β2腎上腺素受體通過HIF-1α調(diào)控NNK誘導(dǎo)的 胰腺癌細(xì)胞進(jìn)展

沙煥臣，雷建軍，王 錚，段萬星，徐勤鴻，黎 韡，韓 亮，馬清涌，張 東

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西西安 710061)

4-甲基亞硝氨基-3-吡啶-1-丁酮(NNK)是一種較強(qiáng)的致癌物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)K-Ras突變及P53的失活，而這兩種基因的突變在肺癌及胰腺癌中非常普遍[1-2]。有研究顯示，NNK調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的多種過程，與β腎上腺素受體相關(guān)[3-5]，NNK可高效并特異地結(jié)合β2腎上腺素能受體(β2受體)，并激活其下游信號通路，促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展；其下游通路可能通過缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)來誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲。在本研究中，我們以胰腺癌細(xì)胞株MIA PaCa-2和BxPC-3作為受試細(xì)胞，研究NNK誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的具體機(jī)制，并揭示β2腎上腺素受體可能通過HIF-1α來介導(dǎo)NNK誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞增殖及侵襲。

1 材料與方法

1.1材料MIA PaCa-2和BxPC-3人胰腺癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命研究所。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。HIF-1α、VEGF和Cyclin D1抗體均購自Bioworld公司。β-actin抗體、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG二抗均購自北京中杉金橋公司。聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)、Transwell小室均購自Milliproe公司。HIF-1α shRNA和對照shRNA Control質(zhì)粒購自上海吉瑪公司，HIF-1α shRNA的有效序列是5′-CCACCACUGAUGAAUUAAATT-3′。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。Real-time PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司。實(shí)驗(yàn)分組：正常對照組(Control)，對照shRNA干擾組(sh-control)，HIF-1α shRNA干擾組(sh-HIF-1α)，NNK干預(yù)組(NNK)，NNK+對照shRNA干擾組(NNK+sh-control)，NNK+HIF-1α shRNA干擾組(NNK+sh-HIF-1α)，NNK+ICI 118551干預(yù)組(NNK+ICI 118551)，CoCl2+NNK+ ICI 118551干預(yù)組(CoCl2+NNK+ ICI 118551)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞株MIA PaCa-2和BxPC-3于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃ 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后消化細(xì)胞，按1∶6接種于6孔板后加600 μg/mL G418進(jìn)行轉(zhuǎn)染篩選，每2～3 d換液1次。14 d后，出現(xiàn)多個(gè)G418抗性的克隆，在熒光顯微鏡下可看到帶有綠色熒光蛋白GFP的陽性克隆。顯微鏡下取帶GFP的單個(gè)克隆移入24孔培養(yǎng)板，繼續(xù)G418維持培養(yǎng)，經(jīng)過4周可以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。

1.3Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞在各組處理?xiàng)l件下培養(yǎng)24 h。取100 μL預(yù)冷的DMEM與Matrigel 1∶1稀釋膠加到Transwell上層小室中，于37 ℃孵育6 h。收集各分組細(xì)胞按5×104/mL的密度100 μL接種于Transwell上層小室。含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基500 μL加入Transwell下層小室，置于37 ℃ 50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將膜取出固定10 min，1 g/L的結(jié)晶紫染色30 min后小心洗去。200倍放大倍數(shù)下隨機(jī)觀察并計(jì)10個(gè)視野內(nèi)穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)，照相記錄。重復(fù)3次。

1.4蛋白印記法(Westernblot)檢測蛋白表達(dá)選擇生長較好的細(xì)胞1×107個(gè)，經(jīng)蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜。50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h。加一抗稀釋液4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜后加入二抗稀釋液室溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光，暗室顯影。

1.5PCR檢測mRNA轉(zhuǎn)錄提取各分組細(xì)胞總RNA。取5μg按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板PCR擴(kuò)增HIF-1α。各基因引物序列：HIF-1α，上游5′-AAGTCTAGGGATGCAGCA-3′，下游5′-CAAGATCACCAGCATCATG-3′； GAPDH，上游5′-GTAAAGACCTCTATGCCATCA-3′，下游5′-GGACTCATCGTACTCCTGCT3-3′。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 s；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線條件：95 ℃15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。基因相對表達(dá)水平通過ΔΔCt法計(jì)算。

1.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期選擇生長良好的細(xì)胞1×106個(gè)，PBS清洗兩遍，4 ℃條件下運(yùn)用700 mL/L的乙醇固定24 h。在37 ℃條件下運(yùn)用碘化丙啶孵育30 min。上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，分析細(xì)胞周期。

2 結(jié) 果

2.1β2腎上腺素受體調(diào)控NNK誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)運(yùn)用sh-RNA干擾HIF-1α，Real-time PCR及Western blot檢測HIF-1α的mRNA及蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)sh-HIF-1α No.2干擾效率更高(圖1A、B)，隨后運(yùn)用sh-HIF-1α No.2用于下一步實(shí)驗(yàn)。

NNK干預(yù)能夠顯著促進(jìn)MIA PaCa-2和BxPC-3胰腺癌細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)(P<0.05)，同時(shí)運(yùn)用sh-HIF-1α No.2和β2腎上腺素受體抑制劑ICI 118551均能夠顯著降低NNK所誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)(P<0.05，圖1C、D)。說明β2腎上腺素受體可調(diào)控NNK誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)。

圖1HIF-1α干擾RNA以及ICI118551處理后對胰腺癌細(xì)胞株HIF-1α的影響

Fig.1 The effect of HIF-1α interference and ICI 118551 on the expression of HIF-1α in pancreatic cancer cells

A、B：檢測HIF-1α干擾效率；C、D：檢測NNK及sh-HIF-1α、ICI 118551對胰腺癌細(xì)胞株HIF-1α的影響。與對照組比較，*P<0.05；與NNK組比較，#P<0.05。

2.2β2腎上腺素受體通過HIF-1α調(diào)控NNK誘導(dǎo)的胰腺癌侵襲及增殖為明確β2腎上腺素受體是否能夠調(diào)控NNK所誘導(dǎo)的胰腺癌侵襲及增殖，我們運(yùn)用NNK干預(yù)促進(jìn)MIA PaCa-2和BxPC-3胰腺癌細(xì)胞。觀察到NNK能夠顯著增加MIA PaCa-2和BxPC-3兩株胰腺癌細(xì)胞的侵襲及增殖(P<0.05，表1、圖2)。

運(yùn)用sh-HIF-1α No.2干擾HIF-1α后，NNK所誘導(dǎo)的胰腺癌侵襲及增殖顯著被抑制(P<0.05)。說明HIF-1α介導(dǎo)NNK所誘導(dǎo)的胰腺癌侵襲及增殖(圖2)。運(yùn)用β2腎上腺素受體抑制劑ICI 118551也能夠顯著抑制NNK誘導(dǎo)的胰腺癌侵襲及增殖(P<0.05，表1，圖2)。結(jié)合ICI 118551能夠顯著抑制HIF-1α的表達(dá)，我們推測β2腎上腺素受體能夠通過HIF-1α調(diào)控NNK誘導(dǎo)的胰腺癌侵襲及增殖。

表1HIF-1α干擾RNA以及ICI118551處理后對胰腺癌細(xì)胞株侵襲及增殖的影響

與對照組比較，*P<0.05；與NNK組比較，#P<0.05。

圖2HIF-1α干擾RNA以及ICI118551處理后對胰腺癌細(xì)胞株侵襲及增殖的影響

Fig.2 The effect of HIF-1α interference and ICI 118551 on the invasion and proliferation of pancreatic cancer cells

A：Transwell檢測胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力；B：流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖。與對照組比較，*P<0.05；與NNK組比較，#P<0.05。

2.3β2腎上腺素受體通過HIF-1α調(diào)控NNK誘導(dǎo)的CyclinD1及VEGF的表達(dá)NNK能夠促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白(Cyclin D1)及血管生成因子(VEGF)的表達(dá)(P<0.05)，同時(shí)運(yùn)用sh-HIF-1α No.2干擾HIF-1α后，NNK所誘導(dǎo)的Cyclin D1及VEGF顯著被抑制，揭示了HIF-1α介導(dǎo)NNK所誘導(dǎo)的胰腺癌Cyclin D1及VEGF表達(dá)(P<0.05，圖3)。運(yùn)用β2腎上腺素受體抑制劑ICI 118551也能夠顯著抑制NNK誘導(dǎo)的胰腺癌Cyclin D1及VEGF表達(dá)(P<0.05，圖3)。結(jié)合ICI 118551能夠顯著抑制HIF-1α的表達(dá)，我們推測β2腎上腺素受體能夠通過HIF-1α調(diào)控NNK誘導(dǎo)的Cyclin D1及VEGF的表達(dá)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)論，運(yùn)用CoCl2提升MIA PaCa-2和BxPC-3的HIF-1α水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CoCl2+NNK+ICI 118551組的侵襲能力顯著高于NNK+ICI 118551組(P<0.05)，說明HIF-1α水平的升高能夠逆轉(zhuǎn)ICI 118551對NNK的抑制作用(圖4A)。同樣，CoCl2+NNK+ICI 118551組的Cyclin D1及VEGF表達(dá)量顯著高于NNK+ICI 118551組(P<0.05，圖4B、C)。更進(jìn)一步驗(yàn)證β2腎上腺素受體能夠通過HIF-1α調(diào)控NNK誘導(dǎo)的胰腺癌侵襲、增殖，以及Cyclin D1、VEGF的表達(dá)。

圖3HIF-1α干擾RNA以及ICI118551處理后對胰腺癌細(xì)胞株CyclinD1及VEGF的影響

Fig.3 The effect of HIF-1α interference and ICI 118551 on the expressions of Cyclin D1 and VEGF in pancreatic cancer cells

與對照組比較，*P<0.05；與NNK組比較，#P<0.05。

圖4CoCl2處理對胰腺癌細(xì)胞株侵襲能力及CyclinD1、VEGF表達(dá)的影響

Fig.4 The effect of CoCl2on the invasion and expressions of Cyclin D1 and VEGF in pancreatic cancer cells

A：Transwell檢測胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力；B：Western blot檢測HIF-1α、Cyclin D1及VEGF的表達(dá)；C：統(tǒng)計(jì)分析HIF-1α、Cyclin D1及VEGF的表達(dá)。*P<0.05。

3 討 論

NNK是一種煙草當(dāng)中特異的亞硝胺，具有較高的致癌特性。但NNK在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用報(bào)道較少。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)β2腎上腺素受體抑制劑能夠抑制NNK所誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞的增殖與侵襲。NNK能夠增加MIA PaCa-2和BxPC-3胰腺癌細(xì)胞內(nèi)的HIF-1α水平。既往的體外研究顯示，NNK能夠作為β2腎上腺素受體激動(dòng)劑促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展[6-7]。本研究顯示，β2腎上腺素受體能夠通過上調(diào)HIF-1α調(diào)控NNK誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞的侵襲及增殖，這揭示了β2腎上腺素受體調(diào)控NNK的一條新機(jī)制，這與既往HIF-1α能夠促進(jìn)胰腺癌、卵巢癌及胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移結(jié)論相一致[4-5,8]。同理，NNK所誘導(dǎo)的HIF-1α水平的增加可能能夠解釋吸煙促進(jìn)相關(guān)腫瘤進(jìn)展的機(jī)制。

以上這些發(fā)現(xiàn)均表明β2腎上腺素受體在吸煙相關(guān)的胰腺癌進(jìn)展機(jī)制中扮演重要角色。本研究結(jié)論顯示，β2腎上腺素受體在促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲、增殖的過程中伴隨著HIF-1α水平的上調(diào)。我們近期研究顯示，HIF-1α依賴的β2腎上腺素受體信號通路介導(dǎo)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞增殖[9]。這些發(fā)現(xiàn)可能能夠解釋抗氧化物所存在的一些抗腫瘤作用，因?yàn)楸姸辔墨I(xiàn)報(bào)道一些促癌信號均為HIF-1α的下游基因[10]。值得注意的是，運(yùn)用β2腎上腺素受體抑制劑能夠下調(diào)NNK誘導(dǎo)的HIF-1α的表達(dá)，同時(shí)抑制細(xì)胞的增殖和侵襲。而上調(diào)HIF-1α表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)β2腎上腺素受體抑制劑在胰腺癌中的作用。我們的研究提示，β2腎上腺素受體通過HIF-1α來介導(dǎo)NNK誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲。

β腎上腺素受體信號通路的激活與肺癌、結(jié)直腸癌及胰腺癌細(xì)胞增殖及侵襲相關(guān)。到目前為止，至少有3篇文獻(xiàn)報(bào)道提示運(yùn)用β腎上腺素受體信號通路抑制劑能夠降低癌癥的發(fā)生[11-14]。在這些研究中顯示，運(yùn)用心血管相關(guān)藥物β腎上腺素受體抑制劑，而不是利尿劑或鈣離子拮抗劑，能夠減少癌癥的發(fā)生。β腎上腺素受體高表達(dá)與胰腺癌低分化及高TNM分期相關(guān)，更加能夠確定β腎上腺素受體信號通路在胰腺癌中的重要作用。這些研究結(jié)果與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一起揭示了吸煙相關(guān)胰腺癌發(fā)展的新機(jī)制，并為胰腺癌的預(yù)防及治療提供了新的靶點(diǎn)。