在慢阻肺炎癥反應(yīng)中黃芪多糖的抗炎作用及 抑制TLR4/NF-κB通路的機(jī)制

吳 佳，堯雪洲

(1. 長(zhǎng)沙民政職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410004；2. 云南中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心，云南昆明 650500)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)屬于慢性呼吸系統(tǒng)疾病[1-2]，臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性氣流受限。近年研究顯示，我國(guó)COPD的發(fā)病率與死亡率逐年升高，每年引發(fā)百萬(wàn)人死亡[3-4]。COPD的本質(zhì)是肺部的慢性炎癥反應(yīng)，主要病理表現(xiàn)是慢性支氣管炎與肺氣腫[5]。目前，COPD的治療藥物主要是糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid)、抗生素、β2受體激動(dòng)劑等，主要作用是緩解急性期癥狀，長(zhǎng)期使用后部分患者會(huì)出現(xiàn)糖皮質(zhì)激素抵抗[6]，仍缺乏能有效治療肺部炎癥反應(yīng)的藥物。研究表明，Toll樣受體(TLR)存在于人體內(nèi)多種炎癥細(xì)胞表面，參與天然免疫和獲得性免疫，與氣道的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[7]。其中TLR4可以激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，啟動(dòng)炎性IL-1β的表達(dá)，引起炎性細(xì)胞的活化和炎性介質(zhì)的釋放，促進(jìn)炎癥因子的分泌[8]。肺泡巨噬細(xì)胞(AM)由單核細(xì)胞分化，在肺臟發(fā)揮吞噬、免疫和分泌的作用。正常情況下，AM具有抑炎作用, 當(dāng)組織損傷時(shí)，AM可以起到促炎作用以維持組織穩(wěn)態(tài)[9]，外周血單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞是AM研究的可替代模型[10]。黃芪多糖(APS)是一種具有生物活性的水溶性多糖，從中藥黃芪的根莖中提取，參與體細(xì)胞免疫，具有增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞活性及抑制細(xì)胞分泌炎癥因子的作用[11-12]，減少組織細(xì)胞的損傷。本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)COPD患者的外周血單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞，觀察不同濃度的APS對(duì)巨噬細(xì)胞中TLR4/NF-κB通路的影響，闡述其與慢性炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要儀器及試劑酶標(biāo)儀(奧地利Anthosht公司)，超凈工作臺(tái)(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)，Medisoft Hypair M prov02(比利時(shí)麥迪公司)，高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)，肺功能測(cè)定儀(日本Chest)，CO2培育箱(Heraeus公司)，APS(惠州市東方植物保健科技有限公司)，SH30809.01 RPMI 1640培養(yǎng)液(Hyclone)，胎牛血清(Life Technology公司)，藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD14單克隆抗體(法國(guó)Immunotech公司)，總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(深圳?；锟萍脊?，基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9, MMP-9)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、白介素-6(interleukin- 6，IL-6)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(上海滬尚)。

1.2資料來(lái)源根據(jù)《慢性阻塞性肺疾病診治指南》(2017年修訂版) 診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]，選擇2017年3月-6月在長(zhǎng)沙民政職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院校企合作醫(yī)院呼吸科門診就診的COPD穩(wěn)定期男性患者19例，年齡(60.7±8.3)歲；另外選取同期體檢男性健康志愿者20例，年齡(59.3±8.4)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：非器官功能性障礙、腫瘤及精神疾病患者。所有對(duì)象均無(wú)過(guò)敏史、近2周內(nèi)無(wú)上呼吸道感染史。研究方案經(jīng)所在醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有受試者自愿加入并簽署知情同意書。

1.3肺功能檢測(cè)使用肺功能重復(fù)3次測(cè)量?jī)x測(cè)量受試者的第1秒用力呼氣容積(FEV1)和用力肺活量(FVC)，獲得平均值并計(jì)算FEV1/FVC和FEV1下降程度(占預(yù)計(jì)值%)。

1.4外周血中單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定清晨抽取受試者外周靜脈血4 mL置于抗凝管內(nèi)，F(xiàn)icoll梯度離心法獲得單核細(xì)胞(PBMC)[14]，調(diào)整密度為2×106/mL后加入RPMI 1640培養(yǎng)液并接種在6孔板中，37 ℃與50 mL/L CO2環(huán)境下培養(yǎng)2 h，待細(xì)胞貼壁后，在每孔中加入10 ng/mL rhGM-CSF完全培養(yǎng)基，共培養(yǎng)6 d。在第1天和第6天，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期非處理單核細(xì)胞，PBS洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，采用PE標(biāo)記的CD14抗體，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)5組細(xì)胞表面分化抗原CD14的表達(dá)情況，并計(jì)算陽(yáng)性率[15]。

1.5實(shí)驗(yàn)分組將分離培養(yǎng)的COPD患者外周血單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞進(jìn)行分組。LPS組：在培養(yǎng)基中加入5 μg/mL LPS[16]；APS高濃度組：同時(shí)加入APS(200 μg/mL)和LPS(5 μg/mL)；APS低濃度組：同時(shí)加入LPS(5 μg/mL)和APS(50 μg/mL)共同干預(yù)24 h；COPD組及健康對(duì)照組：不用藥物在原有環(huán)境下培養(yǎng)24 h。各組干預(yù)后收集細(xì)胞及上清液分別用于TLR4/NF-κB通路和炎癥因子指標(biāo)檢測(cè)。

1.6ELISA法測(cè)定IL-6、MMP-9、TNF-α、PGE2含量提前1 d將―80 ℃凍存的各組細(xì)胞上清液置于4 ℃，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天從4 ℃冰箱中取出，將IL-6、MMP-9、TNF-α、PGE2試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞上清液置于室溫中平衡20 min，根據(jù)說(shuō)明書的操作步驟檢測(cè)各個(gè)待測(cè)指標(biāo)A值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得樣品中各炎癥因子的含量。

1.7熒光定量PCR檢測(cè)TLR4、NF-κBmRNA表達(dá)按照Trizol試劑說(shuō)明書要求提取單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞內(nèi)總RNA并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用RT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。所有引物(表1)均由杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)公司合成。結(jié)果采用2-△△Ct相對(duì)定量分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1引物序列

Tab.1 Primer sequences

基因引物序列(5'-3')TLR4F-ATAAGTGTCGAACTCCCTCR-GCTCATTCCTTACCCAGTNF-κBF-TGCACCTAGCTGCCAAAGAAR-TCTGCTCCTGCTGCTTTGAGAGAPDHF-AATGCATCCTGCCACCACCAACTGCR-GGAGGCCATGTAGTAGGCCATGAGGTC

2 結(jié) 果

2.1肺功能檢測(cè)結(jié)果與健康志愿者比較，COPD患者FEV1/FVC與FEV1占預(yù)計(jì)值百分比均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2兩組研究對(duì)象肺功能的比較

與健康對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2單核細(xì)胞分化、分離及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)1 d，COPD組部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁，細(xì)胞體積仍然較小，培養(yǎng)到第6天時(shí)，細(xì)胞貼壁牢固，體積明顯增大，最大的細(xì)胞直徑可達(dá)40 μm，細(xì)胞形狀從不規(guī)則形逐漸變成橢圓形，少數(shù)細(xì)胞為長(zhǎng)梭形(圖1)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果(圖2)顯示，培養(yǎng)1 d細(xì)胞表面CD14陽(yáng)性率為(2.35±1.8)%，培養(yǎng)6 d的CD14陽(yáng)性細(xì)胞為(8.2±3.2)%。提示單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。

圖1倒置相差顯微鏡下COPD組單核細(xì)胞(A)與單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞(B)

Fig.1 The inverted microscope imaging of mononuclear cells (A) and monocyte-derived macrophages (B) in COPD group (×200)

圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)COPD組單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞在培養(yǎng)1d及6d的CD14表達(dá)情況

Fig.2 CD14 expression of 1 d and 6 d in cultured monocyte-derived macrophage cell (detected by flow cytometry) in COPD group

2.3ELISA法檢測(cè)炎癥因子的含量及比較與健康對(duì)照組比較，COPD組中炎癥因子(IL-6、MMP-9、TNF-α、PGE2)含量明顯升高(P<0.05)；LPS組4個(gè)炎癥因子的含量均高于COPD組(P<0.05)；與LPS組比較，APS組中炎癥因子含量明顯下調(diào)(P<0.05)，而且APS高濃度組下調(diào)幅度更大(P<0.05，表3)。

表3各組炎癥因子含量的比較

Tab.3 Comparison of the contents of inflammatory factors in each group

組別TNF-α(pg/mL)IL-6(pg/mL)MMP-9(ng/mL)PGE2(ng/mL)COPD組104.97±1.46*46.22±0.64*4.83±0.41*18.42±0.43*健康對(duì)照組0.41±0.08#25.10±0.64#1.71±0.23#7.72±0.3#LPS組219.63±1.30*#217.41±0.94*#17.88±0.19*#74.18±0.35*#APS高濃度組117.40±0.65△37.48±0.61△8.97±0.37△36.73±0.71△APS低濃度組166.59±1.11△151.61±0.97△14.35±0.54△58.46±1.02△

與健康對(duì)照組比較，*P<0.05；與COPD組比較，#P<0.05；與LPS組比較，△P<0.05。

2.4熒光定量PCR檢測(cè)各組中TLR4、NF-κBmRNA表達(dá)與健康對(duì)照組比較，COPD組TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)增加(P<0.05)；與COPD組相比，LPS組TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)升高(P<0.05)；APS組中TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)比LPS組顯著下降(P<0.01)，且高濃度組下降更明顯(P<0.05，表4)。

表4熒光定量PCR檢測(cè)各組中TLR4、NF-κBmRNA的表達(dá)

Tab.4 q-PCR detection of TLR4 and NF-κB mRNA expressions in each group

組別TLR4NF-κBCOPD組1.72±0.18*2.07±1.31*健康對(duì)照組0.24±0.02#0.41±0.08#LPS組4.18±2.34*#3.93±2.51*#APS高濃度組1.95±0.81△2.33±0.75△APS低濃度組3.77±0.43△3.60±0.24△

與健康對(duì)照組比較，*P<0.05；與COPD組比較，#P<0.05；與LPS組比較，△P<0.05。

3 討 論

COPD患者的氣道和肺實(shí)質(zhì)存在多種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)類型與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，TLR4參與COPD的病理過(guò)程和免疫應(yīng)答[17-18]。NF-κB是TLR4信號(hào)下游重要的核轉(zhuǎn)錄激活因子，TLR4與配體結(jié)合后引發(fā)多種下游效應(yīng)[19-20]，活化NF-κB并促進(jìn)白介素等炎癥因子的分泌，使粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞產(chǎn)生趨化聚集效應(yīng)，導(dǎo)致急性炎癥反應(yīng)。LPS存在于革蘭陰性菌細(xì)胞壁中，可以導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，在肺能引起炎癥細(xì)胞積聚，以中性粒細(xì)胞為主，其結(jié)合TLR4可促使p38MAPK、NF-κB等分子活化而誘導(dǎo)MMP-9的過(guò)度表達(dá)[21]，并分泌TNF-α、MCP-1、IL-6等。與既往研究結(jié)果相同的是，本研究COPD組細(xì)胞中炎癥因子的含量均高于健康對(duì)照組，說(shuō)明在肺部炎癥反應(yīng)中，巨噬細(xì)胞有參與其中，LPS可以通過(guò)激活平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)[22]。LPS刺激后，巨噬細(xì)胞中的TLR4、NF-κB的mRNA和炎癥因子IL-6、TNF-α、PGE2均明顯增加，提示LPS刺激通過(guò)TLR4/NF-κB通路釋放大量炎癥介質(zhì)或細(xì)胞因子，加重炎癥反應(yīng)。

《中國(guó)藥典》2015年版記載黃芪是一味具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、利水消腫等功效的常用中藥，是臨床中重用的補(bǔ)氣藥之一。黃芪被廣泛用于高血壓、糖尿病、腎病綜合征等疾病的臨床治療。COPD屬于中醫(yī)咳嗽、痰飲、喘癥的繼發(fā)之病[23]，外邪入侵和內(nèi)傷襲肺是中醫(yī)理論中肺病的主要病機(jī)，肺主呼吸，朝百脈，匯聚氣血。氣虛、血淤是引發(fā)肺病的重要病理基礎(chǔ)，肺氣虧虛是病機(jī)之本。APS是黃芪中的主要成分之一，近年來(lái)受到越來(lái)越多的研究者關(guān)注，被應(yīng)用于肝纖維化、糖尿病、抗氧化等方面的研究[24-27]，但少見(jiàn)有關(guān)APS用于治療肺部疾病的研究報(bào)道。本研究應(yīng)用APS與LPS共同刺激COPD患者外周血單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞，結(jié)果顯示APS干預(yù)后減輕了LPS刺激細(xì)胞內(nèi)TNF-α、PGE2表達(dá)，并且APS高劑量組效果最為明顯，提示APS對(duì)COPD患者的巨噬細(xì)胞具有保護(hù)作用，起到調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用。MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，水解后可降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)和組織連接蛋白的活性[28]引起氣道的炎癥反應(yīng)。NF-κB可以調(diào)控MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平,細(xì)胞未受刺激時(shí)，NF-κB的抑制蛋白IκBα處于穩(wěn)定狀態(tài),細(xì)胞遇到刺激后，IκBα被降解，NF-κB被激活后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控MMP-9 mRNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程[29]，本研究結(jié)果顯示，APS對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)有明顯抑制作用，MMP-9含量隨APS濃度增加而降低，提示APS可以通過(guò)TLR4/NF-κB通路抑制MMP-9的生成，抑制ECM的降解，使肺泡壁間隔增厚減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，起到保護(hù)血管壁防止血管過(guò)度擴(kuò)張，防止纖維化形成的作用，從而改善患者肺功能。TNF-α是一種參與全身炎癥反應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)蛋白，僅在血液中存在，廣泛存在于包括神經(jīng)組織在內(nèi)的多種組織中。TNF-α可引起肺組織內(nèi)溶酶體受損[30]，損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞，NF-κB通過(guò)上調(diào)細(xì)胞環(huán)氧化酶2的活性和表達(dá)[31]，引起炎癥因子PGE2的合成增加，促進(jìn)炎性反應(yīng)。本研究表明APS處理可以降低TNF-α、PGE2水平，推測(cè)APS可能對(duì)肺泡細(xì)胞起到修復(fù)作用，改善血管內(nèi)皮功能。

目前，對(duì)肺損傷疾病的中藥治療藥物的研究正成為藥理學(xué)的研究熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了APS在COPD炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制，APS可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)而發(fā)揮抗炎作用，促進(jìn)肺組織的修復(fù)。