吸煙者外周血單個核細胞差異表達 miRNA與mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

黨曉敏，曲曉艷，尚 東，楊 嵐，王維嘉，李 瑩，李飛燕，常 穎

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，陜西西安 710061； 2. 西安交通大學(xué)前沿科學(xué)與技術(shù)研究院，生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，陜西西安 710054)

吸煙與多種疾病密切相關(guān)，包括多部位惡性腫瘤、呼吸系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病、生殖和發(fā)育異常、糖尿病等[1]。研究表明，吸煙可影響免疫細胞功能[2]。微小RNA (microRNAs, miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小為20～25個核苷酸。通過與靶基因的3′ UTR區(qū)結(jié)合，miRNA能夠抑制蛋白質(zhì)翻譯或降解mRNA，并可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄子和DNA甲基化來影響基因表達[3]，從而參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等，而且在多種疾病中起著關(guān)鍵的作用，如癌癥、病毒感染和肺部炎癥性疾病等[4]。目前鮮有針對吸煙者miRNA表達譜的研究。本研究將利用高通量基因芯片手段檢測非吸煙者和健康吸煙者外周血單個核細胞中miRNA和mRNA表達譜，并對差異表達的miRNA與mRNA之間的靶向關(guān)系進行預(yù)測分析，探討其相關(guān)信號通路。

1 材料與方法

1.1研究對象從西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心獲得20名健康非吸煙者及17名健康吸煙者的外周靜脈血。其臨床指標如表1所示。志愿者均簽署了相關(guān)協(xié)議，體檢無癌癥、糖尿病、心血管疾病和高血壓等，無過敏史，近1月內(nèi)無呼吸道感染病史，無皮質(zhì)類固醇激素用藥史。

表1非吸煙者與吸煙者的臨床相關(guān)指標

臨床指標非吸煙者吸煙者人數(shù)(n)2017年齡(歲)61.3±14.656.6±17.1男性/女性(n/n)12/817/0當(dāng)前/曾經(jīng)吸煙者(n/n)014/3吸煙量(包年)023.9±3.7BD后 FEV 1%預(yù)計值101.0±8.692.9±9.0

BD：支氣管舒張劑；FEV1：1 s用力呼氣量。

1.2主要試劑及儀器Ficoll-Paque PLUS試劑(GE Healthcare公司)；QIAzol裂解液、miRNeasy Mini Kit提取試劑盒(Qiagen公司)；Affymetrix GeneChip miRNA Array v.4.0、Affymetrix GeneChip?Scanner 3000(Affymetrix公司)；Agilent Human Gene Expression Microarray V4.0、Agilent Microarray Scanner System (Aligent公司)。

1.3RNA樣本制備及基因芯片檢測通過密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(peripheral mononuclear cells, PBMC)，利用miRNeasy Mini Kit試劑盒提取細胞總RNA，分別將非吸煙組和吸煙組中各RNA樣本以等量RNA混合，用于基因芯片檢測。委托北京博奧生物公司進行檢測，分別采用Affymetrix GeneChip miRNA Array v.4.0和Agilent Human Gene Expression Microarray V4.0系統(tǒng)檢測miRNA和mRNA表達譜。其中miRNA芯片包含30 424條探針，可檢測2 588條人成熟miRNA。

1.4數(shù)據(jù)分析應(yīng)用GeneSpring V11.5軟件(Agilent公司)進行數(shù)據(jù)分析，表達差異大于2倍為候選基因，經(jīng)Benjamini-Hochberg校正P閾值為0.05。應(yīng)用TargetScan數(shù)據(jù)庫對差異表達的miRNA靶基因進行預(yù)測，通過Cytoscape軟件繪制調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。通過Panther Classification System(http://pantherdb.org/)進行GO富集分析。

2 結(jié) 果

2.1吸煙者PBMC的miRNA差異表達對非吸煙者和吸煙者PBMC的miRNA表達譜進行分析(圖1)，差異倍數(shù)大于2且熒光值差異在500以上的共有14條miRNA表達水平上調(diào)，5條下調(diào)(表2)。

表2吸煙者中差異表達的miRNA

Tab.2 Dysregulated miRNAs in the smokers

上調(diào)miRNA倍數(shù)hsa-miR-1273g-3p29.51hsa-miR-806915.35hsa-miR-150-5p14.57hsa-let-7b-5p11.89hsa-miR-448810.56hsa-miR-320b9.33hsa-miR-191-5p8.60hsa-miR-60886.80hsa-miR-28615.50hsa-miR-44664.65hsa-miR-1915-3p4.60hsa-miR-36563.85hsa-miR-77043.62hsa-miR-31962.07下調(diào)miRNA倍數(shù)hsa-miR-45300.27hsa-miR-6743-5p0.19hsa-miR-80750.10hsa-miR-6732-5p0.08hsa-miR-6750-5p0.04

2.2吸煙者mRNA差異表達對非吸煙者和吸煙者PBMC的mRNA表達譜進行分析(圖2)，差異倍數(shù)大于2且熒光值差異在500以上的共有206個mRNA表達水平上調(diào)，190個下調(diào)，表3中列出了位于前10位上調(diào)和下調(diào)表達的基因。

2.3吸煙者PBMC中差異表達的miRNA與mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用TargetScan數(shù)據(jù)庫對吸煙者PBMC中差異表達的miRNA靶基因進行預(yù)測，繪制miRNA對mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(圖3、圖4)。

圖1非吸煙者和吸煙者PBMC的miRNA表達譜

Fig.1 miRNA profile of non-smokers and smokers

A：層次聚類圖像；B：散點圖，紅色和綠色分別代表增高和降低的miRNA。

圖2非吸煙者和吸煙者PBMC的mRNA表達譜

Fig.2 mRNA profile of non-smokers and smokers

A：層次聚類圖像；B：散點圖，紅色和綠色分別代表增高和降低的mRNA。

2.4吸煙者PBMC差異表達基因GO富集分析對吸煙者PBMC差異表達基因的GO富集分析結(jié)果表明，核酸結(jié)合(nucleic acid binding)、信號分子(signaling molecule)、酶調(diào)節(jié)蛋白(enzyme modulator)、水解酶(hydrolase)、轉(zhuǎn)移酶(transferase)、轉(zhuǎn)運蛋白(transporter)、轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)是主要的蛋白分類(圖5)。對通路的富集分析表明，血小板來源生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)信號通路、膽囊收縮素受體(cholecystokinin receptor, CCKR)信號通路、T細胞活化(T cell activation)和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)信號通路是主要的信號通路(圖5)。其中富集涵蓋的差異表達基因和相關(guān)miRNA見表4。

表3吸煙者中差異表達的mRNA

Tab.3 Dysregulated mRNAs in the smokers

基因名 稱倍數(shù)吸煙者/非吸煙者功 能上調(diào) CRISP2半胱氨酸豐富分泌蛋白2 4.06細胞外區(qū)域 LY96淋巴細胞抗原963.63脂多糖受體活力;Toll樣受體信號(MyD88依賴和非依賴) MT1G金屬硫蛋白-1G3.48單核細胞分化;血管內(nèi)皮細胞生長因子應(yīng)答 CD9CD9分子2.80血小板脫顆粒;細胞膜 LTF乳鐵傳遞蛋白2.61鐵轉(zhuǎn)運 ANKFY1錨蛋白重復(fù)序列和FYVE結(jié)構(gòu)域12.50內(nèi)涵體;細胞內(nèi)包膜細胞器;金屬離子結(jié)合 PIGYY型磷脂酰肌醇聚糖2.49內(nèi)質(zhì)網(wǎng) CD46CD46分子,補體調(diào)節(jié)蛋白2.47細胞膜;補體激活 MT1E金屬硫蛋白1 E2.44金屬離子結(jié)合;細胞生長負調(diào)節(jié) UBA3泛素樣修飾激活酶32.43ATP結(jié)合;蛋白質(zhì)修飾;細胞周期;蛋白質(zhì)水解下調(diào) ATP13A3ATP酶13A3-8.43核酸結(jié)合;ATP結(jié)合;陽離子結(jié)合;ATP酶活性 PPP1R18蛋白磷酸酶1,調(diào)節(jié)亞型18-5.65肌動蛋白結(jié)合;細胞質(zhì);細胞骨架 RHBGRh家族,B糖蛋白-5.51銨跨膜轉(zhuǎn)運體;細胞膜;細胞骨架 SARDH肌氨酸脫氫酶-5.20氨基甲基轉(zhuǎn)移酶活性;線粒體 ZNF157鋅指蛋白157-4.92RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄負調(diào)節(jié);DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性 FTHL17鐵蛋白,重多肽17-4.86鐵離子轉(zhuǎn)運,氧化還原酶活性 PKD1多囊腎病1(常染色體顯性)-4.33胚胎發(fā)育;細胞周期阻滯 FLG絲聚蛋白-4.22鈣離子結(jié)合;囊泡;中間絲 TERF2IP端粒重復(fù)序列結(jié)合因子2,相互作用蛋白-3.94端粒;NF-?B通路正調(diào)控 VPS4B液泡蛋白分選4同源物(釀酒酵母)-3.92核內(nèi)體;細胞分裂

圖3吸煙者PBMC上調(diào)表達的miRNA對下調(diào)表達的mRNA的調(diào)控作用

Fig.3 The regulation of up-regulated miRNAs on down-regulated mRNAs in PBMCs of the smokers

圖4吸煙者PBMC下調(diào)表達的miRNA對上調(diào)表達的mRNA的調(diào)控作用

Fig.4 The regulation of down-regulated miRNAs on up-regulated mRNAs in the smokers’ PBMCs

圖5吸煙者PBMC差異表達mRNA的GO富集分析

Fig.5 The GO enrichment analysis of dysregulated mRNAs in the smokers’ PBMCs

表4吸煙者中差異表達的mRNA的GO富集分析

Tab.4 The GO enrichment analysis of dysregulated mRNAs in the smokers’ PBMCs

分類名稱涵蓋差異表達mRNA相關(guān)差異表達miRNA蛋白分類 nucleic acid binding核酸結(jié)合KLF13; TATDN2; CLIC4; KDM1B;SSRP1; BRD2miR-1273g-3p; -4488; -320b; -6088; -2861; -4466; -1915-3p; -8069; -3656; -8075; - 6750-5p; - 3196 enzyme modulator酶調(diào)節(jié)蛋白ARHGEF18; VAV3; PKD1;ARHGAP9; CASP8miR-1273g-3p; -4488; -1915-3p; -3196; let-7b-5p; miR-4466; -3656 hydrolase水解酶PLAU; MPPE1; LTF; CASP8; GNSmiR-2861; 6750-5p; -4530; -1273g-3p; -4488; -8069; let-7b-5p; miR-320b; -6088; -4466; -7704 transferase轉(zhuǎn)移酶PIP4K2A; CS; CLIC4; BRD2miR-3196; -4488; -1915-3p; -8075; -1915-3p; -3196 transcription factor轉(zhuǎn)錄因子KDM6B; KLF13; SSRP1; RRN3miR-4466; -7704; -1273g-3p; -4488; -320b; -6088; -2861; -4466; -1915-3p; -1273g-3p transporter轉(zhuǎn)運蛋白PKD1; GRIK2; NUP88miR-4466; -1915-3p; -3656; let-7b-5p; miR-4488; -2861; -4530; -6750-5p信號通路 PDGF signaling pathway血小板來源生長因子信號通路VAV3; ARHGAP9miR-1915-3p; -1273g-3p; let-7b-5p; miR-1915-3p CCKR signaling pathway膽囊收縮素受體信號通路PLAU; PKD1miR-1915-3p; -3656; -2861; -7704; -4466; -1915-3p T cell activationT細胞活化VAV3; HLA-DMBmiR-1273g-3p; let-7b-5p; miR-1915-3p; -1273g-3p EGFR signaling pathway表皮生長因子受體信號通路GAB3; PKD1miR-6750-5p; -8075; -3656; -7704; -4466; -1915-3p

3 討 論

吸煙與多種疾病密切相關(guān)。本研究應(yīng)用基因芯片高通量檢測技術(shù)對非吸煙者與吸煙者外周血單個核細胞的miRNA與mRNA表達進行了分析，發(fā)現(xiàn)了吸煙者中差異表達的miRNA與mRNA，并對其調(diào)控關(guān)系進行預(yù)測分析，經(jīng)GO富集分析表明差異表達基因中包括多類蛋白，并涉及多種信號通路。

本研究發(fā)現(xiàn)，吸煙者PBMC差異表達miRNA中，有多條miRNA被報道與疾病相關(guān)。miR-1273g-3p與肝硬化、糖尿病和腫瘤細胞遷移相關(guān)[5-7]；miR-4488在神經(jīng)上皮腫瘤中表達上調(diào)[8]；miR-320b與冠心病相關(guān)[9]；血清miR-2861水平在冠狀動脈硬化患者中增高[10]，而且miR-2861和miR-1915-3p在乳頭狀甲狀腺癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時表達增高[11-12]；結(jié)直腸癌患者的血清外泌體包裹的miR-8075水平降低，并可能參與了結(jié)直腸癌中的葡萄糖代謝[13]。提示吸煙可能通過引起相應(yīng)的miRNA水平失調(diào)，進而對一些疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。

對在吸煙者PBMC中表達失調(diào)的miRNA與mRNA進行靶向關(guān)系預(yù)測，隨后對相關(guān)基因進行GO富集分析，表明PDGF信號通路、CCKR信號通路、T細胞活化、EGFR信號通路是主要的信號通路。PDGF主要貯存于血小板顆粒，研究表明多種細胞可合成和分泌PDGF, 它是多種間質(zhì)細胞如成纖維細胞、血管平滑肌細胞、腎小球血管細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等的強促有絲分裂劑和趨化因子，PDGF受體過度表達與腎小球腎炎、肝硬化、肺纖維化、動脈粥樣硬化、血管病變、腫瘤等多種疾病相關(guān)[14-15]。在本研究中富集分析所涉及的PDGF信號通路蛋白包括VAV3和Rho GTP酶激活蛋白9(Rho GTPase activating protein 9，ARHGAP9)。Vav家族蛋白是Rho家族GTPase的鳥嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移因子，在維持細胞形態(tài)、細胞粘附、血管生成、免疫功能的調(diào)節(jié)和細胞分化等過程中發(fā)揮重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，VAV3的表達失調(diào)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，提示VAV3具有原癌基因的活性[16]。ARHGAP9在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲中起重要作用[17]。EGFR是ErbB家族成員之一，具有酪氨酸激酶活性，是一種重要的跨膜受體，EGFR被配體激活后調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子激活基因的轉(zhuǎn)錄，指導(dǎo)細胞遷移、粘附、增殖、分化、凋亡，且與腫瘤的形成、惡化密切相關(guān)[18-19]。本研究中與EGFR通路相關(guān)的是GAB3和多囊蛋白1(polycystin 1, PKD1)。GAB3為生長因子受體結(jié)合蛋白2的接頭蛋白，新近研究表明GAB3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中過表達并調(diào)控Akt活化和腫瘤細胞增殖。PKD1屬于多囊蛋白家族成員，參與細胞-細胞、細胞-基質(zhì)粘附和細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[20]。膽囊收縮素(cholecystokinin, CCK)是一種典型的腦腸肽，通過與其受體結(jié)合而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用，CCKR信號通路在消化道腫瘤中起重要作用[21]。T細胞活化則參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展，例如自身免疫性疾病、糖尿病、腫瘤等等。

綜上所述，本研究首次對吸煙者PBMC的miRNA和mRNA表達譜進行分析，并篩選出差異表達基因進行靶向預(yù)測及信號通路分析，表明吸煙可導(dǎo)致與腫瘤、冠心病、糖尿病等相關(guān)基因的表達失調(diào)，提示吸煙可能是疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。