重度子癇前期血清對滋養(yǎng)細胞中 組織因子的表達及甲基化的影響

馬 強，劉 睿，徐 娜，田改彥，王雯娟，王慰敏

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院周圍血管科，陜西西安 710061；2. 南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山市 婦幼保健院婦科，廣東佛山 528000；3. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710061)

重度子癇前期為孕產(chǎn)婦常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，表現(xiàn)為高血壓、蛋白尿和其他全身系統(tǒng)性的功能紊亂，死亡率高達15%，是國內(nèi)及全球范圍內(nèi)引起孕產(chǎn)婦死亡的第二大病因[1]。在我國“二孩”政策開放后，隨著高齡孕產(chǎn)婦基數(shù)的增加，重度子癇前期的發(fā)病率亦有上升趨勢[2]。國內(nèi)外諸多研究表明，妊娠期凝血功能異常導(dǎo)致的自身炎癥-免疫通路激活可能通過損傷血管內(nèi)皮細胞誘發(fā)重度子癇前期的發(fā)生[3-5]。組織因子(tissue factor, TF)是維持機體正常凝血功能的主要糖蛋白，且與孕早期滋養(yǎng)細胞的增殖分化及胎盤的形成密切相關(guān)[6]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者胎盤中TF DNA啟動子區(qū)域甲基化程度下調(diào)引起的蛋白表達增加在子癇前期的發(fā)病過程中起重要作用[7]，主要從組織學(xué)水平證實了TF啟動子區(qū)域甲基化程度與蛋白表達的相關(guān)性，尚缺乏細胞分子學(xué)水平的證據(jù)。因此，本研究擬在前期研究結(jié)論的基礎(chǔ)上，探究重度子癇前期患者血清對滋養(yǎng)細胞HTR8/SVneo中TF的表達及其甲基化程度的影響。

1 對象與方法

1.1研究對象選擇2017年1月1日至6月31日在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科就診行剖宮產(chǎn)手術(shù)的孕婦，15名診斷為重度子癇前期妊娠孕婦為病例組，15名身體健康、足月妊娠孕婦為對照組。病例組平均年齡(28.25±4.13)歲，平均孕周(33.5±2.4)周；對照組平均年齡(26.32±3.57)歲，平均孕周(38.1±0.5)周。兩組患者年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，病例組分娩時平均孕周小于對照組，存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。所有研究對象均為自然妊娠的單胎孕婦，否認(rèn)既往原發(fā)性慢性高血壓病、肝腎疾病及其他內(nèi)外科合并癥病史，否認(rèn)胎死宮內(nèi)、胎兒染色體異常病史。對照組剖宮產(chǎn)指征均為相對頭盆不稱。排除吸煙、酗酒、輔助生殖技術(shù)受孕者等所有可能影響到孕婦甲基化的因素[7]。重度子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)參照人民衛(wèi)生出版社出版的《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版[8]。本研究獲得西安交通大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，所有患者均充分知情并簽署知情同意書。

1.2標(biāo)本采集與處理收集孕婦剖宮產(chǎn)術(shù)前1日內(nèi)外周血10 mL，置無菌離心管，37 ℃孵育2 h，2 500 r/min 離心40 min，收集上清液成分后用DMSO液凍存，置-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

俗話說：巧婦難為無米之炊。不帶武器上戰(zhàn)場，那就是直接做炮灰。怎么促讀？怎么了解學(xué)生知識儲備與運用情況？考！學(xué)生最在意的是分?jǐn)?shù)，教師直接劃定范圍，明確告知考試范圍，促進學(xué)生積極記憶。筆者年段以考促讀的內(nèi)容有：必修5本書的教材梳理，《語文基礎(chǔ)知識手冊》，各種典型題型以及典型母題之下的各種子題，還有各位老師整理的專題作文素材，如自由與規(guī)則哲學(xué)類的，十九大報告時事類的，等等。

其次，創(chuàng)新管理機制。管理機制創(chuàng)新是指通過創(chuàng)新激勵機制、懲罰機制、培訓(xùn)機制和競爭機制，進一步完善科研管理體制，完善科研評價體系，從而激勵農(nóng)業(yè)科技人員投身科研。不斷創(chuàng)新管理機制，尋求科學(xué)、自動化和系統(tǒng)的管理。

VR（Virtual Reality，簡稱VR）即虛擬現(xiàn)實，是一項以計算機技術(shù)為核心的綜合集成技術(shù)，涉及3D圖形技術(shù)、多媒體技術(shù)、仿真技術(shù)、傳感技術(shù)、立體顯示等高新技術(shù)。利用計算機和其他設(shè)備（輸入/輸出設(shè)備）營造集視覺、聽覺、觸覺等多感官于一體的三維虛擬世界。VR圖書是將虛擬現(xiàn)實技術(shù)與傳統(tǒng)的科教讀物相結(jié)合，讓用戶在虛擬環(huán)境中體驗身臨其境的感受，能夠突破空間、時間以及其它客觀限制，帶給讀者穿越的樂趣和眼見為實的交互式體驗，是一種接觸式、沉浸式的閱讀新方式。具有代表性的VR圖書有北京少年兒童出版社出版的《恐龍世界大冒險》叢書，海天出版社的《童喜樂魔幻互動百科》系列等。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)資料進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例(或率)表示，用Fisher確切概率法進行檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3細胞培養(yǎng)及處理將永生化的人滋養(yǎng)細胞系HTR8/SVneo細胞從液氮中取出復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、50 mL/L CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育。將胰蛋白酶消化培養(yǎng)成功的滋養(yǎng)細胞，置于放有載玻片的24孔板中。分別向每個24孔板中加入濃度為20%的重度子癇前期和正常妊娠女性血清，在細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。孵育后的細胞置于培養(yǎng)箱中備用。

1.6HTR8/SVneo細胞中TFBSP甲基化測定以血液/細胞基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)提取重度子癇前期病例組和對照組HTR8/SVneo細胞基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度儀定量后，取2 μg DNA溶于去離子水中，加入10 μL新鮮配制的3 mmol/L氫氧化鈉，37 ℃水浴40 min。模板上游引物序列5′-GAGGTAATTTAAAAGG-GTTGGAT-3′，下游引物序列5′-CCATCAATATA-CCAATCCAAAAC-3′，產(chǎn)物長度為389 bp。然后進行PCR擴增，擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進行35個循環(huán)，末端延伸72 ℃ 5 min。割膠回收BSP產(chǎn)物，選用pMD19T作為載體進行連接，進一步轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌后進行篩選、擴菌，提取質(zhì)粒DNA后進行BSP測序。由西安東澳生物科技有限公司完成對所構(gòu)建載體的測序。

1.5HTR8/SVneo細胞中TFmRNA表達的測定分別收集經(jīng)過重度子癇前期及正常妊娠血清處理后的HTR8/SVneo細胞，采用Trizol法提取兩組細胞中總的RNA，應(yīng)用紫外分光光度計測定其純度及濃度，參照Takara RNA PCR Kit(大連寶生物科技有限公司)試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄。將提出的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA放于-80 ℃冰箱備用。內(nèi)參β-actin上游引物序列為5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游引物序列 5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。TF上游引物序列5′-TTCCTAAGCCTCCGGGATGT-3′，下游引物序列5′-CCGGGCTGTCTGTACTCTTC-3′；按照熒光定量PCR試劑盒反應(yīng)說明書配制反應(yīng)體系，將RNase-free H2O作為陰性對照組代替cDNA模板，加樣至96孔板中，上Real-time PCR儀反應(yīng)，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃，10 min 1個循環(huán)；PCR反應(yīng)：95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s共35個循環(huán)。根據(jù)擴增曲線可得到擴增產(chǎn)物達到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct)，采用ΔΔCt的相對值分析兩組細胞中TF mRNA的相對表達量。ΔΔCt法：A=Ct(目的基因，待測樣本)-Ct(內(nèi)標(biāo)基因，待測樣本)，B=Ct(目的基因，對照樣本)-Ct(內(nèi)標(biāo)基因，對照樣本)，K=A-B，表達倍數(shù)=2-K來表示測定結(jié)果。

1.4HTR8/SVneo細胞中TF蛋白表達的測定分別提取兩組經(jīng)過血清加氧處理后HTR8/SVneo細胞系中的總蛋白。用含PMSF的裂解液在冰上裂解30 min，BCA法測定蛋白濃度后-80 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ?00 μg總蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、雜交，PVDF膜上滴加化學(xué)發(fā)光底物后，暗室內(nèi)曝光顯影，膠片晾干后拍照，使用Image J測灰度值，以目的蛋白條帶與GAPDH條帶灰度值比值作為目的蛋白的相對表達水平。

2 結(jié) 果

2.1HTR8/SVneo細胞中TF蛋白的表達Western blot定量檢測發(fā)現(xiàn)，兩組HTR8/SVneo細胞中均有TF蛋白的表達，且兩組細胞中TF的表達水平組間比較存在差異，加入重度子癇前期組血清的細胞中TF蛋白表達量(0.932±0.039)顯著高于正常妊娠血清組[(0.517±0.041)，P<0.05，圖1]。

圖1HTR8/SVneo細胞中TF蛋白的表達

Fig.1 Expression of TF protein of HTR8/SVneo cells in the two groups

2.2HTR8/SVneo細胞中TFmRNA的表達qTPCR定量檢測發(fā)現(xiàn)，加入重度子癇前期組HTR8/SVneo細胞中TF mRNA相對含量(1.48±0.27)顯著高于加入正常妊娠血清組[(0.63±0.33)，P<0.05，圖2]。

2.3重度子癇前期血清對TF啟動子區(qū)域甲基化的影響B(tài)SP測序結(jié)果顯示，加入重度子癇前期血清的HTR8/SVneo細胞單鏈DNA中胞嘧啶(C-)均變?yōu)樾叵汆奏?T-)，呈現(xiàn)出去甲基化狀態(tài)，未見藍峰(圖3A)；而加入正常妊娠女性血清的對照組HTR8/SVneo細胞中TF基因組DNA的胞嘧啶(C-)仍然存在，顯示其單鏈DNA中胞嘧啶呈甲基化狀態(tài)，可見藍峰(圖3B)。

子癇前期是指既往基礎(chǔ)血壓正常的妊娠期女性在妊娠20周后出現(xiàn)高血壓伴蛋白尿，為妊娠期特有疾病，與妊娠本身因素密切相關(guān)。我國子癇前期發(fā)病率約9.4%，死亡率約15%，居我國孕產(chǎn)婦死亡原因的第2位[1]。此外，子癇前期還是胎盤早剝、急性腎功能衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血和循環(huán)衰竭等圍產(chǎn)期致死性并發(fā)癥的重要誘因[5]。重度子癇前期對孕產(chǎn)婦及胎兒帶來的近遠期危害更是不可估量。近年來，盡管對子癇前期有了較為深入的認(rèn)識，但確切病因和發(fā)病機制尚未闡明。故探討子癇前期的發(fā)病機制及其預(yù)測與防治，具有極其重要的意義和價值。新近研究認(rèn)為，子癇前期是母體對妊娠的過度炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)使母胎界面免疫平衡失調(diào)，內(nèi)皮細胞受損，胎盤血管病變，滋養(yǎng)細胞氧化應(yīng)激、遷移受限與淺著床[4]。因此，炎癥反應(yīng)是子癇前期的重要病理基礎(chǔ)。

圖2病例組與對照組HTR8/SVneo細胞中TFmRNA的表達

Fig.2 Expression of TF mRNA of HTR8/SVneo cells in the case and control groups

3 討 論

圖6和圖7顯示了隧道開挖不進行支護時，隧道圍巖的變形其力學(xué)特征的計算結(jié)果。水平位移圖6(a)顯示，圍巖開挖后負(fù)方向位移最大負(fù)值為3 mm，且主要發(fā)生在仰拱區(qū)域，而正方向位移最大正值為18 mm，主要出現(xiàn)在第二條控制性結(jié)構(gòu)面以外的區(qū)域；從圖6(b)看出，在開挖X負(fù)向的位移沿第二條控制性結(jié)構(gòu)面外側(cè)發(fā)展，位移則出現(xiàn)在其內(nèi)側(cè)，拱頂外位移量最大；X正向位移出現(xiàn)在仰拱外。由圖6(c)可知，總位移量最大也是出現(xiàn)在第二條結(jié)構(gòu)面外側(cè)和仰拱處。從圖6(d)可以看出，隧道開挖后的位移矢量方向是指向隧道體，尤其是第2條結(jié)構(gòu)面以外巖體的位移矢量方向更加明顯，矢量最大值出現(xiàn)在第1條結(jié)構(gòu)面以外巖體的拱頂位置。

子癇前期炎癥過度激活，造成血管內(nèi)皮細胞功能紊亂后會導(dǎo)致人體凝血功能的改變，以其損傷后TF大量表達和外源性凝血途徑激活最為顯著[3]。TF作為各種內(nèi)源性及外源性凝血途徑中的多能性調(diào)控蛋白，在子癇前期的發(fā)病過程中起重要作用[7]，且國內(nèi)外已有相關(guān)研究證實，組織學(xué)或血清學(xué)水平中TF表達失衡與子癇前期的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但具體機制尚不明確。近期研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(xué)方面的調(diào)控諸如DNA甲基化、RNA甲基化，在平衡機體外周循環(huán)中TF的長期穩(wěn)定方面有較為重要的意義[7]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，人蛻膜自然殺傷細胞受體中TF的穩(wěn)定表達要求建立在DNA甲基化基礎(chǔ)上的表觀遺傳學(xué)修飾[9]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，重度子癇前期患者胎盤中TF蛋白表達含量、mRNA水平均顯著高于正常妊娠女性，而其甲基化程度則呈現(xiàn)下降趨勢，且與蛋白表達水平呈統(tǒng)計學(xué)負(fù)相關(guān)，由此推測重度子癇前期患者胎盤中TF DNA啟動子區(qū)域甲基化程度下調(diào)是導(dǎo)致其蛋白表達升高的主要機制之一[7]。但是，我們前期研究及國內(nèi)外其他學(xué)者對TF和子癇前期發(fā)生之間的研究均局限于組織學(xué)方面，尚缺乏分子細胞水平的深入研究；且我們前期研究中采用的甲基化技術(shù)為PCR特異性的甲基化(MSP)，僅作為定性研究方法，并非甲基化的金標(biāo)準(zhǔn)。故本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，從組織學(xué)水平進一步深入分子細胞學(xué)水平，將重度子癇前期妊娠孕婦外周血清加入滋養(yǎng)細胞中，觀察其對組織因子的表達及其甲基化狀態(tài)的影響。本研究采用了甲基化的金標(biāo)準(zhǔn)[10]——重亞硫酸鹽的測序法(BSP)研究細胞中TF啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，較MSP更加準(zhǔn)確且靈敏，有更強的說服力。

圖3重度子癇前期血清與正常妊娠血清干預(yù)后TF在細胞基因組中DNABSP測序結(jié)果

Fig.3 BSP DNA sequencing result of TF in HTR8/SVneo cells between the case and control groups

A：病例組；B：對照組。

本研究結(jié)果顯示，加入重度子癇前期患者血清的HTR8/SVneo細胞中，TF蛋白的表達和mRNA的表達均顯著高于加入正常妊娠血清組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這一點與我們前期在胎盤組織學(xué)水平的研究結(jié)果相一致[7]。此外，我們在細胞學(xué)水平研究亦發(fā)現(xiàn)，在加入重度子癇前期患者血清的HTR8/SVneo細胞中，BSP測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)TF單鏈DNA上的胞嘧啶消失，取而代之的是胸腺嘧啶，而加入正常妊娠血清的細胞中仍可檢測到胞嘧啶，說明仍存在甲基化狀態(tài)，而重度子癇前期血清使TF DNA發(fā)生了去甲基化，這也進一步從細胞分子水平驗證了我們前期的推測，并且與胎盤組織表觀遺傳學(xué)的結(jié)論相吻合。李蘊潛等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，TF過表達會通過增加IL-4、IL-6、IL-8和MMP炎性因子的水平造成妊娠滋養(yǎng)細胞的功能異常，抑制滋養(yǎng)細胞的侵襲能力。當(dāng)妊娠滋養(yǎng)細胞侵襲能力不足時，便會造成“胎盤淺著床”，使子宮螺旋動脈重鑄不足，造成母-胎界面免疫失衡，繼而誘發(fā)子癇前期的發(fā)生和進展[8]。

本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步從分子細胞學(xué)水平探究了TF表觀遺傳學(xué)相關(guān)因素在重度子癇前期發(fā)病過程中的重要作用，較為詳細地證實了組織因子啟動子區(qū)域DNA甲基化水平下調(diào)對妊娠滋養(yǎng)細胞中TF表達的影響。這為進一步從表觀遺傳學(xué)角度預(yù)測重度子癇前期的發(fā)生以及相關(guān)靶向藥物的研究提供了理論基礎(chǔ)。下一步將通過尋找影響子癇前期患者TF甲基化調(diào)控的通路來深入研究造成其表觀遺傳學(xué)異常的可能機制。