9±2.2b62.4±2.6bd12.7±1.0

與相應(yīng)的FS組比較，aP<0.05、bP<0.01；與相應(yīng)的EMS組比較，cP<0.05、dP<0.01。

3 討 論

本研究采用酯化方法直接以市售材料PLGA和TPGS為原料合成PLGA-STPGS，方法簡(jiǎn)單、成本低，所用的催化劑DMAP和甲烷磺酸催化效率高，中間體STPGS水溶性較好，故選擇極性非常小的石油醚做沉淀劑能直接將其沉淀出來，PLGA-STPGS相對(duì)脂溶性較強(qiáng)，不溶于水和乙醇，而用無水乙醇做沉淀劑也能將其直接沉淀出來，所得產(chǎn)物產(chǎn)率高(83.9%)、純度好。

多項(xiàng)研究證實(shí)，EMO能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[11-14]，尤其是在肝癌治療中，EMO具有廣譜的抗肝癌活性，能影響肝癌細(xì)胞的多種相關(guān)基因，能明顯誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡[15]。本研究采用2種方法定量、定性地考察在誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡試驗(yàn)中，自制材料制備的EPTN是否具有比EMS和EPN更好的效果。通過預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)濃度大于20 μg/mL的EMO在48、72 h時(shí)引起HepG2細(xì)胞的壞死率較高，凋亡細(xì)胞較少，而EMO濃度低時(shí)，細(xì)胞存活率較高，均不利于試驗(yàn)結(jié)果的觀察，故確定本研究的藥物濃度為20 μg/mL。圖7顯示，載EMO納米粒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率高于EMS(呈綠色熒光的細(xì)胞核更多)，這是因?yàn)榧{米粒能被HepG2細(xì)胞直接攝取進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，不需要生物膜的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，故能有大量的納米粒進(jìn)入細(xì)胞并在溶酶體的作用下釋放出EMO，使其更好的發(fā)揮誘導(dǎo)HepG2凋亡的作用。同時(shí)，Annexinv-FITC/FI與TUNEL檢測(cè)結(jié)果均顯示EPTN有更高的細(xì)胞凋亡率，這是因?yàn)镋PTN粒徑更小、更容易被HepG2細(xì)胞攝取、進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的EPTN更多，EPTN載藥量更大，所用材料PLGA-STPGS中TPGS具有良好的水溶性，隨著材料本身在細(xì)胞內(nèi)的降解，TPGS還可加快PLGA-STPGS的溶解，使EPTN中的EMO釋放的更快、更完全，進(jìn)而使更多的EMO在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮藥效。結(jié)果表明，本研究成功地合成了新的高分子材料PLGA-STPGS，并用定量、定性等方法證明了以PLGA-STPGS為載體制備的納米粒EPTN能在體外誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生更高的凋亡率。

圖7TUNEL試劑盒檢測(cè)HepG2細(xì)胞與陽性對(duì)照、BPTN、FS、EMS、EPN和EPTN孵育24h和72h后的凋亡效果

Fig.7 Apoptosis of HepG2 cells induced by positive control, BPTN, FS, EMS, EPN and EPTN after 24 h and 72 h of incubation timeinvitrousing TUNEL Apoptosis Detection Kit (×400)