缺血后處理對體外循環(huán)心臟瓣膜 置換患者心電圖的影響

王焰斌，崔 剛，黃志勇，劉志紅，郭建洲，張 銳，楊建安

(1. 廣東省深圳市孫逸仙心血管醫(yī)院麻醉科，廣東深圳 518057；2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理系，陜西西安 710061； 3. 廣東省深圳市孫逸仙心血管醫(yī)院心外科，廣東深圳 518057)

體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass, CPB)心臟直視手術(shù)將不可避免發(fā)生心肌缺血再灌注損傷(MIRI)，其重要表現(xiàn)是再灌注心律失常，如室早(ventricular premature beat, VPB)、室速(ventricular tachycardia, VT)、室顫(ventricular fibrillation, VF)等，影響患者預(yù)后，探討其有效的防治措施具有重要的臨床意義。心肌缺血后處理(I-postC)是一種通過在再灌注之前或早期多次短暫阻斷再灌注血流而實(shí)現(xiàn)的時間敏感性心臟保護(hù)措施。I-postC在生物體不同種屬間具有廣泛性、相似性和非特異性。動物實(shí)驗(yàn)表明，I-postC可減輕MIRI，減輕再灌注心律失常的發(fā)生和不良影響[1-3]，但臨床保護(hù)效果有待進(jìn)一步評估，尤其對CPB下心臟瓣膜置換患者是否有減輕再灌注心律失常的作用及機(jī)制有待探討。本研究觀察了I-postC對CPB下心臟瓣膜置換術(shù)患者心電圖的影響。

1 資料與方法

1.1病例選擇深圳市孫逸仙心血管醫(yī)院心血管外科擇期CPB下行心臟瓣膜置換術(shù)患者40例，性別不限，年齡21～59歲，心功能HYHA分級Ⅱ或Ⅲ級，ASA分級Ⅱ或Ⅲ級，無心臟手術(shù)史和糖尿病病史，肝腎功能未見異常，左室射血分?jǐn)?shù)≥40%，術(shù)前2周未使用抗凝及抗血小板藥物，術(shù)前10 d內(nèi)未使用營養(yǎng)心肌的藥物，術(shù)前1周內(nèi)未服用激素、鈣離子拮抗劑、ATP敏感性鉀通道開放劑、腎上腺能受體激動劑等可產(chǎn)生預(yù)處理效應(yīng)的藥物。本研究已獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并與患者簽署知情同意書。

1.2麻醉與體外循環(huán)方法術(shù)前禁飲、禁食8 h。麻醉前30 min肌肉注射嗎啡1.0～1.5 mg/kg和東莨菪堿0.006 mg/kg。入室后連接ntellivue MP60多功能檢測儀(Philips公司，荷蘭)，心電圖用Ⅱ?qū)?lián)+改良胸導(dǎo)聯(lián)(CM)連接監(jiān)測，開放外周靜脈通路，局麻下行橈動脈穿刺置管，用于監(jiān)測有創(chuàng)動脈壓。依次靜脈注射依托咪酯0.3 mg/kg、芬太尼4～6 μg/kg和羅庫溴銨1 mg/kg進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)，氣管內(nèi)插管后行機(jī)械通氣，吸入700 mL/L氧氣，氧流量2 L/min，通氣頻率10～12次/min，潮氣量8～10 mL/kg，吸呼比1∶2，維持PETCO235～45 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。于右側(cè)頸內(nèi)靜脈穿刺，置入三腔中心靜脈導(dǎo)管，以供靜脈輸液及監(jiān)測中心靜脈壓。麻醉維持：靜脈輸注芬太尼1～3 μg/(kg·min)(總量30～50 μg/kg)、異丙酚1.5～3.0 mg/(kg·h)、羅庫溴銨0.05～0.20 mg/(kg·h)或順阿曲庫銨0.8～2.0 μg/(kg·h)。

CPB前后維持平均動脈壓(MAP)70～90 mmHg，CPB期間維持MAP 50～80 mmHg，主動脈阻斷前維持心率(HR)60～100次/min，主動脈開放后維持HR 70～100次/min。CPB前后維持中心靜脈壓(CVP)9～12 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)，氣道壓峰≤20 cmH2O。術(shù)中靜脈輸注乳酸鈉林格氏液、聚明膠肽、紅細(xì)胞懸液和新鮮冰凍血漿，并酌情給予阿托品、多巴胺和去氧腎上腺素等血管活性藥物，以維持血液動力學(xué)穩(wěn)定。根據(jù)動脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果及時糾正酸堿平衡和電解質(zhì)紊亂，以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡。CPB采用Stockert-Ⅲ型體外循環(huán)機(jī)(Maquet公司，德國)，西京膜式氧合器。預(yù)充乳酸鈉林格氏液、聚明膠肽和50 g/L NaHCO3。CPB前靜脈注射肝素400 U/kg，使活化凝血時間(activated coagulation time, ACT)>480 s；采用4∶1高鉀含血冷停搏液經(jīng)主動脈根部順行間斷灌注以保護(hù)心肌。CPB期間維持鼻咽溫度30～32 ℃。

1.3分組與I-postC方法采用隨機(jī)數(shù)字表法，將所選病例40例分為2組(n=20)：對照組(C組)和I-postC組(P組)。C組在升主動脈開放前不施行I-postC。P組參考文獻(xiàn)[3-4]中采用的方法行I-postC，于升主動脈完全開放前5 min時，先松開主動脈鉗夾30 s，再夾閉30 s，連續(xù)3個循環(huán)，然后完全松開主動脈鉗夾。

1.4心電圖觀測方法分別于麻醉誘導(dǎo)后術(shù)前(T1)、心臟復(fù)跳時(T2)與主動脈開放10 min(T3)、30 min(T4)、45 min(T5)以及術(shù)終(T6)和術(shù)后12 h(T7)、24 h(T8)記錄患者心電圖的變化，記錄心電圖Ⅱ?qū)?lián)+改良胸導(dǎo)聯(lián)(CM)ST-T抬高或下移幅度的總合值∑ST-T。再灌注室性心律失常(ventricular arrhythmias, VA)評分參照Curtis-Walker標(biāo)準(zhǔn)[5]：心律失常以VPB、VT、VF等室性心律失常為主；評分標(biāo)準(zhǔn)如下：無VA或有<5次的VPB，記0分；僅有≥5次的VPB，記1分；僅有一陣<60 s VT，記2分；有一陣≥60 s，或多陣?yán)塾?60 s的VT，記3分；多陣VT累計≥60 s記4分；出現(xiàn)VF，記5分；出現(xiàn)持續(xù)5 min以上的VF或在觀察期間死亡，記6分。

1.5心肌標(biāo)本采集于T5時取右心耳心肌組織約200 mg，其中100 mg于―80 ℃冷凍保存?zhèn)溆?，進(jìn)行Western blot檢測；剩余100 mg以40 g/L多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，片厚4 μm，采用免疫組化法測定Bcl-2、Bax表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況。

1.6Westernblot檢測Akt、p-Akt、Cyto-C、Caspase-9的表達(dá)將心肌組織低溫研磨后，加入蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑，提取上清總蛋白。Bradford法蛋白定量，常規(guī)電泳轉(zhuǎn)膜，加入一抗兔抗人Akt、P-Akt、細(xì)胞色素C(cytochrome C, Cyto-C)、Caspase-9多克隆抗體(稀釋比1∶500，Santa Cruz公司，美國)，內(nèi)參為兔抗人β-actin多克隆抗體(稀釋比1∶500，北京博奧森生物技術(shù)公司)，4 ℃孵育過夜，反復(fù)洗膜，然后將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(稀釋比1∶5 000，北京博奧森生物技術(shù)公司)孵育，用化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(Millipore公司，美國)將信號曝光于膠片上，采用Quantity-Onesoftware 4.6.2圖像分析軟件(Bio-Rad公司，美國)進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值反映目的蛋白表達(dá)水平。

1.7SABC法測定Bcl-2和Bax的表達(dá)取石蠟切片，分別加入兔抗人Bcl-2和Bax多克隆抗體(稀釋比1∶600，Santa Cruz公司，美國)和即用型山羊抗兔免疫組化SABC試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，β-actin作為內(nèi)參，DAB顯色。選擇3張切片，每張切片隨機(jī)選擇5個視野，采用Image-Pro Plus 5.1.0.20圖像分析軟件(Media Cybernetics公司，美國)進(jìn)行分析，取5個視野的平均值，并計算 Bcl-2和Bax表達(dá)的比值(Bcl-2/Bax)，以目的蛋白條帶平均吸光度值與β-actin平均吸光度值的比值反映Bcl-2和Bax的相對表達(dá)水平。

1.8TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡情況取石蠟切片，按細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Roche公司，瑞士)說明進(jìn)行操作。采用Image-ProPlus5.1.0.20圖像分析軟件進(jìn)行分析，每張切片隨機(jī)采集10個不重疊的視野，取10個視野的平均值。計算每100個細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)百分比即凋亡指數(shù)(AI)。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者一般情況的比較兩組患者的一般資料各指標(biāo)、CPB時間、主動脈阻斷時間及手術(shù)時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1兩組患者一般資料及術(shù)中各指標(biāo)的比較

Tab.1 Comparison of general data in the two groups

(n=20)

MVR為二尖瓣置換術(shù)，AVR為主動脈瓣置換術(shù)，MVR+AVR為二尖瓣置換術(shù)聯(lián)合主動脈瓣置換術(shù)。

2.2兩組患者心電圖的變化

2.2.1兩組患者再灌注心律失常評分的比較 與C組比較，P組T2～T8等時點(diǎn)再灌注心律失常(VPB、VT、VF)的發(fā)生率減少，室性心律失常評分減少，∑ST-T抬高或下移幅度減小(P<0.05，表2)。

表2兩組患者心律失常發(fā)生率及室性心律失常評分的比較

Tab.2 Comparison of the incidence of arrhythmia and ventricular arrhythmia score in the two groups (n=20)

與C組比較，*P<0.001(P=0.000 399)。

2.2.2兩組患者∑ST-T的變化 與T1時比較，兩組T2與T3、T4、T5以及T6和T7、T8等時點(diǎn)T2-8∑ST-T抬高或下移幅度增大(P<0.05)；與C組比較，P組T2～T8等時點(diǎn)∑ST-T抬高或下移幅度減小(P<0.05，表3)。

2.3兩組患者Akt、p-Akt、Cyto-C與Caspase-9表達(dá)情況Western blot檢測結(jié)果顯示，兩組間Akt表達(dá)無明顯差異；與C組比較，P組心肌組織Cyto-C、Caspase-9表達(dá)下調(diào)，p-Akt表達(dá)上調(diào)(P<0.05，圖1)。

2.4兩組患者Bcl-2、Bax與Bcl-2/Bax比率表達(dá)與C組Bcl-2(3.1±1.2)、Bax(8.6±3.1)及Bcl-2/Bax比率(0.7±0.3)比較，P組心肌組織Bcl-2(6.2±3.4)表達(dá)上調(diào)，Bax(5.8±2.2)表達(dá)下調(diào)，Bcl-2/Bax比率(1.2±0.5)升高(P<0.05)。

2.5兩組患者心肌細(xì)胞凋亡的TUNEL染色結(jié)果與C組染色TUNEL陽性心肌細(xì)胞比較，P組棕色染色明顯減弱，凋亡指數(shù)AI(%)降低(P<0.05，圖2)。

表3兩組患者心電圖Ⅱ+CM5導(dǎo)聯(lián)∑ST-T的變化

與T1時比較，#P<0.05；與C組比較，*P<0.05。

圖1Westernblot檢測兩組患者心肌組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化

Fig.1 Western blot results of myocardial tissue in the two groups of patients

A：Cyto-C與Caspase-9的Western blot檢測結(jié)果；B：Akt與p-Akt 的Western blot檢測結(jié)果；C：兩組(n=20)Akt、p-Akt、Cyto-C及Caspase-9的表達(dá)水平比較。與C組比較，*P<0.05。

圖2TUNEL染色檢測兩組心肌細(xì)胞凋亡情況及比較

Fig.2 TUNEL staining results of cardiomyocyte apoptosis in the two groups

A、B：C組、P組患者心肌細(xì)胞凋亡的TUNEL染色結(jié)果(×400)；C：兩組(n=20)凋亡指數(shù)(AI)的比較。與C組比較，*P<0.05。

3 討 論

研究表明，在凋亡形成過程中，心肌細(xì)胞興奮性可能增加，甚至形成自動節(jié)律點(diǎn)，凋亡細(xì)胞形成散在的細(xì)胞群，當(dāng)正常的激動到達(dá)該處時發(fā)生異向性傳導(dǎo)[6]；凋亡可進(jìn)一步引起膜通道和離子泵的功能改變，出現(xiàn)心肌細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性降低，心肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂，尤其是細(xì)胞內(nèi)外K+空間分布的不均勻性；這些都增加了心肌電不穩(wěn)定性，導(dǎo)致心肌細(xì)胞應(yīng)激性及自律性增強(qiáng)，使折返易于形成，誘發(fā)心律失常[7]。嚴(yán)重的再灌注心律失常和顯著的∑ST-T改變是MIRI的顯著表現(xiàn)，∑ST-T移位的電生理基礎(chǔ)是正常組織和心肌缺血區(qū)之間出現(xiàn)了損傷電位差。這種電位差愈大，TQ-ST段移位越明顯，因而ST-T段抬高或者下移越明顯。

CPB下心內(nèi)直視手術(shù)中缺血再灌注及中性粒細(xì)胞激活可釋放活性氧自由基(ROS)，能夠降低線粒體膜電位(ΔΨm)，使線粒體轉(zhuǎn)換孔道(mPTP)開放，使得線粒體凋亡誘導(dǎo)通道(MACs)打開，導(dǎo)致凋亡誘導(dǎo)因子Cyto-C、凋亡蛋白活化因子(APAF1)、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)從線粒體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與procaspase-9形成凋亡復(fù)合體，激活Caspase-9，啟動線粒體凋亡級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[8-10]。當(dāng)mPTP或MACs打開時，可使ΔΨm降低或消失，呼吸鏈和氧化磷酸化解耦聯(lián)，ATP合成停止，細(xì)胞膜ATP依賴性鉀通道[the plasma membrane Adenosine triphosphate (ATP)-sensitive potassium，sarcKATP]持續(xù)激活，鉀離子外流，心肌細(xì)胞靜息膜電位負(fù)值變小，心室纖顫閾值降低，動作電位時程(APD)縮短，有效不應(yīng)期(ERP)縮短，導(dǎo)致折返性心律失常易于形成，增加室早、室速、室顫等快速性再灌注心律失常發(fā)生的可能性[8,11-12]。心肌細(xì)胞凋亡可形成心肌損傷，在正常心肌組織和損傷區(qū)域之間出現(xiàn)電位差，其電位差愈大，TQ-ST段移位越明顯，ST-T改變(上抬或下移)幅度愈大。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)能夠通過激活蛋白激酶B(Akt)抑制促凋亡蛋白Bax構(gòu)象改變，活化的Akt(p-Akt)可磷酸化糖原合成酶激酶3，通過抑制其激活，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開放，增加ΔΨm，抑制線粒體凋亡啟動[13-14]；活化的Akt(p-Akt)可促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，而Bcl-2存在于細(xì)胞線粒體外膜，可阻斷MACs開放，抑制Cyto-C、APAF1、AIF等從線粒體向細(xì)胞質(zhì)釋放，還可直接抑制caspase的激活[15-16]；Bcl-2與Bax的比值決定細(xì)胞凋亡程度[17]。

本研究結(jié)果表明，CPB下心內(nèi)直視手術(shù)中缺血再灌注可通過線粒體途徑導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，造成心肌損傷，導(dǎo)致T2～T8時點(diǎn)VPB、VT、VF等快速性再灌注心律失常出現(xiàn)(尤其C組的T2～T5時點(diǎn)最明顯)；與T1時點(diǎn)比較，由于心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的MIRI，使得在T2～T8時點(diǎn)的正常心肌與損傷區(qū)域之間出現(xiàn)電位差，表現(xiàn)為不同程度的ST-T改變(上抬或下移)，以C組最顯著。

本研究參考文獻(xiàn)[3-4]對P組患者進(jìn)行I-postC，即于升主動脈完全開放前5 min時，先松開主動脈鉗夾30 s，再夾閉30 s，連續(xù)3個循環(huán)，然后完全松開主動脈鉗夾。而本研究結(jié)果亦表明，與對照組比較，P組Cyto-C、Caspase-9、Bax明顯下調(diào)，p-Akt、Bcl-2明顯上調(diào)，凋亡指數(shù)AI降低；T2～T8時點(diǎn)VPB、VT、VF等快速性再灌注心律失常發(fā)生率明顯降低，T2～T8時點(diǎn)再灌注心律失常評分及∑ST-T 改變幅度明顯減小，均說明P組缺血/再灌注損傷的程度(臨床表現(xiàn)為再灌注心律失常)明顯低于C組，也說明所建立的I-postC臨床模型成功建立。

本研究結(jié)果提示，I-postC(I-postC)可抑制心肌線粒體凋亡，減輕CPB下心臟瓣膜置換術(shù)患者再灌注心律失常。有研究表明，I-postC可通過PI3K/Akt通路抑制心肌細(xì)胞凋亡，穩(wěn)定ΔΨm，抑制細(xì)胞膜ATP依賴性鉀通道(sarcKATP)激活，使心肌細(xì)胞靜息膜電位負(fù)值增大，使心室纖顫閾值升高，動作電位時程(APD)延長，并降低鈣超載，減少形成折返性心律失常的可能性[18-20]；保護(hù)冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞、改善細(xì)胞代謝與能量代謝，使心肌細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性增高[21-22]。推測，本研究中I-postC也可能通過上述機(jī)制產(chǎn)生心肌保護(hù)作用，降低再灌注心律失常的嚴(yán)重性，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。