miR-34a對(duì)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化的調(diào)控

王 亮，鐘 武，陳睦虎

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，四川瀘州 646000)

組織工程技術(shù)已成為骨缺損修復(fù)最有前途的治療方法之一[1-2]。人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose-derived stem cells, hASCs)作為間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的一個(gè)重要來源，在骨組織工程中受到廣泛關(guān)注[3-4]。但是，由于缺乏調(diào)控hASCs成骨分化途徑的相關(guān)技術(shù)，而限制了基于hASCs細(xì)胞治療的進(jìn)一步發(fā)展。

microRNA(miRNA, miR)是一類單鏈RNA分子，通過結(jié)合靶基因3′UTR，抑制靶基因翻譯或使其降解[5]。miRNA在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，包括胚胎干細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、形態(tài)發(fā)生以及癌變和血管生成[6-7]。最近的研究報(bào)道了幾種miRNA，例如miR-22、miR-100、miR-106a、miR-146a和miR-148b參與了干細(xì)胞的成骨分化[8-11]。而miRNA在骨髓MSCs成骨分化中的調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

RUNX2基因作為一種成骨相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)miR-34a通過調(diào)控RUNX2基因的表達(dá)而影響MSCs的增殖和成骨分化[12-13]。因此，本研究觀察miR-34a在體外和體內(nèi)對(duì)hASCs成骨分化的作用，并探討視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白2(retinoblastoma binding protein 2, RBP2)/RUNX2通路的作用，旨在揭示miR-34a在hASCs成骨分化中的作用機(jī)制，探討其能否作為未來骨再生治療的一個(gè)治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1主要試劑Opti-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自上海賽默飛世爾科技公司，骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基購(gòu)自蘇州賽業(yè)生物科技公司，cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技公司，Trizol試劑北京索萊寶科技有限公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)公司，茜素紅購(gòu)自南京南試化學(xué)試劑有限公司，RIPA裂解緩沖液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，兔抗人RBP2單克隆抗體、羊抗人P27單克隆抗體、羊抗人RNUX2單克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體為美國(guó)Sigma產(chǎn)品。

1.2hASCs分離和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)根據(jù)西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的制度指導(dǎo)進(jìn)行。脂肪組織是通過接受選擇性抽脂手術(shù)或其他腹部手術(shù)的捐贈(zèng)者獲得的，手術(shù)均經(jīng)過書面同意和批準(zhǔn)。捐贈(zèng)者年齡在19～45歲之間，并排除了惡性腫瘤和代謝性疾病者，研究包括來自不同捐獻(xiàn)者(2名男性和2名女性)的4份脂肪組織樣本，均在無菌條件下，小心移除纖維組織和血管后，共切取10 g脂肪組織，采用無菌PBS清洗以清除污染的碎片和紅細(xì)胞。從獲得的脂肪組織中分離hASCs，然后將hASCs以密度為2×106/L重新懸浮在12 mL正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，置于75 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至第3代，并用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.3miRNA轉(zhuǎn)染由廣州銳博生物科技公司合成miR-34a模擬物(miR-34a)、抑制劑(miR-34al)和陰性對(duì)照(miR-NC)。根據(jù)說明書要求，在終濃度為200 nmol/L的Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑中將合成物轉(zhuǎn)染到hASCs中。整個(gè)轉(zhuǎn)染過程在opti-mem培養(yǎng)基中進(jìn)行，并置于50 mL/L CO2的37 ℃濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染6 h。轉(zhuǎn)染后觀察并計(jì)算：轉(zhuǎn)染效率=綠色熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。轉(zhuǎn)染成功后，去除轉(zhuǎn)染工作液，更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行分化。

1.4體外成骨分化將hASCs細(xì)胞按2×105個(gè)/cm2接種在6孔板中，加入含有高糖的Dulbecco改良的Eagle’s培養(yǎng)基(H-DMEM)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，用骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)一步誘導(dǎo)分化，3 d更換1次骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。于骨誘導(dǎo)后的第6天取樣，后續(xù)進(jìn)行相關(guān)實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)和Western blot檢測(cè)；分別于骨誘導(dǎo)后的第6天和15天時(shí)，用ALP染色和茜素紅染色檢測(cè)鈣化情況和礦化基質(zhì)的產(chǎn)生。

1.5ALP染色和茜素紅染色測(cè)定ALP活性以評(píng)估成骨細(xì)胞表型。ALP染色根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。采用茜素紅染色檢測(cè)誘導(dǎo)后期的鈣化，用PBS洗滌24孔板中的細(xì)胞，在950 mL/L乙醇中固定10 min，用蒸餾水洗滌后加入茜素紅溶液(1 mL/L，pH 8.3)染色30 min。用水洗滌2次后進(jìn)行顯微鏡觀察。

1.6qRT-PCR分析使用Trizol試劑說明書，分別提取各組hASCs轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA，然后將RNA通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以miRNA-R為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s，60 ℃ 退火20 s，72 ℃延伸32 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。miRNA-R引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA，miR-34a引物序列：5′-ACACTCCAGCTGGGTAAAGTGCTTATAGTGCA。根據(jù)各組的平均Ct值，計(jì)算出每個(gè)目的基因相對(duì)于起始反應(yīng)的拷貝數(shù)。

1.7雙熒光素酶報(bào)告基因的構(gòu)建及雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)94 bp RBP2 3′UTR片段包含hsa-miR-34a及其突變片段的預(yù)期結(jié)合位點(diǎn)40 bp側(cè)翼序列和末端含有切割位點(diǎn)XbaⅠ(5′末端)和NotⅠ(3′末端)，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)，短延伸含有切割位點(diǎn)XbaⅠ(5′末端)和NotⅠ(3′末端)。構(gòu)建的質(zhì)粒分別被稱為P-RBP2-WT(RBP2-野生型)和P-RBP2-MUT(RBP2-突變型)。擴(kuò)增子用XbaⅠ和NotⅠ切割，并克隆到pRL-TK載體的海腎熒光素酶基因的XhoⅠ和NotⅠ切割位點(diǎn)之間。

使用Lipofectamine 2000試劑將每個(gè)載體以及100 ng pGL3和200 nmol/L miR-34a模擬物或miR-NC轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞，并使用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定海腎和螢火蟲螢光素酶活性。

表1RBP2的啟動(dòng)子引物設(shè)計(jì)序列

Tab.1 RBP2 promoter primer design sequence

基因Forward (5'-3')Reverse (5'-3')P-RBP2-WTctagaAGAAAATACTCGCACTTCCT-CAGAACCCTCTTTCTTGTTAACGGGTATCTTTTGTT-GGTGTGTTTTGCTCTTACATTACAGATAGACgcggccgcGTCTATCTGTAATGTAAGAG-CAAAACACACCAACAAAAGATACCCGTTAACAA-GAAAGAGGGTTCTGAGGAAGTGCGAGTATTTTCTtP-RBP2-MUTctagaAGAAAATACTCGCACTTCCT-CAGAACCCTCTTTCTTGTTACTTAAGCTCTTTTGTT-GGTGTGTTTTGCTCTTACATTACAATAGACgcggccgcGTCTATCTGTAATGTAAGAG-CAAAACACACCAACAAAAGAGCTTAAGTAACAA-GAAAGAGGGTTCTGAGGAAGTGCGAGTATTTTCTt

斜體下劃線：miR-34a結(jié)合位點(diǎn)和突變位點(diǎn)的序列。

1.8Westernblot檢測(cè)RBP2/RUNX2通路蛋白表達(dá)在冰上使用RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，并通過電泳將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。然后將膜在溶于TBS的50 g/L脫脂奶粉液中封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的RBP2單抗、1∶200稀釋的RNUX2單抗、1∶100稀釋的P27單抗和1∶2 000稀釋的β-actin單抗，4 ℃溫育過夜。洗膜3次，加入1∶1 000稀釋的抗兔或抗羊辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，使用化學(xué)發(fā)光ECL試劑檢測(cè)抗體和抗原復(fù)合物。

2 結(jié) 果

2.1hASCs成骨分化hASCs(圖1A)可被誘導(dǎo)成為成骨細(xì)胞(圖1B)，并且通過ALP染色證實(shí)為成骨細(xì)胞(圖1C)，茜素紅染色顯示存在基質(zhì)礦化(圖1D)。

圖1hASCs的形態(tài)及其成骨分化

Fig.1 The morphology of hASCs and their osteogenic differentiation (×40)

A：hASCs細(xì)胞形態(tài)；B：hASCs誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的形態(tài)；C：hASCs誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞第6天的ALP染色；D：hASCs誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞第15天的茜素紅染色。

2.2miR-34a對(duì)hASCs成骨分化的促進(jìn)作用轉(zhuǎn)染72 h后，通過倒置熒光顯微鏡觀察，結(jié)果顯示hASCs轉(zhuǎn)染效率為80%～90%(圖2)。qRT-PCR結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，在轉(zhuǎn)染第0、4、8和12天，miR-34a模擬物組細(xì)胞miR-34a表達(dá)顯著升高(P<0.05)，而miR-34a抑制劑組表達(dá)顯著下降(P<0.05，圖3)。

圖2倒置熒光顯微鏡觀察miR-34a轉(zhuǎn)染hASCs情況

Fig.2 miR-34a lentiviral transduction efficiency and effect (×200)

圖3miR-34a在hASCs成骨誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化

Fig.3 Expression of endogenous miR-34a during hASCs’ osteogenic induction

與miR-NC組比較，*P<0.05。

2.3通過miR-34a直接靶向RBP2miR-34a對(duì)RBP2表達(dá)影響的結(jié)果顯示，miR-34a模擬物組RBP2蛋白表達(dá)較miR-34a抑制劑組顯著降低(P<0.05，圖4)。通過RNA22預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-34a在RBP2 3′UTR中的結(jié)合位點(diǎn)(圖5A)。進(jìn)一步通過熒光素酶報(bào)告以確定miR-34a是否可以直接靶向這些位點(diǎn)，分析結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-34a顯著抑制含有野生型RBP2(P-RBP2-WT)的熒光素酶表達(dá)(P<0.05)，但對(duì)突變型RBP2(P-RBP2-MUT)組沒有影響(圖5B)。這表明miR-34a直接靶向RBP2。

圖4Westernblot檢測(cè)miR-34a對(duì)hASCs細(xì)胞中RBP2表達(dá)的影響

Fig.4 The effect of miR-34a on the expression of RBP2 in hASCs cells detected by Western blot

與miR-NC組相比，*P<0.05；與miR-34al組相比，#P<0.05。

圖5RBP2作為miR-34a的直接靶基因驗(yàn)證

Fig.5 Validation of RBP2 as a direct target gene of miR-34a

A：miR-34a部分結(jié)合到RBP2的3'UTR區(qū)域；B：在P-RBP2-WT或P-RBP2-MUT組中miR-34a模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性。與miR-NC組相比，*P<0.05。

2.4miR-34a對(duì)RUNX2的表達(dá)影響miR-34a模擬物RUNX2和P27蛋白表達(dá)高于miR-34a抑制劑組(P<0.05，圖6)。

圖6Westernblot檢測(cè)miR-34a對(duì)hASCs細(xì)胞RUNX2和P27表達(dá)的影響

Fig.6 Western blot analysis of miR-34a’s effect on RUNX2 and P27 expressions in hASCs cells

與miR-NC組相比，*P<0.05；與miR-34al組相比，#P<0.05。

3 討 論

miRNA治療已經(jīng)成為目前組織工程最具吸引力的研究領(lǐng)域之一[14-15]。最近，許多研究報(bào)道m(xù)iRNA是干細(xì)胞治療或分化的重要調(diào)節(jié)因子，數(shù)十種miRNAs已被證實(shí)為轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)的重要負(fù)調(diào)控因子或正調(diào)控因子，在成骨過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16-18]。本研究結(jié)果顯示，hASCs成骨分化中miR-34a的表達(dá)顯著增加，miR-34a模擬物對(duì)成骨分化具有明顯促進(jìn)作用，而miR-34a抑制劑則阻礙了成骨分化。這提示miR-34a可能對(duì)hASCs的成骨分化有正調(diào)控作用。

miR-34a在一些腫瘤組織中異常表達(dá)，并通過靶向不同的基因作為促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)劑[19-20]。本研究為探索miR-34a調(diào)控hASCs成骨分化的分子機(jī)制，采用RNA22預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)72個(gè)miRNAs與RBP2 mRNA的3′UTR結(jié)合折疊能，進(jìn)而篩選得到miR-34a具有與RBP2 mRNA的3′UTR結(jié)合的最大可能性(△G=-17.2 kcal/mol)。RBP2作為直接結(jié)合于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑成員P27的啟動(dòng)子，通過結(jié)合Cyclin-CDKs調(diào)控系統(tǒng)，抑制細(xì)胞周期從G1向S期的轉(zhuǎn)變[21]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制RBP2表達(dá)可促進(jìn)hASCs體內(nèi)外成骨。本研究結(jié)果顯示，miR-34a模擬物能促進(jìn)RBP2蛋白水平下調(diào)，而miR-34a抑制劑組的RBP2表達(dá)增高。同時(shí)，雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定顯示RBP2為miR-34a的直接靶標(biāo)。這有力表明在成骨分化期間RBP2受miR-34a調(diào)節(jié)。

了解干細(xì)胞成骨分化的調(diào)節(jié)機(jī)制是治療各種骨病的基礎(chǔ)。干細(xì)胞的成骨分化是涉及多個(gè)基因表達(dá)的級(jí)聯(lián)機(jī)制[22-24]。目前，關(guān)于成骨分化的調(diào)控研究主要基于轉(zhuǎn)錄因子。RUNX2是一種重要的成骨細(xì)胞譜系決定性轉(zhuǎn)錄因子，其誘導(dǎo)終末成骨分化所需的骨唾液蛋白(BSP)、OC、OSX和骨橋蛋白(OPN)的表達(dá)[25-27]。RUNX2對(duì)于成骨細(xì)胞分化和骨骼形態(tài)發(fā)生至關(guān)重要，研究表明成骨細(xì)胞分化主要與骨髓基質(zhì)細(xì)胞中RUNX2活性增加有關(guān)[28]。已證實(shí)，RUNX2是hADSCs成骨分化過程中miRNA過表達(dá)的靶基因，可能通過miRNA參與調(diào)節(jié)分化。本研究結(jié)果顯示，miR-34a模擬物組RUNX2和P27蛋白表達(dá)上調(diào)，提示miR-34a可以上調(diào)RUNX2的表達(dá)。

總之，miR-34a通過與靶基因RBP2結(jié)合在hASCs成骨分化中發(fā)揮重要作用。RBP2和miR-34a可以作為未來治療骨骼疾病的潛在治療靶點(diǎn)。